用于建立斑马鱼急性肾损伤模型的精确细胞消融方法

本实验的总体目标是通过靶向消融斑马鱼肾脏上皮细胞，建立肾单位损伤与修复的模型。该方法有助于回答器官特别是肾脏再生领域中的一些关键问题，例如：再生过程中涉及的主要细胞过程是什么？存活组织的可塑性程度如何？以及其他诸多问题。

该技术的主要优势在于能够对损伤进行精确的空间和时间控制，同时可调节损伤程度。该技术的应用前景涵盖急性肾损伤的治疗或诊断，因为它能够对参与肾细胞损伤与再生的细胞和分子过程进行精确的空间和时间评估。首先，通过交配肾脏表达GFP荧光的斑马鱼以获得胚胎。

受精后24小时内，将胚胎置于28.5°C的E3溶液中培养。随后用含0.003% PTU的E3溶液替换原有E3培养基，将胚胎放回培养箱继续培养六天或更长时间，直至肾脏发育成熟。

为了对斑马鱼进行活体成像，准备含0.2毫克/毫升三卡因溶液的1%至2%低熔点琼脂糖。使用塑料或玻璃移液管将胚胎转移至该溶液前，需确保琼脂糖三卡因溶液已冷却。接着，用移液管吸取含有幼虫的琼脂糖，并将其滴加至35毫米培养皿中央。

迅速将含有斑马鱼的琼脂糖铺开，使其均匀覆盖培养皿底部。然后使用玻璃探针调整幼鱼的位置，以便进行光消融和成像，使目标肾脏节段垂直于光束路径，而对侧节段则远离激光束。斑马鱼的定位对于后续的激光消融步骤至关重要。

建议采用良好的操作技术，以确保幼虫在琼脂糖中保持垂直位置。盖上培养皿以尽量减少蒸发，并让琼脂糖凝固约15分钟。根据文本方案设置共聚焦显微镜为直立配置后，将含有幼虫的培养皿置于载玻片上，并使用橡皮泥固定其位置。

接下来，将可滑动的培养皿放置在显微镜载物台上。然后加入三毫升成像溶液。在浸水物镜下，缓慢升高载物台，确保物镜略微倾斜，以防止空气进入光路中。

当透镜以一定角度接触溶液后，将其居中，使其位于胚胎的视野范围内。现在使用荧光光源找到感兴趣的节段，然后聚焦于表浅分支，以对其进行损伤。选择表浅分支是为了最大限度减少光散射。

在显微镜软件中，进入查看、采集控制、C2plus紧凑型图形用户界面。将像素驻留时间设置为1.9微秒，帧大小设置为512×512像素，针孔大小设置为90微米。将405纳米激光强度设为零，488纳米激光强度设为较低值。

使用488纳米激光时，点击软件界面中的扫描按钮。找到与光束路径垂直且GFP荧光清晰可见的目标区域。确定该区域后，进入ROI功能，绘制椭圆形ROI，以划定感兴趣区域。

接下来，导航至“视图”→“采集控制”→“C2plus 扫描区域”，选择“条带扫描区域”，该界面内将出现一个矩形掩膜。使用光标手动定义一个矩形扫描区域，以覆盖目标激光消融的片段。在掩膜区域内单击右键，确认选择。

仅使用488纳米激光激活GFP，同时监测绿色通道，开始时间测量。确保488激光的强度相对较低。通过选择“测量”→“时间测量”，测定感兴趣区域内GFP的平均强度。

使用图表或数据选项卡来监测 ROI 内的平均荧光强度水平。使用紫色激光时，将激光功率控制滑块完全向右滑动至 100%，以诱导肾细胞损伤。在图表选项卡中观察折线图，或使用数据选项卡查看 GFP 荧光强度的数值，并等待其下降至预期水平。

例如，达到基线水平的50%。一旦椭圆ROI内的GFP荧光强度下降至预期水平，立即在软件控制面板中将紫激光的强度通过激光功率滑块向左滑动至零。最后，重新获取GFP荧光的新基线。

如图所示，在暴露于405纳米激光照射后，GFP荧光逐个细胞逐渐消失。直至220分钟时，整个消融区域的细胞完全失去GFP荧光信号。这是由于细胞死亡所致，而非GFP表达下调，这一点可通过失去GFP荧光信号的细胞中出现红色荧光的碘化丙啶阳性细胞核得以证实。

这些图像表明，通过改变初始曝光强度，可以调控损伤程度以及上皮组织对损伤的反应。当初始GFP光漂白程度为10%至20%时，损伤后五小时几乎未观察到GFP阳性信号的减少；50%和60%的光漂白则导致五小时时GFP信号完全消失；而30%和40%的光漂白产生中间结果，约在35%光漂白程度时可观察到约50%的细胞死亡。

这一点通过碘化丙啶染色得到证实：光漂白20%时，在消融后100分钟几乎无碘化丙啶染色信号；而光漂白50%时，消融后的上皮组织在60分钟后持续呈现碘化丙啶阳性。光漂白30%和40%则导致碘化丙啶的掺入程度处于中间状态。

一旦掌握，若操作得当，该技术可在30分钟内完成。切记，使用激光和化学试剂可能存在极高危险性，操作过程中必须采取预防措施，例如避免直视激光束，以及在接触化学试剂时佩戴手套。在完成该操作后，可进一步采用其他方法，如延时显微成像、免疫荧光染色等，以回答更多关于肾脏损伤与修复在细胞和分子水平上的科学问题。

该技术建立后，为肾脏再生领域的研究人员提供了重要支持，可用于探索斑马鱼在损伤后集体细胞迁移与肾脏修复的作用。观看本视频后，您应能够充分掌握如何利用共聚焦显微镜对GPF转基因斑马鱼幼虫和胚胎中的特定肾段进行损伤操作。