Name: 高分辨率成像和芽殖酵母个人星体微管动力学分析 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 23 s
Description: 学习利用高分辨率共聚焦显微镜在活酵母细胞中测量星体微管动力学的方法。该方案通过GFP标记微管蛋白实现实时成像，为研究微管调控机制提供可靠工具。

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我们感谢北卡罗来纳大学的 Kerry Bloom、美国国家癌症研究所（NCI）的 Kyung Lee、科罗拉多州立大学的 Steven Markus 以及海德堡大学的 Elmar Schiebel 分享了多种 FP-TUB1 质粒。我们感谢明尼苏达大学的 Melissa Gardner 对我们进行载玻片腔室制备方法的培训。本研究工作得到了美国国立卫生研究院（NIH）资助 R01GM112893-01A1（资助 J.K.M.）和 T32GM008730（资助 C.E.）的支持。

1. 准备-LEU缺陷型平板
<ol>
	<li>向一个2 L的烧瓶中加入800 mL无菌去离子水（DiH2O）。加入26.71 g dropout基础培养基（DOB）粉末、0.69 g CSM-Leu和20 g琼脂。用磁力搅拌子混匀，再用DiH2O定容至1 L。</li>
	<li>在121 °C、19 psi条件下高压灭菌30分钟。</li>
	<li>将烧瓶从高压灭菌器中取出，在轻轻搅拌下冷却至约65 °C。</li>
	<li>将培养基以每皿30 mL分装至直径100 mm的培养皿中。室温静置36–48小时后，于4 °C保存。</li>
</ol>
2. 整合GFP-Tub1以实现GFP标记微管蛋白的组成型表达
<ol>
	<li>将单链DNA（ssDNA）储备液（浓度为10 mg/mL）煮沸3分钟。</li>
	<li>取2 µL煮沸后的ssDNA与400 ng纯化的GFP-Tub1质粒DNA混合11。 
	注意：有多种质粒可用于酵母中微管的稳定荧光标记，这些质粒使用不同的荧光蛋白和可筛选标记。部分替代方案在讨论部分有所描述。</li>
	<li>将DNA混合物加入50 µL感受态酵母细胞中。 
	注意：使用山梨醇溶液（SORB；100 mM LiOAc、10 mM Tris-HCl pH 8、1 mM EDTA pH 8和1 M山梨醇，用稀乙酸调节至pH 8）制备感受态酵母细胞。有关制备感受态酵母细胞的详细说明，请参见参考文献12。</li>
	<li>充分涡旋振荡。</li>
	<li>向DNA-细胞混合物中加入6倍总体积的聚乙二醇（PEG）溶液（100 mM LiOAc、10 mM Tris-HCl pH 8、1 mM EDTA/NaOH pH 8和40% PEG3350）。</li>
	<li>充分涡旋振荡。</li>
	<li>在30 °C下轻轻振荡孵育至少1小时。</li>
	<li>加入二甲基亚砜（DMSO）至总体积的10%，并涡旋振荡。</li>
	<li>在42 °C下孵育15分钟。</li>
	<li>以2,500 × g离心5分钟。</li>
	<li>弃去上清液，将细胞重悬于100 µL去离子水（DiH2O）中。</li>
	<li>将细胞涂布于-Leu缺陷型培养板上。 
	注意：GFP-Tub1载体含有亮氨酸营养缺陷型标记，而其他载体可能使用不同的筛选标记。所用缺陷型培养基应与载体的营养缺陷型标记相对应。</li>
	<li>将转化后的细胞在30 °C下培养3–5天。</li>
	<li>使用灭菌牙签挑取单个转化克隆，在新的-Leu缺陷型平板上重新划线。将平板在30 °C下过夜培养。</li>
	<li>通过荧光显微镜观察，对每个转化子进行GFP信号的目视筛选：取步骤2.14中单个菌落的约1 µL细胞，悬浮于洁净载玻片上的2 µL水中，盖上盖玻片后观察。
	<ol>
		<li>用488 nm激发光照射转化子，检测是否存在GFP信号。 
		注意：此步骤可使用转盘共聚焦显微镜，但配备100X物镜并具有合适GFP成像光学组件的宽场显微镜亦可满足要求。应剔除未见GFP标记微管或荧光异常强烈的细胞。此后，酵母菌株即可用于成像培养。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 培养液体酵母菌液
<ol>
	<li>从平板上单个菌落中接种约 1 µL 酵母细胞至 3 mL 合成完全培养基中。在 30 °C、250 rpm 振荡条件下培养过夜。</li>
	<li>次日将饱和培养物用培养基稀释至 OD600 为 &#60;0.1。将稀释后的培养物放回 30 °C 摇床中继续培养 3–4 小时，或直至 OD600 达到 0.4 至 0.8 之间，此时细胞已处于适合加载至成像腔室的状态。</li>
</ol>
4. 准备流式细胞仪载玻片
<ol>
	<li>将一张石蜡膜裁剪成 4 英寸宽、7 英寸长的片状。</li>
	<li>将标准显微镜载玻片沿其长度方向放置于石蜡膜 4 英寸宽的一侧，将膜围绕载玻片缠绕 3–4 圈，使载玻片表面覆盖 3–4 层石蜡膜。轻轻按压各层以确保形成适当的密封；这有助于后续切割。注意不要用力过猛或导致膜起皱。</li>
	<li>使用干净的美工刀沿载玻片外缘裁切石蜡膜。可使用另一张载玻片作为直边辅助切割。</li>
	<li>将工作载玻片上多余的膜剥离并丢弃。剩余的膜堆叠部分将覆盖载玻片的一个面，用于构建成像室之间的壁。</li>
	<li>以第二张载玻片作为直边，沿载玻片长轴方向将叠好的膜层切割成约十条带状物，每条宽约 2–4 mm。</li>
	<li>沿载玻片短轴方向，垂直于第 4.5 步中的切口，切割叠层石蜡膜，制备出宽 2–4 mm、长 23–24 mm、厚 3–4 层的条状膜。</li>
