Name: 从冷冻干燥的浆果粉中提取和纯化多酚用于治疗血管平滑肌细胞体外 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min
Description: 学习从冷冻干燥浆果粉中提取和纯化多酚的方法，使用乙醇超声提取和氯仿-乙酸乙酯纯化技术，获得高纯度多酚提取物用于血管平滑肌细胞体外研究，探索其心血管保护机制。

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本工作由美国心脏协会（14GRNT20180028）和佛罗里达州立大学研究与创造性活动委员会（COFRS）资助。

1. 试剂的准备
<ol>
	<li>通过将80 mL分子生物学级无水乙醇与20 mL细胞培养级无菌水混合，配制80%乙醇（100 mL）。</li>
	<li>为配制多酚提取物（10 mg/mL），称取10 mg CE或PE，于细胞培养罩内加入1 mL普通杜氏改良伊格尔培养基（DMEM），涡旋混匀。分装为每份200 µL，于-20 °C保存。</li>
	<li>配制裂解缓冲液。
	<ol>
		<li>加入5 mL 1 M HEPES储备液（终浓度50 mM，pH 7.4）、1 mL 5 M NaCl储备液（终浓度50 mM）、1 mL 0.5 M EDTA储备液（终浓度5 mM）、2 mL 0.5 M NaF储备液（终浓度10 mM）、286 µL 700 mM Na3VO4 储备液（终浓度2 mM）、5 mL 200 mM Na4P2O7 储备液（终浓度10 mM）以及5 mL用水配制的20% Triton-X-100储备液（终浓度1%），加水至总体积为100 mL。4 °C保存。</li>
		<li>每毫升裂解缓冲液中加入10 µL蛋白酶抑制剂混合物。在细胞准备裂解时新鲜添加。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>配制Laemmli上样缓冲液（4x）。
	<ol>
		<li>加入31.25 mL 2 M Tris储备液（pH 6.8）、100 mL甘油、50 mL用水配制的20%十二烷基硫酸钠（SDS）溶液以及50 mL β-巯基乙醇，加水至总体积250 mL。4 °C保存。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>为配制Tris缓冲盐水（TBS）缓冲液，称取3 g Tris（终浓度25 mM）、0.18 g KCl（终浓度2.5 mM）和8.76 g NaCl（终浓度150 mM），调节pH至7.4，加水至1 L。室温保存。</li>
	<li>为配制TBS-T，取997.5 mL TBS与2.5 mL用水配制的20% Triton-X-100溶液混合。室温保存。</li>
</ol>
2. 黑莓提取物的制备
<ol>
	<li>从冷冻干燥的浆果粉末中制备粗提物。
	<ol>
		<li>称取10 g冷冻干燥的黑莓粉（或5 g新鲜粉末）。若使用冷冻果实，应在开始提取前将其切成非常小的碎片。</li>
		<li>将果粉与100 mL 80%水合乙醇混合于1 L圆底锥形烧瓶中。</li>
		<li>在25 °C条件下，使用超声波清洗仪以42 kHz、135 W功率对混合物超声处理20 min，过程中不得中断。在避光条件下持续通入氮气进行超声处理。若使用冷冻果实，则将孵育时间延长至4 h。</li>
		<li>使用预冷的布氏漏斗在真空抽滤下通过#2滤纸过滤混合物。 
		注：此步骤结束后，滤纸上会残留样品，称为滤饼。</li>
		<li>用50 mL 100%乙醇冲洗滤饼。&#160;保留滤液，并将滤饼加入含有100 mL 80%水合乙醇的1 L圆底烧瓶中。</li>
		<li>对残渣重复提取过程（步骤2.1.2–2.1.4）。</li>
		<li>将两次所得滤液合并，并加入额外50 mL 80%水合乙醇至圆底烧瓶中。 
		注：最终体积约为300 mL。</li>
		<li>在62 °C、50 rpm条件下使用旋转蒸发仪蒸发溶剂。持续操作直至乙醇完全蒸发。 
		注：该过程约需45 min。</li>
		<li>将样品转移至50 mL离心管中。从管口上方通入氮气10 min以蒸发残留乙醇。 
		注：此步骤用于确保乙醇完全蒸发。此时样品体积约为20 mL。</li>
		<li>将样品在-80 °C下冷冻至少24 h。 
		注：此步骤有助于提高后续冷冻干燥的效率。</li>
		<li>在-50 °C下冷冻干燥样品约8 h。将样品在-20 °C下保存。 
		注：冷冻干燥机在-50 °C下于腔室内产生强真空以干燥样品，同时可保留大多数化合物（如多酚类物质）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>从粗提物中制备纯化的多酚提取物。
	<ol>
		<li>称取冷冻干燥后的提取样品。 
		注：此步骤中提取物体积约为10 mL。</li>
		<li>向粗提物中加入两倍体积（约20 mL）的氯仿，并在搅拌台上搅拌5 min&#160;。</li>
		<li>将混合物倒入分液漏斗中，在室温下静置1 h，使粗提物分层以获得纯化组分。 
		注：此步骤将形成两相体系。</li>
		<li>弃去分液漏斗中的下层（氯仿相），收集上层水相至洁净烧杯中。</li>
		<li>向水相中加入两倍体积的乙酸乙酯，并使用磁力搅拌子在室温下搅拌混合物5 min。</li>
		<li>使用预冷的布氏漏斗在真空抽滤下通过#2滤纸过滤混合物。</li>
		<li>收集滤液并转移至圆底烧瓶，用于后续旋转蒸发。</li>
