Name: 腹腔镜技术在猕猴肝和肠系膜淋巴结的串行采集 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-02T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 6 s
Description: 了解腹腔镜技术用于猕猴肝脏和肠系膜淋巴结的连续采集方法。该技术可在多个时间点进行采样，减少手术创伤，改善动物福利，为HIV病理学和免疫学研究提供关键样本。

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本工作由美国国立卫生研究院（NIH）资助，资助号为P51OD010425。

动物饲养和护理均在国际实验动物评估和认可委员会（AAALACi）认证的设施中进行，所有动物实验操作均依照华盛顿大学和华盛顿国家灵长类研究中心机构动物护理与使用委员会（IACUC）批准的方案执行。
1. 手术准备、麻醉与镇痛
<ol>
	<li>镇静与诱导
	<ol>
		<li>通过肌肉注射给予猕猴氯胺酮（10 mg/kg）和右美托咪定（0.015 mg/kg），两者混合于同一注射器中。在将动物从笼中移出前，确保其无退缩反射。</li>
		<li>对动物进行气管插管，并使用异氟烷（1.0 - 2.5%）和100%氧气维持全身麻醉状态。有关猕猴插管和全身麻醉的更多信息，请参见参考文献17,18,19。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>麻醉支持与监测
	<ol>
		<li>插入外周静脉导管，并在整个麻醉和手术过程中以5 mL/kg/h的速度输注等渗静脉液体（如乳酸林格液）。涂抹无菌眼用润滑剂以防止角膜干燥。</li>
		<li>给予镇痛药物，例如缓释型丁丙诺啡（0.2 mg/kg，皮下注射）。 
		注：若实验方案允许使用非甾体抗炎药（NSAID），且动物在麻醉期间血压正常、水合良好，则可在麻醉恢复期同时给予非甾体抗炎药（如美洛昔康或酮洛芬）。</li>
		<li>在整个麻醉和手术过程中监测麻醉深度（例如 下颌张力）、心率、呼吸频率、心电图（EKG）、血压、脉搏血氧饱和度、呼气末二氧化碳（CO2）以及体温。 
		注：当腹部充气时，动物可能出现通气不足。若呼吸频率下降或呼气末CO2水平超过45 mmHg，应提供机械通气。</li>
		<li>手术结束后，肌肉注射阿替美唑（0.15 mg/kg）以逆转右美托咪定的作用。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>手术准备
	<ol>
		<li>进行多次温水灌肠，以减少结肠内粪便量，便于术中视野暴露和肠道操作20。</li>
		<li>使用装有40号刀头的电动剪毛器去除手术区域的毛发。剃毛范围从肋缘至耻骨，从左侧至右侧侧腹壁。</li>
		<li>采用适当的消毒剂（如交替使用氯己定-酒精或聚维酮碘-酒精擦洗）无菌处理手术区域。</li>
		<li>将动物置于手术台上，体位为仰卧位与右侧卧位之间的中间角度。用绳子将四肢固定于伸展位置。当动物转移至手术室并摆放好体位后，再进行最后一次氯己定和酒精消毒。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 手术
注意：有关小型动物腹腔镜检查的更多信息，请参见参考文献21。
<ol>
	<li>腹腔镜器械准备
	<ol>
		<li>用无菌有孔洞巾覆盖动物。</li>
		<li>在非无菌助手的协助下，用无菌相机罩包裹数码相机，并将电缆连接至主机。将硬性内窥镜连接至相机头部。</li>
		<li>将无菌导光束连接至硬性内窥镜，并将导光束连接至光源。根据制造商的说明对相机进行白平衡校准。</li>
		<li>将无菌充气管路连接至充气装置。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>腹腔镜进入