	<li>用刀片以 45° 角剥离已切割的条状膜。使用镊子将切割好的膜条均匀分布在洁净的显微镜载玻片上，以形成所需数量的腔室。一张载玻片上最多可制作 3 个腔室（每个由 4 条石蜡膜条构成）。</li>
	<li>将一片盖玻片置于膜条上方，并用镊子将其调整至合适位置。</li>
	<li>将制备好的载玻片（盖玻片朝上）放置于设定温度约为 95 °C 的加热板上（此温度通常对应大多数加热板的低至中档设置）。加热至膜条变为半透明（约 3 分钟），然后用镊子轻轻按压盖玻片，使载玻片与盖玻片密封结合。 
	注意：仅应在盖玻片正对石蜡膜条的区域施加压力，因为在腔室上方区域划伤可能降低成像质量。注意避免过度加热载玻片；挥发的膜材料会在腔室内表面形成一层疏水性薄膜，阻碍细胞贴附。</li>
	<li>用镊子将载玻片从加热板上取下（载玻片温度较高），并将其盖玻片朝上放置冷却；随着冷却，膜将恢复为白色不透明状态。 
	注意：至此，载玻片已准备好用于加载培养的酵母细胞。可预先制备额外的载玻片，并在洁净干燥的环境中长期保存。</li>
</ol>
5. 将酵母细胞加载至制备好的流动腔载玻片中
<ol>
	<li>解冻一份冷冻的Concanavalin A（2 mg/mL，溶于无菌DiH₂O）200 µL等分试样2O</li>
	<li>向制备好的载玻片每个腔室的一端开口处加入约100 µL解冻的刀豆蛋白A，加入量以充满腔室为宜。此步骤中，刀豆蛋白A将通过毛细作用被吸入并充满整个腔室。</li>
	<li>将载玻片倒扣在两个微量离心管架或笔之间，静置5分钟，使刀豆蛋白A（Concanavalin A）黏附于盖玻片上（即， 腔室）。</li>
	<li>将玻片恢复至盖玻片朝上的位置。用合成完全培养基洗涤腔室，洗涤体积为腔室体积的2倍（由上述步骤5.2确定，约200 µL），以去除刀豆蛋白A。
	<ol>
		<li>用移液管将新鲜液体加入灌流 chamber 的一端，同时用折成半的滤纸或纸巾的一角从另一端引出液体。或者，也可使用真空抽吸装置小心地从一端抽出液体，同时从另一端加入新鲜液体。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>采用步骤5.4.1中所述的定向流方法，加入两倍于腔室体积（约200 µL）的细胞悬液（来自步骤3.4）上样细胞。 
	注意：目标是对盖玻片上的单层细胞进行成像。因此，接种的细胞浓度需足够低，以避免细胞相互重叠，同时又需足够高，以保证每个视野中有足够数量的细胞，从而在每次图像采集时获得最大量的数据。腔室中细胞的最佳浓度可能有所不同，应通过实验确定。若需提高流动腔室中的细胞浓度，可将细胞培养物在1,000 × g下轻柔离心2分钟，并移除部分上清液。若需降低细胞浓度，可向细胞悬液中加入新鲜的合成完全培养基。细胞浓度可在步骤5.7（下文）之后通过相差显微镜观察腔室进行评估。此时，可通过引入更多细胞悬液的方式向腔室中补充细胞。然而，此时无法有效降低细胞密度，最佳方法是使用稀释后的细胞悬液重新加载新的腔室。</li>
	<li>将载玻片盖玻片朝下悬挂，如步骤5.3所述，静置10分钟，使细胞贴附于盖玻片上。</li>
	<li>通过流经4倍腔室体积（约400 µL）的合成完全培养基冲洗未贴壁的细胞。这将清除腔室中游离的悬浮细胞，避免其污染图像采集过程。</li>
	<li>用纸巾的干净角落小心擦干腔室的每一端，使弯月面到达盖玻片边缘。</li>
	<li>用预热至 75 °C 的封片剂密封反应室的两端例如， VALAP（等份的凡士林、羊毛脂和石蜡） 
	注意：此时载玻片已准备好进行成像。根据每个腔室中细胞的密度，腔室可成像长达9小时。细胞将产生二氧化碳（CO₂）2随着时间的推移产生气泡，逐渐将细胞置换。</li>
</ol>
6. 图像采集
<ol>
	<li>将载玻片置于倒置显微镜上，显微镜需配备1.45数值孔径（NA）的100倍CFI Plan Apo物镜、压电载物台、转盘共聚焦扫描装置、激发激光器和EMCCD相机。采集过程中将载物台温度维持在室温（25 °C）。 
	注意：高数值孔径可实现更高的图像分辨率，压电载物台支持高速z轴层扫采集。显微镜的最低配置要求包括100倍物镜、激发激光器和EMCCD相机。</li>
	<li>调节细胞至清晰对焦。通过在载玻片上寻找成簇分布的细胞，确保采集视野中至少有5–6个细胞聚集在一起。 
	注意：尽管无需同时成像多个细胞，但在同一视野中成像多个细胞可提高数据采集效率，且不影响数据质量。但关键在于所有细胞必须位于同一焦平面，不能相互重叠。</li>
	<li>设置多维采集程序，以随时间连续采集多个z轴序列。
	<ol>
		<li>将当前采集参数调整如下：总z轴深度 = 6 µm，以覆盖整个酵母细胞；z轴步进大小 = 300 nm，以在避免过采样的前提下最大化光子收集效率；总采集时间 = 10分钟；时间间隔 = 每4秒采集一次z轴序列；每个z平面的曝光时间 = 90 ms。 
		注意：最佳曝光时间会因相机、激发光源及其他因素而异。通常，最佳曝光时间应为达到GFP标记的星状微管信号与细胞质背景信号的信噪比为3:1所需的最短时间，该比值基于EMCCD测得的像素值计算。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>点击“运行”开始采集，并持续完整采集10分钟。将数据保存为图像序列（.tiff或.nd2格式）。</li>
	<li>在腔室内选择新的视野进行成像，并重复步骤6.2–6.4。 
	注意：单个腔室通常可获得15至20个细胞视野，具体数量取决于腔室内的细胞密度。细胞密度越高，总视野数越少，因为腔室内的CO2积累速度更快。</li>
</ol>
7. 图像分析
<ol>