		<li>设置旋转蒸发仪为62 °C、50 rpm，蒸发乙酸乙酯约30 min。</li>
		<li>在-50 °C下冷冻干燥样品约8 h。将样品转移至50 mL离心管中，并在-20 °C下保存。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 用浆果提取物处理VSMCs
<ol>
	<li>血管平滑肌细胞（VSMCs）培养。
	<ol>
		<li>通过酶消化法从 Sprague-Dawley 大鼠胸主动脉中分离 VSMCs，方法如前所述29。VSMCs 的培养方法如文献所述29。</li>
		<li>使用含 1 g/L 葡萄糖的 DMEM 培养基，并添加 10% 胎牛血清（FBS）、100 U/mL 青霉素、100 mg/mL 链霉素和 2 mM L-谷氨酰胺，配制 VSMCs 培养用完全培养基。将完全培养基储存于 4 °C。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用多酚提取物孵育 VSMCs。
	<ol>
		<li>传代 VSMCs 时，弃去培养基，用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞两次。加入 4 mL PBS 和 2 mL 0.25% 胰蛋白酶 EDTA。将细胞置于含 CO2 的培养箱中，37 °C 孵育 5 min。
		<ol>
			<li>收集细胞，转移至 15 mL 离心管中，与 2 mL 完全培养基混合，1,100 × g 离心 5 min。弃去上清液，用 1 mL PBS 重悬细胞沉淀，用血细胞计数板计数细胞。</li>
			<li>以每孔 50,000 个 VSMCs 接种于 6 孔板中，使用含 10% FBS 的完全培养基培养至细胞融合度达 90%（约 3 d）。将 VSMCs 置于 37 °C、5% CO2、湿度饱和的培养箱中维持培养。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>使用含 1 g/L 葡萄糖、100 U/mL 青霉素、100 mg/mL 链霉素、2 mM L-谷氨酰胺和 0.5% FBS 的 DMEM 培养基配制处理用培养基。处理用培养基储存于 4 °C。 
		注：多酚提取物和 Ang II 直接加入该培养基中作用于细胞。</li>
		<li>通过将 10 mg 提取物溶解于 1 mL 基础 DMEM 培养基中，配制 10 mg/mL 的多酚粗提物（CE）或纯化提取物（PE）储备液。将储备液分装为 200 µL 每份，于 -20 °C 保存。</li>
		<li>用含 0.5% FBS 的 2 mL 处理用培养基孵育 VSMCs，并加入 CE 或 PE 提取物，使其终浓度为 50–500 µg/mL。每隔 24 h 更换一次培养基，并补充新鲜的多酚提取物。处理持续 3 d。</li>
		<li>若需使用 Ang II 或其他激素与生长因子进行处理，先用含 0.5% FBS 的处理用培养基对细胞进行至少 24 h 的饥饿处理，然后加入 Ang II（100 nM）。 
		注：建议在加入 Ang II 前，使用含 0.5% FBS 的处理用培养基，在有或无 CE 和 PE 的条件下进行预孵育。
		<ol>
			<li>饥饿处理 24 h 后，加入 100 nM Ang II。每隔 24 h 更换一次处理用培养基，并补充新鲜的 CE、PE 或 Ang II，持续处理 3 d。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>细胞样品制备。
	<ol>
		<li>用预冷的 PBS 洗涤处理后的细胞两次，然后在冰上用 200 µL 裂解缓冲液裂解细胞。</li>
		<li>使用细胞刮刀收集细胞裂解物，转移至 1.5 mL 微量离心管中。将总细胞裂解物在冰上孵育 20 min，每 5 min 涡旋一次。</li>
		<li>对细胞提取物进行超声处理，每次 10 s，功率 125 W，共 3 次，每次间隔 2 s。整个超声过程中保持样品处于冰上。</li>
		<li>使用蛋白检测试剂在 595 nm 波长下测定蛋白浓度。</li>
		<li>将样品于 -20 °C 保存，用于后续 Western blot 分析。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Western blot。
	<ol>
		<li>取对照组（未处理）及多酚或 Ang II 处理组的蛋白样品，每组取等量蛋白（约 50 µg），用裂解缓冲液调整总体积至最多 50 µL。加入 16 µL 4× Laemmli 上样缓冲液，75 °C 加热 5 min。</li>
		<li>将样品在 10% SDS-PAGE 凝胶中电泳分离，随后在半干转系统中以 10 V 电压转移 75 min 至 PVDF 膜，用于特异性抗体的 Western blot 分析。</li>
		<li>用含 2% 脱脂奶粉的 TBS-T 缓冲液（TBS 含 0.05% Triton-X100）封闭膜 20 min。</li>
		<li>用 TBS 洗涤膜至少三次（每次 5 min），去除脱脂奶粉，然后在室温孵育 1 h 或 4 °C 过夜，加入一抗。</li>
		<li>用 TBS-T 洗涤膜三次，每次 10 min，然后加入 HRP 标记的二抗，孵育 45 min。</li>
		<li>用 TBS-T 洗涤膜三次，每次 10 min，使用增强化学发光法（ECL）显影。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