	<ol>
		<li>使用15号手术刀，在脐部左侧约1 - 2 cm处，垂直刺入皮肤至腹壁肌肉层，做一长约5 mm的切口。</li>
		<li>用非优势手提起戳孔切口 cranial 侧的腹壁。用优势手将 Veress 针尖端经切口插入，并将针尖朝向 cranial 侧倾斜。 
		注意：Veress 针的穿刺角度需根据动物的体况进行调整。例如，对于肥胖的动物，Veress 针应几乎垂直于腹壁插入；而对于瘦小的动物，则应将 Veress 针向头侧倾斜，以降低接触内脏器官的风险。
		<ol>
			<li>握住气腹针的针杆（而非针柄），用力将其推进，以穿透腹壁进入腹腔。可感觉到明显的阻力 &#34;点击&#34; 当锐利的针尖穿透腹膜时，阻力会减小，Veress 针的钝头会弹入腹腔。 
			注意：如果针头恰当地进入腹腔，在推进和回撤1 - 2 cm时阻力很小。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>连接CO₂培养箱2 将充气管连接至穿刺针并打开止流夹。加压使腹腔内压力不超过10–12 mmHg，以建立气腹。 
		注意：当腹部对称性扩张，且肋缘正常的锐利轮廓消失时，表明气腹已达到理想状态。压力应足以提供足够的空间插入套管/穿刺器，同时避免接触内脏器官的风险。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>导管置入
	<ol>
		<li>腹腔充分气腹后，使用15号手术刀片在左前腹部皮肤上做一长约5–7 mm的切口，切口位置位于最后肋骨后方约2–4 cm处，直至腹壁肌肉层。</li>
		<li>通过皮肤切口插入一个5 mm的套管穿刺器组件，并将其向尾内侧方向倾斜约45–60度。穿透腹腔至1–2 cm深度。通过旋转套管（再深入约0.5–1 cm），将螺纹套管旋入腹腔至1.5–3 cm深度，然后拔出穿刺针。</li>
		<li>将气腹管从Veress针上取下，关闭止流夹，然后拔出针头。将气腹管连接至套管，打开止流夹，维持气腹压力不超过10 - 12 mmHg。</li>
		<li>将硬性内窥镜经套管插入腹腔。</li>
		<li>在镜头观察下，使用#15手术刀片沿先前插入气腹针时的皮肤切口，继续切开腹壁肌肉层和腹膜。通过镜头观察切口的腹腔内侧，以避开血管并减少出血。 
		注意：确保切开肌肉和腹膜的切口足够大，以便探头进入并外置肠系膜（约 0.5 cm）。对于肠系膜脂肪较多的动物，可能需要更大的切口才能外置肠系膜。</li>
		<li>将动物置于头低脚高位21 将双脚抬高至高于头部约15–30度。此步骤为可选，但可能有助于更方便地获取结肠的肠系膜淋巴结，因为小肠将移向更 cranial 的位置。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>肠系膜淋巴结活检
	<ol>
		<li>在摄像头观察下，将实心探针经由步骤 2.3.5 中制作的腹部切口插入。</li>
		<li>将探针置于大网膜与肠管之间，采用 sweeping motion（扫动手法）轻轻将大网膜从肠管表面分离，以充分暴露其下方的肠系膜。继续从腹部尾侧向头侧方向进行扫动操作。将分离后的大网膜移至右上腹部，使其远离手术视野。</li>
		<li>使用探头将降结肠向左侧或右侧腹壁移动，以便更好地观察肠系膜，有助于寻找肠系膜淋巴结。</li>
		<li>使用探针扫查肠系膜，沿结肠和肠系膜血管定位肠系膜淋巴结。 
		注意：结肠旁淋巴结沿结肠的肠系膜缘走行，左结肠淋巴结位于血管分支处附近，而肠系膜下淋巴结则沿肠系膜下血管分布。在体型较瘦的动物中，肠系膜淋巴结易于观察。当其埋藏于肠系膜脂肪中时，常使表面的肠系膜略显隆起并具有光泽，颜色通常较周围肠系膜脂肪更偏灰褐色。此外，肠系膜淋巴结通常沿淋巴管和肠系膜血管走行分布。</li>
		<li>一旦确定淋巴结，取出探头，将马里兰带锁扣的镊子插入腹腔。用镊子夹住目标淋巴结附近的肠系膜，将肠系膜拉向切口，并将内窥镜从套管中取出。</li>