	<li>在 ImageJ 中打开图像文件<a href="https://imagej.nih.gov" target="_blank">https://imagej.nih.gov</a>) 使用 Bio-Formats 导入插件将其作为超堆栈导入。
	<ol>
		<li>打开 ImageJ，将第 6 节中获取的图像堆栈直接拖动到控制面板上。Bio-Formats 导入器将自动启动。选择 &#34;好的&#34; 将图像堆栈作为超堆栈加载。 
		注意： &#34;Bio-formats 导入选项&#34; 提示框将打开，并确保在下方 &#34;堆栈观察&#34; 切片， &#34;查看堆栈，使用：&#34; 设定为 &#34;超堆叠图像&#34; 和 &#34;堆叠顺序：&#34; 设定为 &#34;XYCZT&#34;</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用Z投影功能将每个Z系列合并为最大强度的二维投影。
	<ol>
		<li>选择 &#34;图像&#34; 菜单， &#34;堆叠&#34; 子菜单，以及 &#34;Z轴投影&#34; 特征。选择 &#34;最大投影&#34; 从下拉列表中选择并点击 &#34;好的。&#34;</li>
	</ol>
	</li>
	<li>对图像序列应用中值滤波器以减少散斑噪声，方法是选择 &#34;过程&#34; 菜单， &#34;滤光片&#34; 子菜单，以及 &#34;中位数&#34; 特征。在半径框中输入 2.0 像素，然后单击 &#34;好的。&#34;</li>
	<li>在视野中识别前期至中期的细胞。 
	注意：这些特征表现为中等大小的芽和短的有丝分裂纺锤体，长度为1-1.5 µm（图1；箭头指示一个较短的有丝分裂纺锤体）。处于此阶段的细胞是分析微管动态的理想材料，因为它们通常仅在纺锤体极处表现出少量星体微管7星体微管可被识别为线性细丝，其GFP信号强度从纺锤体极体（SPB）处的负端到细胞质中的正端保持均匀。</li>
	<li>从图像序列的第一个时间点开始，使用分段线工具沿单根星体微管画一条线，从位于星体微管与荧光标记更强的纺锤体微管交界处的负端，延伸至位于细胞质中的正端（参见图中红色线条） 图1）。双击微管末端以完成线段的分割。</li>
	<li>使用结果表记录测量数据 &#34;测量&#34; 通过按下功能键启用功能 &#34;M&#34; 键盘上的按钮 
	注意：通过在测量设置中选择灰度强度等参数，可记录更多特征 &#34;分析&#34; 菜单和 &#34;设置测量&#34; 子菜单。</li>
	<li>通过单击Z滑块栏上的右箭头或按压 &#34;在键盘上按“/>”键。对图像序列中的所有时间点重复步骤7.5和7.6。</li>
	<li>将结果表中的数据复制并粘贴到电子表格中。通过选择以下选项保存数据 &#34;另存为&#34; 
	注意：这些测量将包含多个数值，但最重要的数值是“slice”（切片），表示该序列中的时间点，以及“length”（长度），表示线条的长度即， 星体微管）。包含其他测量值的列（例如， 面积、平均像素值、角度 等等。可选择保留或弃去。</li>
	<li>通过右键点击并使用电子表格中的功能创建一个新列 &#34;插入&#34; 功能。输入每个时间点的时间（s）。</li>
	<li>创建微管长度（µm）随时间（s）变化的 XY 散点图，使用以下数据 &#34;插入折线图&#34; 特征；选择长度测量作为 &#34;Y&#34; 以及时间列作为 &#34;X.&#34;
	<ol>
		<li>通过观察第7.10步所得散点图中随时间变化的长度正向与负向改变，识别聚合、解聚及暂停区域。 
		注意：聚合事件在至少3个时间点上使微管长度增加至少0.5 µm，且符合线性回归，R2 ≥ 0.9 和 R 值 &#62; 0 (图1B 和 D，绿色点）。去聚合事件在至少3个时间点内使微管长度减少至少0.5 µm，并符合线性回归，R2 ≥ 0.9 和 R 值 &#60; 0 (图1B 和 D，粉色点）。暂停事件与聚合和解聚过程相互独立。暂停定义为微管长度在至少连续3个时间点内的净变化小于0.5 µm；线性回归拟合的R值介于-0.4至0.4之间；且经F检验确定其斜率与零无统计学差异。</li>
		<li>根据散点图的指引，标出长度变化为正值的时间段，并用绿色高亮显示；将长度变化为负值的时间段用粉色高亮显示。</li>
		<li>计算每个高亮区域的线性回归，并记录 R 和 R2为各列中靠近区域的每个部分计算 -value。将每个彩色区域分类为聚合事件或解聚事件。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过将每次生长事件的长度净变化除以时间变化来计算聚合速率。将这些结果记录在步骤 7.10.3 线性回归值相邻的列中。</li>
	<li>通过将每次缩短事件中的长度净变化量除以相应的时间变化量，计算去聚合速率。将这些结果记录在步骤 7.11 所得聚合速率值旁边的列中。</li>
	<li>通过将聚合转为解聚的转换次数除以所有生长时间事件的总时长，计算衰变频率13将这些结果记录在步骤 7.12 所得去聚合速率值相邻的列中。</li>
	<li>通过将去聚合转为聚合的次数除以所有缩短事件的总时间，计算拯救频率13将这些结果记录在步骤7.13所得的灾变频率值相邻的列中。</li>
	<li>通过将所有长度变化的绝对值之和除以图像采集的总持续时间（在步骤 7.10.1 中计算得出），再乘以 27.0833，计算动态性，单位为每秒微管蛋白亚基数目14将这些结果记录在步骤7.14所得救援频率值相邻的列中，并保存结果表格。 
	注意：可以使用定制程序（Estrem， 等，稿件已提交）。该程序旨在通过遵循上述详细参数，在长度测量中识别聚合与解聚的时间段。</li>
</ol>

