高分辨率成像与分析酿酒酵母中单个星体微管的动力学行为

本实验的总体目标是测量酵母细胞中微管的动力学。该方法有助于回答微管研究领域的一些关键问题，例如微管及微管调节因子中的突变如何调控活细胞中微管的动力学行为。该技术的主要优势在于可在成像过程中保持酵母活细胞的稳定状态。

相反，应采用十分钟的高时间分辨率，或数小时的低时间分辨率。本次实验操作将由本实验室的两名研究生 Colby Fees 和 Cassi Estrem 进行演示。本实验所用的酵母细胞经过基因改造，可组成型表达标记有GFP的微管蛋白。

从平板上单个菌落取约一微升酵母细胞，接种至三毫升合成完全培养基中。在30摄氏度、250 RPM振荡条件下培养过夜。次日，将饱和培养物用培养基稀释至OD600小于0.1。

将稀释后的菌液放回30摄氏度摇床中培养三至四小时，或培养至OD600在0.4至0.8之间。开始准备流式细胞腔载玻片：将一张石蜡膜裁剪成宽四英寸、长七英寸的片状。将标准显微镜载玻片沿其长度方向置于石蜡膜四英寸宽的一边上，并将石蜡膜在载玻片上缠绕三到四圈，使载玻片被三到四层石蜡膜覆盖。

将各层压紧以确保形成适当的密封，但避免用力过猛或导致薄膜起皱。使用洁净的美工刀片，并用另一张载玻片作为直边导向，沿载玻片外缘裁切石蜡膜。揭去工作载玻片上多余的薄膜并弃去。

以第二张载玻片作为直边，沿载玻片的长轴方向将叠放的薄膜层切割成约10条，每条宽度为2至4毫米。接着，沿载玻片的短轴方向，垂直于先前的切口，将叠放的石蜡薄膜层再次切割，形成宽度为2至4毫米、长度为23至24毫米、厚度为3至4层的条状薄膜。使用剃刀以45度角剥离已切割的薄膜条。

然后使用镊子将切割好的条带均匀地分布在干净的载玻片上，以形成所需数量的腔室。在此示例中，将使用四条薄膜条带形成三个腔室。将一片盖玻片置于薄膜条带上，并用镊子将其移动到合适位置。

将制备好的载玻片（盖玻片朝上）放置于设定温度约为 95 摄氏度的加热板上，加热约三分钟，直至石蜡膜条变为半透明。使用镊子轻轻按压盖玻片中正对石蜡膜条区域的位置，使盖玻片与载玻片密封贴合。用镊子将载玻片从加热板上取下，置于一旁冷却，确保盖玻片面朝上。

当载玻片冷却时，薄膜将恢复为不透明的白色。开始此操作前，将一份200 µL的刀豆蛋白A（Concanavalin A）冻存液在室温下解冻。用移液器吸取约100 µL解冻后的刀豆蛋白A，从其中一个开口端加入至已准备好的载玻片的每个腔室中。

然后将载玻片盖玻片朝下悬挂在两个微量离心管架之间，静置5分钟，使刀豆蛋白A（Concanavalin A）黏附于盖玻片上。随后将载玻片恢复为盖玻片朝上的位置，并用合成完全培养基冲洗腔室以去除未结合的刀豆蛋白A。通过使用滤纸的一角从腔室一端吸出液体，同时从另一端用移液器加入新鲜培养基，使两倍腔室体积的培养基流经腔室。

使用定向流方法，加入两倍腔室体积的细胞悬液上样细胞。将载玻片倒置悬挂10分钟，使细胞贴附在盖玻片上。用合成完全培养基冲洗四倍腔室体积，去除未贴壁的细胞。

用纸巾的干净角落小心擦干计数室的每一端，使弯月面到达盖玻片边缘。用温热的封固剂密封计数室的两端。图像采集将使用配备1.45数值孔径100倍CFI Plan Apo物镜、压电载物台、转盘共聚焦扫描装置、激发激光器和EMCCD相机的倒置显微镜进行。

在图像采集期间，将载物台温度保持在室温。将细胞调至焦点，并在载玻片上寻找聚集在一起的细胞，以确保采集视野中至少有五到六个细胞在同一焦平面上聚集。设置多维采集程序，以随时间收集多个z序列图像。

将当前采集设置调整如下：总Z轴深度为6微米，以涵盖整个酵母细胞；Z轴步长为300纳米，以在避免过采样的同时最大化光收集效率；总时长为10分钟；Z序列之间的时间间隔为4秒；每个Z平面的曝光时间为90毫秒。点击“运行”开始采集，并持续运行完整的10分钟。数据将以图像序列形式保存，此处展示了一个延时成像的示例结果。

通过打开 ImageJ 并将获取的图像堆栈直接拖动到控制面板上来启动图像分析。生物格式导入将自动开始。选择“Okay”以将图像堆栈作为超堆栈加载。

使用 ZProject 功能，将每个 z 序列合并为最大强度的二维投影。通过选择“处理”菜单、“滤波”子菜单和“中值”功能，对图像堆栈应用中值滤波器以减少散斑噪声。在半径框中输入 2.0 像素，然后单击“确定”，识别视野中的前 NFA 细胞。

这些特征表现为中等大小的芽体以及长度约为1至1.5微米的短纺锤体。从图像序列的第一个时间点开始，使用分段线工具，沿一条星体微管绘制线条，起点位于星体微管与着色较深的纺锤体微管交汇处，终点延伸至位于细胞质中的微管正端。双击微管末端以完成分段线的绘制。

使用测量功能记录测量结果：按下键盘上的 M 键，将测量值记录在结果表中。完成所有时间点的测量后，从结果表中复制数据，粘贴到电子表格中，并选择“另存为”以保存数据。该图显示了野生型细胞和一种已知微管更稳定的突变株中星体微管动态的时间序列。

微管通过GFP标记的α-微管蛋白进行标记，以观察微管长度。红色箭头标示出星状微管的总长度，箭头末端指向其正端。在八分钟内的每个时间点测量微管长度，这些汇总的长度数据以动态曲线图显示。

绿色点表示聚合，粉色点表示解聚。崩塌事件由箭头指示。这些曲线图显示，突变体中的微管比野生型微管更长，且崩塌事件更少。

此外，与野生型相比，突变体中微管长度上升和下降斜率所确定的聚合与解聚速率均降低。对微管动态行为的测量还显示，突变体细胞中的微管动态性较野生型下降。一旦掌握，载玻片制备、细胞加样和图像采集可在30分钟内完成，这意味着单日内可对多种不同样品进行成像。

在添加刀豆蛋白A之前，可预先制备并储存载玻片腔室。观看本视频后，您应能够充分掌握如何在简单的载玻片腔室中稳定酵母细胞、进行四维成像，以及在活细胞中测量微管动态。除了微管外，该实验步骤还可经修改后用于在数秒至数小时的时间尺度上，测量活酵母细胞中其他荧光标记蛋白的动态变化。