		<li>关闭气腹机，并保持套管针三通阀开放，以降低腹腔压力，便于肠系膜的外置。通过切口将肠系膜拉出体外。外置后，使用弯头蚊式止血钳或拇指钳夹持肠系膜，确保经切口的操作通路畅通。</li>
		<li>通过触诊寻找质地较硬的淋巴结和/或直接观察淋巴结呈现的灰白色或结节状外观，以确定外翻肠系膜中的淋巴结位置。
		<ol>
			<li>一旦识别出目标，使用弯止血钳在靠近淋巴结的肠系膜处做一个小切口（约3–5 mm）。用弯止血钳进行钝性分离，游离淋巴结与肠系膜的连接组织。根据需要，使用4-0不可吸收单丝缝线结扎血管。用手术刀进行锐性分离，切除淋巴结。将切除的淋巴结置于冰上的Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640培养基中。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>检查外置的肠系膜是否有出血。若发现出血，应通过使用止血钳或结扎（4-0不可吸收单丝缝线）阻断血管，或采用电凝止血法进行适当止血。释放肠系膜，并将腹腔重新充气至10–12 mmHg，使肠系膜回纳至腹腔内。</li>
		<li>重复步骤 2.4.1 至 2.4.8 以获取额外的淋巴结活检样本。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>肝活检
	<ol>
		<li>将表格恢复至水平位置。</li>
		<li>通过之前用于淋巴结活检取样的切口（步骤2.3.5中制作的切口）将带螺纹的套管插入腹腔。确保切口足够大（约5–7 mm），以便在不使用套管针的情况下顺利置入套管。将硬质内窥镜经此套管插入，朝向腹腔前部，观察腹腔前部区域及肝脏。</li>
		<li>在摄像头观察下，将活检钳经先前置入左前腹部的套管（步骤 2.3.1 中制作的切口）插入。</li>
		<li>获取肝组织活检时，将活检钳置于选定肝叶边缘下方，使钳子的可动部分朝向肝脏，打开活检钳，使肝叶边缘落入张开的钳口中。确保肝脏与活检钳之间无网膜组织。调整活检钳位置，关闭钳口以夹取目标取样区域。
		<ol>
			<li>维持压力约 20 - 30 秒以确保止血。保持镊子闭合，轻轻将镊子经套管向上拉出，以取出样本，此操作可使肝组织活检样本轻柔地从肝脏撕离。将肝活检组织置于冰上的 RPMI 1640 培养基中。 
			注意：使用5 mm活检钳进行肝活检，其组织大小约为5 mm × 2 mm × 2 mm。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>通过内镜观察活检部位是否有出血。若发现出血，将生理盐水浸湿的无菌棉签经套管插入并按压活检部位。或者，可用无菌明胶海绵填塞活检部位以帮助止血。</li>
		<li>重复步骤 2.5.3 至 2.5.5 以获取额外的肝活检样本。 
		注意：此处每次操作每只动物采集3个活检样本，足以满足所有后续分析。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>手术关闭
	<ol>
		<li>检查腹腔是否有出血。 
		注意：截至目前尚未发生此情况。然而，若发现出血过多，应确定出血部位，并通过无菌棉签加压或使用明胶海绵进行适当止血。</li>
		<li>关闭气腹机并打开套管针的旋塞阀。用手轻轻按压腹部，完全释放腹腔内的压力。随后拔出套管针。</li>
		<li>每个腹壁切口使用1至2个间断单纯缝合关闭。建议使用4-0可吸收缝线。</li>
		<li>在缝合皮肤前，为每个切口注入0.1–0.3 cc布比卡因以实施局部镇痛，进行浸润阻滞。</li>
		<li>每处切口使用1-2针埋藏间断缝合（推荐4-0可吸收缝线）。可使用组织胶。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 肝脏活检样本处理与淋巴细胞分析