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<li>Markus, S. M., Omer, S., Baranowski, K., Lee, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+Plasmids+for+Fluorescent+Protein+Tagging+of+Microtubules+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">Improved Plasmids for Fluorescent Protein Tagging of Microtubules in Saccharomyces cerevisiae.</a> Traffic. 16 (7), 773-786 (2015).</li>
</ol>

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

芽殖酵母模型在获取微管动力学高分辨率测量数据方面具有显著优势 体内 包括随时间成像单个微管的能力，以及利用酵母遗传学工具操纵微管蛋白和微管调节因子的能力。
与先前描述的装置（包括熔融琼脂垫）相比，刀豆蛋白A包被的培养室具有多项优势。带有培养室的载玻片可预先制备并长期保存，也可立即使用。此外，刀豆蛋白A包被的培养室能够在细胞最初培养的相同培养基中持续培养酵母细胞超过&#62;6小时。需要注意的是，培养室内的细胞数量将决定该培养室可进行成像的时间长短。包被后的培养室可确保仅有一层酵母细胞黏附于盖玻片表面。最后，通过制备多个培养室，可在同一载玻片上对多种不同的酵母菌株进行成像。
在芽殖酵母中对微管动态进行成像存在诸多挑战，包括信号水平相对较低以及该过程的高度动态性。宽场显微镜适用于捕获标记微管的单时间点图像。然而，由于曝光时间较长以及样品受到非焦平面光线的持续照射，宽场显微镜会导致更快的光漂白。同样，激光扫描共聚焦显微镜也因光漂白速度较快而不适用。旋转盘共聚焦显微镜则特别适合用于芽殖酵母中微管动态的成像。本研究所采...