浆果中分离出的多酚含有不同的组分。本文所述的乙醇提取方案有助于鉴定BL粗提和纯化多酚提取物中酚酸和黄酮类化合物的不同含量。表1）。CE 富含没食子酸、阿魏酸、4-O-咖啡酰奎宁酸和 5-O-咖啡酰奎宁酸。纯化过程未显著改变没食子酸和对香豆酸的含量，但提高了 3-O-咖啡酰奎宁酸的化学位移范围为170.5–235.3 ppm，槲皮素为24.5–95 ppm。相比之下，阿魏酸和芦丁在CE纯化过程中丢失。
用50 - 500 µg/mL的CE和PE处理VSMCs显示，这两种提取物均能有效降低ERK1/2的基础磷酸化水平。然而，PE在较低浓度下对该激酶活性的下调作用更强：PE的有效浓度为100 µg/mL，而CE则需要400 - 500 µg/mL。该结果可能反映了PE中3-O-咖啡酰奎宁酸或槲皮素的含量较高。需要在细胞培养体系中使用单一的酚类化合物，以鉴定出导致ERK1/2磷酸化下调的具体化合物。
由从BL、RB和BRB中分离纯化的多酚引起的Akt、ERK1/2和...

多酚是一类化学结构中至少含有一个酚环的化合物，在植物界中广泛存在1。人类在数千年间出于药用目的食用植物，却并未意识到这类化合物的存在2。许多水果和蔬菜含有共有的多酚类化合物，尽管其含量各不相同，包括黄酮类、芪类和酚酸类3。尽管多酚常与颜色鲜艳的水果和蔬菜相关联，但这并不完全准确。例如，叶黄素和黄嘌呤存在于颜色并不鲜艳的蔬菜中，如洋葱和大蒜，这些植物属于葱科，具有多种健康益处4。除了与多种健康益处相关5，多酚还能保护植物免受昆虫侵害和紫外线辐射2。多酚在人类饮食中普遍存在，被认为具有强效抗氧化作用，因其能够清除活性氧（ROS）6,7,8。它们还具有抗炎9、抗菌10、抗高血压11和抗癌12,13的特性。
流行病学研究表明，黄酮类化合物的摄入量与心血管疾病（CVD）发病率呈负相关16,17 死亡率14,15浆果在美国被广泛食用，富含多酚类物质，包括黄酮类化合物。例如，血脂异常患者每日饮用300 mL黑莓（BL）汁，连续八周后，其收缩压显著降低。18. Jeong 等19 有研究报道，每天摄入2.5克黑莓（BRB）提取物的前高血压男性和女性，其24小时及夜间血压低于摄入安慰剂者。树莓（RB）可降低自发性高血压大鼠的血压，同时增加超氧化物歧化酶（SOD）的表达水平20最近研究表明，BL、RB和BRB可降低血管紧张素II（Ang II）在血管平滑肌细胞（VSMCs）中诱导的活性氧（ROS）水平和细胞衰老。21此外，BL提取物中的花青素组分降低了脂多糖（LPS）刺激的J774细胞中诱导型一氧化氮合酶（iNOS）的表达，并抑制了核因子κB（NF-κB）和细胞外信号调节激酶（ERK）的活性。22. BRB提取物降低了NF-κB的活化及环氧合酶2（COX-2）的表达 体外 23改善了高脂饮食小鼠的血脂谱，并抑制了动脉粥样硬化病变的形成24花青素被认为是浆果中含量最丰富的黄酮类化合物，可通过降低脂多糖（LPS）刺激的RAW 264.7巨噬细胞中肿瘤坏死因子α（TNF-α）的产生，调节炎症反应25 并减少血管平滑肌细胞的增殖和迁移26.
由于人们对多酚在人类健康与疾病中作用的研究兴趣日益增加，优化提取方法显得尤为重要。溶剂提取法因其成本低廉且易于重复，被广泛用于此目的。本研究采用乙醇进行溶剂提取，并结合超声辅助提取法，该方法改编自Kim和Lee的研究27采用氯仿和乙酸乙酯对粗提物（CE）进行纯化和分级分离，以获得经 Queires 改良方法得到的纯化提取物（PE）组分 等28此外，比较了BL粗提多酚与纯化多酚提取物在降低ERK1/2基础磷酸化水平方面的功效，并提供了纯化BL多酚提取物对Ang II诱导的VSMCs信号转导抑制作用的代表性结果。