<ol>
	<li>将数块肝组织（大小约为 0.5 mm × 0.5 mm × 0.5 mm）分别保存于冻存管中，使用优选的RNA保存液以及10%福尔马林，用于后续分子生物学和组织学分析。
	<ol>
		<li>将剩余的肝活检组织置于含50 mL RPMI 1640培养基的无菌250 mL带盖塑料杯中，培养基中添加1×青霉素/链霉素、40 µg/mL商品化胶原酶溶液和4 µg/mL DNA酶。使用磁力搅拌子和搅拌器在37 °C下剧烈搅拌1小时。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将消化后的组织倒入两个装有70 µm滤膜并插入50 mL锥形管的过滤器上，用无菌5 mL注射器末端研磨，制成单细胞悬液。用添加了10%胎牛血清和1×青霉素/链霉素的RPMI 1640培养基（R10）将两管体积补至50 mL。</li>
	<li>在4 °C下以840 × g离心6分钟。弃去上清液。将两管中的细胞分别用5 mL R10重悬，合并至一个50 mL锥形管中，再用R10补总体积至50 mL。使用血细胞计数板计数细胞，以确定细胞得率。
	<ol>
		<li>在4 °C下以840 × g离心6分钟。将细胞沉淀用1 mL R10重悬，均分至两个5 mL圆底聚苯乙烯管中，并用R10将每管体积补至4 mL，每管目标细胞数为&#62;500,000个。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在4 °C下以840 × g离心6分钟。弃去上清液，将细胞沉淀用4 mL磷酸盐缓冲液（PBS）重悬。再次在4 °C下以840 × g离心6分钟。</li>
	<li>弃去上清液，用100 µL PBS轻轻涡旋重悬细胞。加入1.5 µL可固定的死细胞染料，在室温下孵育5分钟。</li>
	<li>按照制造商推荐的滴定浓度，加入以下未稀释的表面染色抗体：CD45-PerCP（克隆号D058-1283）、CD3-PE-CF594（克隆号SP34-2）、CD20-PE-Cyanin5（克隆号2H7）、CD4-BV605（克隆号OKT4）、CD8-BV570（克隆号RPA-T8）和CD14-BV785（克隆号M5E2）。在4 °C下孵育20分钟。</li>
	<li>加入4 mL PBS，在4 °C下以840 × g离心6分钟。弃去上清液，将细胞沉淀用含1%多聚甲醛的250 µL PBS重悬。 
	注意：多聚甲醛具有毒性，请穿戴适当的个人防护装备。</li>
	<li>按照参考文献22所述方法，使用流式细胞仪分析细胞群体。</li>
</ol>

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</ol>

作者声明不存在竞争性财务利益。

本文展示了一种微创技术，用于连续采集肠系膜淋巴结（MLN）和肝组织活检样本，在本研究及其他未描述的动物中均实现了100%的成功率。此外，同一动物在不同时间点多次使用该技术未出现任何不良事件。事实上，在感染猴免疫缺陷病毒（SIV）、猴/人免疫缺陷嵌合病毒（SHIV）或寨卡病毒的其他动物群体中应用该技术也未引起任何并发症（未发表数据）。同样，即使在既往接受过重大腹部手术或血小板减少症的动物中，该手术也已证明是成功的（未发表数据）。我们证实，在从采集MLN转为采集肝组织时，通过调换摄像头的位置，可利用相同的两个通道完成取样，从而避免额外切口。影响MLN采集的相关因素此前已有报道13。
在单只动物身上，已成功随时间进行了多达四次采集，每次采集包括3个肠系膜淋巴结（MLN）和3份肝组织活检样本，过程中未出现并发症、操作成功率变化或所收集数据的改变。此外，这种腹腔镜MLN/肝脏组织采集技术已成功与其他操作联合实施，例如外周淋巴结采集、内镜上下消化道活检、骨髓穿刺、脑脊液采集以及静脉穿刺，这些操作均在同一麻醉过程中完成，从而能够以连续的方式对病毒学和免疫学反应进行广泛评估（未发表数据）。