微管是由αβ-微管蛋白亚基组成的细胞骨架多聚体，在多种细胞过程中发挥重要作用，包括细胞内运输、细胞分裂、形态发生和细胞运动。为了构建适用于这些不同功能的微管网络，细胞必须精确调控微管形成的位置和时间。这种调控通过控制αβ-微管蛋白亚基组装成微管多聚体，或将微管解聚为游离亚基的反应来实现；这一过程被称为微管动力学。
微管研究领域的一个主要目标是阐明调控微管动态的分子机制，包括对αβ-微管蛋白亚基以及结合微管蛋白和/或微管的外源性调节因子的研究。一种成熟的实验方法是重建该系统 体外 使用纯化的αβ-微管蛋白，通常与纯化的外源性调节因子联合使用。尽管这是一种有效的研究方法，但重建系统中的微管动态与活细胞中观察到的动态存在显著差异。例如，微管的生长速度更快，而缩短速度更慢 体内 比 体外这些差异可能归因于已知的外源性调控因子的可获得性1以及细胞中尚未明确的因素。因此，在天然的细胞环境中确定微管调节因子及其破坏微管动态的突变体活性至关重要。
尽管后生动物模型已被证明是研究微管功能和高级结构的主要体系，但一些实际问题严重限制了这些模型在精确测量微管动态方面的应用。首先，每个细胞中微管数量众多，从几十到数千不等，这使得长时间可靠追踪单个微管变得困难。许多研究通过成像特异性定位于微管末端的蛋白质（例如末端结合蛋白（EB）家族成员）来应对这一挑战。然而，已知这些蛋白质在后生动物中仅定位于正在生长的微管末端2。因此，这些蛋白质仅能直接用于测量微管的生长速率，而对动态的其他方面（如 catastrophe 事件的发生频率）只能进行间接测量。其次，尽管基因组编辑技术已取得进展，构建稳定表达荧光标记微管蛋白的细胞系，或引入突变以特异性操控微管蛋白或微管调控因子，仍然面临重大挑战。此外，后生动物中存在多种微管蛋白异构体，这使得研究突变如何影响单个微管蛋白基因变得复杂。
芽殖酵母系统在测量方面具有多个重要优势 体内 微管动力学。酵母具有简化的微管网络，可实现单个微管的可视化观察。在酵母中，微管起源于称为纺锤极体（SPBs）的微管组织中心，这些结构嵌于核膜之中。3SPB 作为γ-微管蛋白小复合体的支架，启动微管的成核4,5SPB会成核两类微管：纺锤体微管和星体微管。纺锤体微管伸入核质中，通过动粒微管附着染色体，并通过重叠的极间微管稳定纺锤体。6相比之下，星体微管向外延伸至细胞质中，与密集的纺锤体微管网络相比数量较少。在有丝分裂过程中，前期细胞的每个纺锤体极体（SPB）仅发出1-2条星体微管；这些微管以单根形式存在，而非成束状。7星体微管在有丝分裂过程中的作用是将细胞核和纺锤体移至母细胞与芽生细胞区室之间的连接部位，即芽颈。这一移动过程涉及明确的信号通路，这些通路在星体微管上产生作用力，将细胞核和纺锤体拉向芽颈，并最终移入其中8.
酵母系统的另一个优势在于其遗传学工具的实用性，可用于以前所未有的精确度研究微管调节因子和微管蛋白亚基。酵母还具有简化的微管蛋白异构体组成：单个β-微管蛋白基因（TUB2）和两个α-微管蛋白基因（TUB1 和 TUB3）。这些基因易于引入突变，从而可在均一的微管蛋白群体中进行研究9,10。目前已有多种广泛可用的标记微管的构建体，这些构建体可靶向整合至染色体位点以实现稳定表达（见讨论部分）。
本方法的总体目标是对活体酵母细胞中的单个微管进行四维（X、Y、Z 和 T）成像，以实现对微管动态的高分辨率测量。文中描述了在酵母细胞中构建并整合用于组成型低水平表达荧光标记微管蛋白的实验方法。在成像前，将活细胞装载到涂有植物凝集素刀豆球蛋白 A 的载玻片腔室中，以稳定细胞，便于长期成像。同时，还介绍了图像采集的最佳参数以及数据分析的工作流程。