<table><tbody><tr><td>血管紧张素II</td><td>Sigma-Aldrich, Inc.</td><td>A9525-10MG</td><td>VSMC处理</td></tr><tr><td>&amp;beta;-肌动蛋白</td><td>Sigma-Aldrich, Inc.</td><td>A2228</td><td>一抗（1:5000）</td></tr><tr><td>黑莓果实</td><td>Mercer Foods</td><td></td><td>冻干黑莓粉</td></tr><tr><td>过氧化氢酶&amp;nbsp;</td><td>Calbiochem</td><td>219010</td><td>一抗（1:1000）</td></tr><tr><td>氯仿</td><td>Biotech Grd, Inc.</td><td>97064-678</td><td>纯化多酚提取物的制备</td></tr><tr><td>杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）</td><td>Mediatech, Inc.</td><td>10-014-CV</td><td>VSMC培养</td></tr><tr><td>乙醇（分子生物学级无水乙醇）</td><td>Sigma-Aldrich, Inc.</td><td>E7023-500ML</td><td>多酚提取物的制备&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>乙酸乙酯</td><td>Sigma-Aldrich, Inc.</td><td>439169</td><td>纯化多酚提取物的制备</td></tr><tr><td>ERK1/2</td><td>Cell Signaling Technology, Inc.</td><td>9102S</td><td>一抗（1:500）</td></tr><tr><td>EDTA，500 mM，pH 8.0</td><td>Teknova, Inc.</td><td>E0306</td><td>裂解缓冲液</td></tr><tr><td>冷冻干燥机</td><td>Labconco</td><td>VirTis Benchtop K</td><td>多酚提取物的制备</td></tr><tr><td>胎牛血清（FBS）</td><td>Seradigm</td><td>1400-500</td><td>细胞培养</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich, Inc.</td><td>H3375</td><td>裂解缓冲液&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>EMD Millipore, Inc.</td><td>7760</td><td>裂解缓冲液</td></tr><tr><td>NaF</td><td>J.T.Baker, Inc.</td><td>3688-01&amp;nbsp;</td><td>裂解缓冲液</td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;VO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich, Inc.</td><td>450243</td><td>裂解缓冲液</td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;P&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O&lt;sub&gt;7&lt;/sub&gt;，十水合物</td><td>Sigma-Aldrich, Inc.</td><td>S-9515</td><td>裂解缓冲液</td></tr><tr><td>磷酸化ERK1/2&amp;nbsp;</td><td>Cell Signaling Technology, Inc.</td><td>9101S</td><td>一抗（1:1000）</td></tr><tr><td>蛋白酶抑制剂混合物</td><td>Sigma-Aldrich, Inc.</td><td>P8340-5ml</td><td>裂解缓冲液</td></tr><tr><td>蛋白测定染料试剂</td><td>Bio-Rad Laboratories, Inc.</td><td>500-0006</td><td>蛋白质浓度测定</td></tr><tr><td>PVDF转印膜</td><td>Thermo Scientific, Inc.</td><td>88518</td><td>Western blot</td></tr><tr><td>旋转蒸发仪</td><td>Buchi Labortechnik</td><td>Rotavapor&lt;br/&gt; R3000</td><td>多酚提取物的制备</td></tr><tr><td>无菌水</td><td>Mediatech, Inc.</td><td>25-055-CV</td><td>多酚提取物的制备</td></tr><tr><td>超声破碎仪</td><td>QSonica, LLC</td><td>Q125</td><td>细胞提取物的制备</td></tr><tr><td>SOD2</td><td>Enzo Life Sciences, Inc.</td><td>ADI-SOD-110-F</td><td>一抗（1:1000）</td></tr><tr><td>Triton-X-100</td><td>Sigma-Aldrich, Inc.</td><td>X100</td><td>Western blot</td></tr><tr><td>Whatman #2 滤纸</td><td>GE Healthcare, Inc.</td><td>28317-241</td><td>多酚提取物的制备</td></tr></tbody></table>

从冻干浆果粉中提取和纯化多酚用于血管平滑肌细胞处理 体外

Extraction and Purification of Polyphenols from Freeze-dried Berry Powder for the Treatment of Vascular Smooth Muscle Cells In Vitro

流行病学研究表明，在美国和欧洲，摄入较多类黄酮与心血管疾病（CVD）导致的死亡率降低相关。浆果在美国被广泛食用，且富含多酚类物质。研究表明，多酚可与多种分子靶点相互作用，并发挥多种有益的生物学功能，包括抗氧化、抗炎和心脏保护作用。从黑莓（BL）、覆盆子（RB）和黑覆盆子（BRB）中分离的多酚可减轻血管紧张素II（Ang II）诱导的氧化应激和细胞衰老。本研究详细描述了从冷冻干燥浆果中制备多酚提取物的实验方案。采用80%水-乙醇溶液并结合超声辅助提取法，从冷冻干燥的浆果粉末中提取多酚。粗提物进一步分别使用氯仿和乙酸乙酯进行纯化和分级分离。粗提物和纯化提取物对培养的血管平滑肌细胞（VSMCs）的作用均进行了检测。

