一种多孔冻存管可消除肌肉组织直接浸入液氮时产生的冷冻伪影

本实验的总体目标是通过将肌肉组织直接浸入液氮中进行冷冻，同时消除冷冻过程中产生的假象。我实验室的学生何茂章将与黄一中共同演示该操作步骤。首先，在每个冻存管上标记样品编号。

然后，准备好以下设备：液氮罐、护目镜或面罩、防冻手套、10 厘米长的镊子和 25 厘米长的镊子。同时准备好聚苯乙烯泡沫箱、塑料薄膜、手术刀和 A4 PVC 装订封套。为制备肌肉样本，首先用液氮充满泡沫箱。

获取标本后五分钟内，将样本轻轻放置在一张A4尺寸的PVC装订封面上，观察肌纤维走向。接着，使用解剖刀沿肌纤维方向在标本上做两条平行切口，切口长约3厘米，间距约0.6厘米。将切开的肌肉修整成一个长约1.5厘米、宽约0.6厘米、高约0.6厘米的矩形块状。

然后，使用10厘米的镊子，将样本轻轻放置在一块塑料膜上，使切开的肌肉长轴与塑料膜的长边平行。将肌肉组织放入已标记的冷冻管的下中部，正好位于进样孔之间，并拧紧管盖。为冷冻组织样本，使用25厘米的镊子迅速将整个冷冻管浸入预冷的泡沫箱中的液氮里，等待直至液氮不再沸腾。

液氮应足以浸没整个冻存管，且冻存管应完全位于液面以下。将肌肉样本转移至液氮储存罐或-80摄氏度冰箱中进行长期保存。必须避免冷冻肌肉与室温容器或仪器发生意外接触。

制备切片时，先将冷冻切片机预冷至-20摄氏度至-22摄氏度之间。取出并丢弃旧的切片刀片，并用清洁布擦拭切片机内的刀架和防卷板。然后，在冷冻切片机中安装新的切片刀片，并将切片厚度设置为8 µm。

从液氮罐或-80摄氏度冰箱中取出装有肌肉样本的冻存管，置于液氮或干冰中。随后将样本转移至冷冻切片机，静置30分钟，使样本温度与冷冻切片机环境温度达到平衡。使用OCT包埋样本后，将样本安装至样本夹持器中。

然后，切取八微米厚的切片。将切片置于室温载玻片中央。立即将载玻片放入载玻片盒中。

然后，将载玻片盒放入 -80 摄氏度冰箱中。切勿使载玻片在室温下干燥。如图所示，当猪背最长肌样本直接放入 -80 摄氏度冰箱时，形成了冰晶，导致肌肉冷冻切片出现典型的“瑞士奶酪”效应。

当肌肉组织直接浸入液氮时，也会形成冰晶。采用另一种方法时，将组织以适当方向浸入OCT包埋介质，然后在异戊烷悬浊液中快速冷冻，肌纤维的细胞质区室内会形成许多针状冰晶。将组织冷冻至多孔冷冻管中，可实现优异的样本完整性，细胞质区室清晰可见，且肌纤维与周围组织紧密贴合。

采用该方法，分析了快收缩肌纤维和慢收缩肌纤维中的ATP酶活性。在相同染色时间下，快收缩纤维呈浅色，着色程度为两级，而慢收缩纤维呈深黑色。在此处展示的标准冷冻方法中，将肌肉组织浸入异戊烷悬浮液中，且不与OCT包埋介质直接接触；然而，异戊烷悬浮液的固液状态难以维持超过一小时，且异戊烷并非随时可得。