<table><tbody><tr><td>DOB（缺失碱基）</td><td>Sunrise science&amp;nbsp;</td><td>1650</td><td></td></tr><tr><td>CSM-Leu</td><td>Sunrise science&amp;nbsp;</td><td>1005</td><td></td></tr><tr><td>琼脂</td><td>Ameresco</td><td>N833</td><td></td></tr><tr><td>100 mm 聚苯乙烯培养皿</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875713</td><td></td></tr><tr><td>单链DNA（鲑鱼精子）&amp;nbsp;溶于无菌DiH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>&amp;nbsp;D7656</td><td>用DiH2O配制成10 mg/mL溶液，分装后于-20 &amp;ordm;C保存</td></tr><tr><td>合成完全培养基&amp;nbsp;</td><td>Sunrise science&amp;nbsp;</td><td>1459-100</td><td></td></tr><tr><td>刀豆蛋白A</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>L7647</td><td>用DiH2O配制成2 mg/mL溶液，分装后于-20 &amp;ordm;C保存</td></tr><tr><td>显微镜载玻片</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-544-1</td><td></td></tr><tr><td>显微镜盖玻片</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-541-B</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-374-12</td><td>石蜡膜</td></tr><tr><td>VALAP（等量凡士林、羊毛脂和石蜡混合物）</td><td></td><td></td><td>使用前于75 &amp;ordm;C熔化</td></tr><tr><td>镊子&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>16-100-106</td><td></td></tr><tr><td>聚乙二醇（PEG）3350</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>202444</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;目录编号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;备注&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;显微镜&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ti E 倒置完美聚焦显微镜</td><td>Nikon Instruments</td><td>MEA53100</td><td></td></tr><tr><td>1.45 数值孔径 100X CFI Plan Apo 物镜</td><td>Nikon Instruments</td><td>MRD01905</td><td></td></tr><tr><td>压电载物台&amp;nbsp;</td><td>Physik Instrumente</td><td>P-736</td><td></td></tr><tr><td>转盘扫描器</td><td>Yokogawa</td><td>CSU10</td><td></td></tr><tr><td>激光组合模块</td><td>Agilent Technologies</td><td>MCL400B</td><td></td></tr><tr><td>EMCCD相机</td><td>Andor Technology</td><td>iXon Ultra 897&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;目录编号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;备注&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;软件&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NIS Elements 软件</td><td>Nikon Instruments</td><td>MQS31100</td><td></td></tr><tr><td>Microsoft Excel 软件</td><td>Microsoft</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MATLAB 软件</td><td>MathWorks, Inc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageJ64</td><td>NIH</td><td></td><td>Rasband, W.S., ImageJ, 美国国立卫生研究院（NIH），马里兰州贝塞斯达，美国，http://imagej.nih.gov/ij/，1997-2016。</td></tr><tr><td>Bio-Formats 导入插件</td><td>Open Microscopy Environment</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;目录编号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;备注&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;质粒&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pUC19-LEU2::GFP-TUB1</td><td></td><td>pSK1050</td><td>参考文献：Song, S. 和 Lee, K. S. 酿酒酵母CDC5在胞质分裂中的新功能。J Cell Biol. 152 (3), 451-469 (2001)</td></tr></tbody></table>

高分辨率成像与分析酿酒酵母中单个星体微管的动力学行为

High-resolution Imaging and Analysis of Individual Astral Microtubule Dynamics in Budding Yeast

动态微管对许多细胞过程至关重要，准确测量微管动力学可揭示细胞如何调控这些过程，以及基因突变如何影响这种调控。在后生动物模型中对微管动力学进行定量分析面临诸多挑战，包括微管密度高以及遗传操作受限。相比之下，芽殖酵母模型具有克服这些挑战的优势。本实验方案描述了一种在活酵母细胞中测量单个微管动力学的方法。表达荧光标记微管蛋白的细胞被固定在组装好的载玻片腔室中，从而实现稳定的时程成像。本文还提供了高速四维成像的详细操作指南，以及在共聚焦图像序列中定量分析动态微管特性的实验流程。该方法结合传统的酵母遗传学手段，特别适用于对微管调控因子或改变微管蛋白亚基活性的突变体进行定量评估。

在活体酵母细胞中测量微管动态为评估编码微管调节因子或微管蛋白亚基的基因突变如何影响聚合与解聚速率以及两者间转换频率提供了一种有力的工具。 图1 显示了野生型细胞和β-微管蛋白（β-tubulin）突变体细胞中星体微管动态的时间序列tub2-430Δ）。微管通过GFP标记的α-微管蛋白进行标记，以观察微管长度。红色箭头指示各图像中星状微管的长度（图1A 和 1C）。在8分钟内的每个时间点测量微管长度，这些汇总的长度在活细胞成像图中显示（图1B 和 1D）。这些数据用于确定聚合速率、解聚速率、聚合持续时间、解聚持续时间、恢复频率、转换频率以及动态性参数。
<img alt="细胞分裂过程；聚合-解聚图示；显微镜延时成像与分析。" src="/files/ftp_uploa...