先前已证实，从 BL、RB 和 BRB 中分离得到的多酚提取物能够减轻血管平滑肌细胞（VSMCs）在血管紧张素 II（Ang II）作用下的衰老21。研究表明，这些纯化的多酚提取物通过降低 Akt、p38 丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）和 ERK1/2 的磷酸化水平来调节 Ang II 信号通路。BL 通过降低 NADPH 氧化酶（Nox）1 的表达来抑制细胞衰老，Nox1 是一种产生超氧阴离子的酶，可被 Ang II 显著上调。相比之下，RB 和 BRB 通过一种不依赖 Nox1 的机制抑制衰老，因为它们能够上调抗氧化酶 SOD1、SOD2 和谷胱甘肽过氧化物酶 1（GPx-1）的表达。BL 无法提高 SOD2 的表达水平，且这些提取物均未能缓解 Ang II 引起的过氧化氢酶（catalase）表达下调21。本研究重点关注 BL，旨在确定其对 SOD2 和过氧化氢酶表达无影响的现象是否可归因于纯化过程中多酚化合物的损失，或提取物中某种特定多酚化合物浓度不足。将 VSMCs ...

本研究详细阐述了一种从冷冻干燥的浆果粉末中制备富含多酚提取物的逐步方法。此外，还全面描述了如何在血管平滑肌细胞（VSMCs）培养中，于肽类激素血管紧张素II（Ang II）存在条件下使用这些富含多酚的提取物。

流行病学研究表明，黄酮类化合物摄入量的增加与心血管疾病（CVD）导致的死亡率下降相关。

本实验方案的总体目标是提供一种简单且可重复的植物多酚提取与纯化方法，该方法未来可用于细胞处理。该方法有助于解答关于食物在人类健康与疾病中功能作用的关键问题。这种基于乙醇并辅以超声波的多酚提取方法操作简便、可重复性强，能够获得较高的多酚得率。使用氯仿可去除糖类、脂肪酸、蛋白质及其他分子，而乙酸乙酯则可用于多酚的分级分离。由此获得的浓缩多酚提取物可用于体外和体内实验，以研究多酚对各种组织（包括心血管系统）的作用及其作用机制，如本文所述。开始此操作前，请按照文本方案中的说明准备试剂。接着，称取10克冻干黑莓粉。将果粉加入含有100毫升80%水合乙醇的1升圆底烧瓶中。将烧瓶置于25°C的超声波清洗器中。 在避光条件下持续通入氮气，将混合物在 42 千赫兹和 135 瓦功率下超声处理 20 分钟。随后，使用预冷的布氏漏斗配合真空抽滤，通过二号滤纸过滤该混合物。再用 50 毫升 100% 乙醇冲洗滤饼。将滤液保留，并将滤饼加入含有100毫升80%水性乙醇的1升圆底烧瓶中。然后通过超声处理、过滤和洗涤混合物，重复提取过程。将两次所得滤液合并至含有50毫升80%水性乙醇的圆底烧瓶中。在62摄氏度、50 rpm条件下，使用旋转蒸发仪蒸发溶剂。持续操作直至乙醇完全蒸发完毕。随后，将样品转移至50毫升锥形离心管中。在试管顶部注入氮气10分钟，以蒸发残留的乙醇。将样品在-80摄氏度下冷冻至少24小时。然后，在-50摄氏度下冷冻干燥样品约8小时。将样品储存于负20摄氏度，直至准备使用。开始时，称取冻干提取的样品。向含有样品的100毫升烧杯中加入约20毫升氯仿。使用磁力搅拌器将溶液混合五分钟。然后将混合物倒入分液漏斗中。在室温下静置粗提物，使其分层一小时。此后，弃去下层，收集上层水相至一个洁净的烧杯中。向烧杯中加入两倍体积的乙酸乙酯。使用磁力搅拌子，在室温下搅拌混合物五分钟。接下来，使用预冷的布氏漏斗和真空抽滤装置，将混合物通过2号滤纸过滤。将滤液转移至圆底烧瓶中。在62摄氏度、50 rpm条件下，用旋转蒸发仪蒸发乙酸乙酯30分钟。此后，在零下50摄氏度条件下冻干样品8小时。将样品转移至50毫升锥形管中，并在零下20摄氏度保存，直至使用。培养血管平滑肌细胞后，弃去培养基，并用磷酸盐缓冲液洗涤细胞两次。然后加入 4 mL PBS 和 2 mL 0.25%胰蛋白酶-EDTA。在 37°C 的二氧化碳培养箱中孵育 5 分钟。孵育结束后，将细胞转移至含有 2 mL 完全培养基的 15 mL 离心管中。在 1,100 ×g 条件下离心 5 分钟。弃去上清液，并用 1 毫升 PBS 重悬细胞沉淀。使用血细胞计数板对细胞进行计数。接下来，在六孔培养板中，每孔接种 50,000 个细胞。使用含有 10% 胎牛血清的完全培养基将细胞培养至 90% 汇合度。根据文本方案配制处理用培养基，并于 4°C 保存。