芽殖酵母是研究微管动态的有利模型 体内 由于其强大的遗传学特性和微管细胞骨架的简单性。以下实验方案描述了如何转化和培养酵母细胞，获取共聚焦显微镜图像，以及在活体酵母细胞中对微管动态进行定量分析。

动态微管对许多细胞过程至关重要，准确测量微管动力学可为细胞功能机制提供深入见解。

本实验的总体目标是测量酵母细胞中微管的动力学。该方法有助于回答微管研究领域的一些关键问题，例如微管及微管调节因子中的突变如何调控活细胞中微管的动力学行为。该技术的主要优势在于可在成像过程中保持酵母活细胞的稳定状态。相反，应采用十分钟的高时间分辨率，或数小时的低时间分辨率。本次实验操作将由本实验室的两名研究生 Colby Fees 和 Cassi Estrem 进行演示。本实验所用的酵母细胞经过基因改造，可组成型表达标记有GFP的微管蛋白。从平板上单个菌落取约一微升酵母细胞，接种至三毫升合成完全培养基中。在30摄氏度、250 RPM振荡条件下培养过夜。次日，将饱和培养物用培养基稀释至OD600小于0.1。将稀释后的菌液放回30摄氏度摇床中培养三至四小时，或培养至OD600在0.4至0.8之间。开始准备流式细胞腔载玻片：将一张石蜡膜裁剪成宽四英寸、长七英寸的片状。将标准显微镜载玻片沿其长度方向置于石蜡膜四英寸宽的一边上，并将石蜡膜在载玻片上缠绕三到四圈，使载玻片被三到四层石蜡膜覆盖。将各层压紧以确保形成适当的密封，但避免用力过猛或导致薄膜起皱。使用洁净的美工刀片，并用另一张载玻片作为直边导向，沿载玻片外缘裁切石蜡膜。揭去工作载玻片上多余的薄膜并弃去。以第二张载玻片作为直边，沿载玻片的长轴方向将叠放的薄膜层切割成约10条，每条宽度为2至4毫米。接着，沿载玻片的短轴方向，垂直于先前的切口，将叠放的石蜡薄膜层再次切割，形成宽度为2至4毫米、长度为23至24毫米、厚度为3至4层的条状薄膜。使用剃刀以45度角剥离已切割的薄膜条。然后使用镊子将切割好的条带均匀地分布在干净的载玻片上，以形成所需数量的腔室。在此示例中，将使用四条薄膜条带形成三个腔室。将一片盖玻片置于薄膜条带上，并用镊子将其移动到合适位置。将制备好的载玻片（盖玻片朝上）放置于设定温度约为 95 摄氏度的加热板上，加热约三分钟，直至石蜡膜条变为半透明。使用镊子轻轻按压盖玻片中正对石蜡膜条区域的位置，使盖玻片与载玻片密封贴合。用镊子将载玻片从加热板上取下，置于一旁冷却，确保盖玻片面朝上。当载玻片冷却时，薄膜将恢复为不透明的白色。开始此操作前，将一份200 µL的刀豆蛋白A（Concanavalin A）冻存液在室温下解冻。用移液器吸取约100 µL解冻后的刀豆蛋白A，从其中一个开口端加入至已准备好的载玻片的每个腔室中。然后将载玻片盖玻片朝下悬挂在两个微量离心管架之间，静置5分钟，使刀豆蛋白A（Concanavalin A）黏附于盖玻片上。随后将载玻片恢复为盖玻片朝上的位置，并用合成完全培养基冲洗腔室以去除未结合的刀豆蛋白A。通过使用滤纸的一角从腔室一端吸出液体，同时从另一端用移液器加入新鲜培养基，使两倍腔室体积的培养基流经腔室。使用定向流方法，加入两倍腔室体积的细胞悬液上样细胞。将载玻片倒置悬挂10分钟，使细胞贴附在盖玻片上。用合成完全培养基冲洗四倍腔室体积，去除未贴壁的细胞。用纸巾的干净角落小心擦干计数室的每一端，使弯月面到达盖玻片边缘。用温热的封固剂密封计数室的两端。图像采集将使用配备1.45数值孔径100倍CFI Plan Apo物镜、压电载物台、转盘共聚焦扫描装置、激发激光器和EMCCD相机的倒置显微镜进行。在图像采集期间，将载物台温度保持在室温。将细胞调至焦点，并在载玻片上寻找聚集在一起的细胞，以确保采集视野中至少有五到六个细胞在同一焦平面上聚集。设置多维采集程序，以随时间收集多个z序列图像。将当前采集设置调整如下：总Z轴深度为6微米，以涵盖整个酵母细胞；Z轴步长为300纳米，以在避免过采样的同时最大化光收集效率；总时长为10分钟；Z序列之间的时间间隔为4秒；每个Z平面的曝光时间为90毫秒。点击“运行”开始采集，并持续运行完整的10分钟。数据将以图像序列形式保存，此处展示了一个延时成像的示例结果。通过打开 ImageJ 并将获取的图像堆栈直接拖动到控制面板上来启动图像分析。生物格式导入将自动开始。选择“Okay”以将图像堆栈作为超堆栈加载。使用 ZProject 功能，将每个 z 序列合并为最大强度的二维投影。通过选择“处理”菜单、“滤波”子菜单和“中值”功能，对图像堆栈应用中值滤波器以减少散斑噪声。在半径框中输入 2.0 像素，然后单击“确定”，识别视野中的前 NFA 细胞。这些特征表现为中等大小的芽体以及长度约为1至1.5微米的短纺锤体。从图像序列的第一个时间点开始，使用分段线工具，沿一条星体微管绘制线条，起点位于星体微管与着色较深的纺锤体微管交汇处，终点延伸至位于细胞质中的微管正端。双击微管末端以完成分段线的绘制。使用测量功能记录测量结果：按下键盘上的 M 键，将测量值记录在结果表中。完成所有时间点的测量后，从结果表中复制数据，粘贴到电子表格中，并选择“另存为”以保存数据。该图显示了野生型细胞和一种已知微管更稳定的突变株中星体微管动态的时间序列。微管通过GFP标记的α-微管蛋白进行标记，以观察微管长度。红色箭头标示出星状微管的总长度，箭头末端指向其正端。在八分钟内的每个时间点测量微管长度，这些汇总的长度数据以动态曲线图显示。绿色点表示聚合，粉色点表示解聚。崩塌事件由箭头指示。这些曲线图显示，突变体中的微管比野生型微管更长，且崩塌事件更少。此外，与野生型相比，突变体中微管长度上升和下降斜率所确定的聚合与解聚速率均降低。对微管动态行为的测量还显示，突变体细胞中的微管动态性较野生型下降。一旦掌握，载玻片制备、细胞加样和图像采集可在30分钟内完成，这意味着单日内可对多种不同样品进行成像。在添加刀豆蛋白A之前，可预先制备并储存载玻片腔室。观看本视频后，您应能够充分掌握如何在简单的载玻片腔室中稳定酵母细胞、进行四维成像，以及在活细胞中测量微管动态。除了微管外，该实验步骤还可经修改后用于在数秒至数小时的时间尺度上，测量活酵母细胞中其他荧光标记蛋白的动态变化。