然后，将10毫克粗提物或纯化提取物加入1毫升普通DMEM培养基中，配制浓度为10毫克/毫升的储备液。将储备液分装为200微升每份，于-20摄氏度保存。之后，向细胞中加入2毫升处理用培养基，其中含0.5%胎牛血清及所需浓度的储备液。在37摄氏度、含5% CO2的湿润培养箱中孵育三天。随后，若需用激素或生长因子处理，则更换为含0.5%胎牛血清的处理培养基，饥饿细胞至少24小时。饥饿结束后，加入目标激素，并每24小时更换一次处理培养基，持续三天，具体操作详见文中的实验方案。接下来，用预冷的 PBS 洗涤处理后的细胞两次。在冰上加入 200 µL 裂解缓冲液裂解细胞。使用细胞刮刀收集细胞裂解液，并转移至 1.5 mL 微量离心管中。将收集的裂解液置于冰上孵育20分钟，每5分钟涡旋振荡一次。随后，以125瓦功率对细胞提取物进行超声处理，每次10秒，共3次，每次之间间隔2秒。使用蛋白检测试剂在595纳米波长下测定蛋白浓度。将50微克蛋白质与裂解缓冲液混合，使总体积最多为50微升。加入16微升4x Laemmli上样缓冲液。然后在75摄氏度下加热样品5分钟。在10% SDS-PAGE凝胶中分离样品，并转移至PVDF膜，用于特异性抗体的Western印迹分析。本研究采用乙醇提取法，以鉴定粗提和纯化多酚黑莓提取物中酚酸和黄酮类化合物的不同含量水平。尽管纯化过程未显著改变没食子酸或对香豆酸的含量，但3-O-咖啡酰奎宁酸的含量从170.5 ppm增加至235.3 ppm，槲皮素的含量从24.5 ppm增加至95 ppm。相比之下，阿魏酸和芦丁在粗提物的纯化过程中丢失。提取后，将血管平滑肌细胞在含有0.5%胎牛血清的培养基中，分别与50至500微克/毫升的粗提或纯化黑莓提取物共同孵育三天。两种提取物均显示出可有效降低ERK的基础磷酸化水平。然而，纯化提取物在100微克/毫升时即表现出显著的下调作用，而粗提物则需要400至500微克/毫升的浓度。这表明纯化提取物在抑制ERK磷酸化方面具有更高的效率，可能是由于其含有更高浓度的多酚类化合物。随后，将VSMCs用200微克/毫升的纯化黑莓提取物处理24小时，再加入100纳米摩尔的血管紧张素II。如先前报道所示，黑莓多酚提取物可减少血管紧张素II诱导的ERK磷酸化，但对过氧化氢酶或SOD2的表达无明显影响。一旦掌握，多酚提取可在数小时内完成。该技术可帮助功能食品领域的研究人员探索多酚在体外及动物模型中的作用。观看本视频后，您应能够从水果和蔬菜中提取并纯化多酚，并利用多酚提取物处理培养细胞。我们已采用此方法证明了黑莓多酚在防止主动脉血管平滑肌细胞衰老中的作用。鉴于血管系统的衰老是心血管疾病发生的主要危险因素，这一发现具有重要意义。

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从冷冻干燥的浆果粉中提取和纯化多酚用于治疗血管平滑肌细胞<em&gt;体外</em

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