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Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

高分辨率成像和芽殖酵母个人星体微管动力学分析

基因删除和蛋白质过表达是研究蛋白质功能的常用方法。本文中，我们描述了一种在群体水平和单细胞水平上分析酿酒酵母（Saccharomyces...

酿酒酵母中蛋白质浓度依赖的形态表型发育分析

我们提供了一种可重复的基本方法，用于裂殖酵母有性生命周期的长期显微观察。通过文中所述的少量调整，该方案可使研究聚焦于生殖过程的不同阶段。...

裂殖酵母有性生命周期的显微观察

裂殖酵母中细胞分裂事件的时空分析

本方案描述了利用多色4D（延时3D）共聚焦显微镜对出芽酵母中荧光标记的细胞内区室进行分析的方法。成像参数的选择旨在获取足够信号的同时尽量减少光损伤。通过定制的ImageJ插件，可对标记结构进行追踪和定量分析。...

酵母的4D显微成像

本文介绍了一种非毒性显微成像技术——活细胞成像，该方法可使研究人员在活体裂殖酵母细胞的有丝分裂和减数分裂过程中，观察蛋白质行为及核动态变化。...

利用荧光活细胞显微镜观察裂殖酵母有丝分裂和减数分裂的核动态

本文介绍了一种利用活细胞旋转盘共聚焦显微镜和基于 MATLAB...

利用转盘显微镜测量单极有丝分裂纺锤体中微管的动力学

本文介绍了一种在完整组织中进行超分辨率活细胞成像的实验方案。我们已标准化了在其原生组织环境中对高度敏感的成体干细胞群体进行成像的条件。该技术通过平衡时间分辨率与空间分辨率，实现在活体组织中直接观察生物学现象。...

超分辨率活细胞成像观察亚细胞结构

同时可视化交联微管与单体微管的动力学行为 体外 通过全内反射荧光显微镜

此处使用裂殖酵母作为异源宿主，表达与GFP构成融合蛋白的细菌细胞骨架蛋白（如FtsZ和MreB），以观察其聚合行为。同时，通过荧光显微镜成像鉴定影响这些蛋白聚合的化合物。...

以裂殖酵母作为靶向细菌细胞骨架蛋白的抗菌药物筛选平台

本方案详细介绍了两种酵母细胞周期阻滞及可选释放的方法，并阐述了如何利用荧光显微镜研究酿酒酵母（S.

芽殖酵母中细胞周期依赖性过程的操作与分析

学习利用高分辨率共聚焦显微镜在活酵母细胞中测量星体微管动力学的方法。该方案通过GFP标记微管蛋白实现实时成像，为研究微管调控机制提供可靠工具。

高分辨率成像与分析酿酒酵母中单个星体微管的动力学行为

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