整个操作通常需要30至45分钟完成，通过两个约0.5 cm的切口进行。在肥胖动物中，可能需要更大的切口（约1–1.5 cm）以取出肠系膜淋巴结（MLN），并可能需要更长时间完成操作。具有大量肠系膜脂肪的动物，通常需要较丰富的经验才能将MLN与周围脂肪组织区分开来。MLN常位于肠系膜血管沿线，且在血管分支点附近更为常见。该技术的一个关键点在于，所选的MLN必须在肠系膜中具有足够的可移动性，以便通过腹部切口拉出体外。因此，该技术无法用于采集靠近肠系膜根部的MLN。由于放大作用，有时使用摄像头更容易识别MLN，而在MLN附近进行夹持操作，有助于在其被拉出体外后定位和确认淋巴结。
使用特伦德伦堡位（Trendelenburg position）可能并非总是必要进行MLN采集，若无需采用特伦德伦堡位即可轻松获取MLN，则可使肝活检操作更为简便，因为这能防止器官向头侧移位。有时，在放置为特伦德伦堡位后，肝脏会向上移位紧贴膈肌，因此在采集活检前需轻柔地将肝脏复位。由于MLN采集的穿刺口位于左侧，肝活检通常取自左外侧叶和左内侧叶，因为这些肝叶更靠近套管。
收集的肠系膜淋巴结（MLN）和肝脏活检样本提供了足量的细胞，可用于多种下游分析，并且所获细胞的存活率较高。本研究中，对细胞进行了染色，以通过流式细胞术分析白细胞和淋巴细胞群体，揭示了这两个重要免疫器官之间的关键差异。例如，与肝脏相比，MLN中CD4+ T细胞高度富集，这归因于MLN作为整合与传递适应性免疫应答核心位点的重要性，同时也与CD4+ T细胞在调控针对饮食来源及胃肠道常驻微生物所衍生的微环境抗原的炎症性和耐受性免疫应答中的重要作用有关24。然而，与MLN相比，肝脏中CD14+白细胞显著富集。CD14主要表达于单核细胞和巨噬细胞，是细菌脂多糖（LPS）受体复合物的关键组分25。事实上，血浆中可溶性CD14浓度升高与HIV及致病性SIV感染中的微生物易位和免疫激活密切相关26。因此，与MLN相比，肝脏中CD14+白细胞频率更高，可能反映了该器官具有更大的细菌负荷。
本文展示了一种快速且微创的外科手术技术，仅通过两个小切口进行腹腔镜入路，即可实现肠系膜淋巴结（MLN）和肝脏的系列活检，且未导致任何不良后果。这些样本为研究发生在肠系膜淋巴结和肝脏中的关键免疫学、病毒学及微生物学过程提供了有效途径，这些过程与系统性免疫相互独立且具有独特性。同样，肝脏活检对于长期评估HIV/SIV、药物治疗以及易位微生物所造成的影响至关重要，这些因素常共同作用引发显著的肝损伤16。此外，由于肠系膜淋巴结和肝脏是暴露于胃肠道微生物群的免疫器官，能够随时间动态评估这些器官中的免疫状态，为理解微生物组在维持宿主免疫稳态中所起作用提供了极佳平台。综上所述，在疫苗和治疗效果评估、SIV病毒储存库清除以及黏膜免疫总体研究背景下，对肝脏和肠系膜淋巴结的评估具有重要意义。采用这种微创方式获取样本，相比目前已发表的技术，可显著降低与操作相关的炎症风险，并减少对动物生理状态的影响。未来，我们将进一步评估是否可通过相同的两个操作端口位置，在采集肠系膜淋巴结和肝脏样本的同时采集脾脏样本，从而实现对免疫系统另一重要且独立组成部分的取样，该器官已被证明在多种疾病模型中发挥关键作用。

胃肠道（GI）是人体最大的黏膜表面，暴露于大量来自食物、病原体以及通常被称为微生物组的内共生菌群的抗原1,2。肠系膜淋巴结（MLN）沿胃肠道分布，是介导针对这些多样化抗原产生炎症或耐受性免疫应答的主要免疫器官3。MLN 的物理结构形成了一个区室化的系统，能够在局部对抗原产生反应，而不会引发全身性免疫应答。同样，胃肠道的血液通过门静脉引流至肝脏，再返回体循环，因此会接触从胃肠道易位至黏膜下层并进入血流的微生物及其产物4。肝脏也具有次级淋巴器官的功能，含有大量免疫细胞，包括特化的巨噬细胞，用于清除易位的微生物5,6。因此，MLN 和肝脏是主要暴露于胃肠道共生菌和致病菌以及来自其他来源抗原环境的免疫器官，在免疫学上具有独特而重要的地位。
肠系膜淋巴结（MLN）是评估人类免疫缺陷病毒（HIV）或致病性猴免疫缺陷病毒（SIV）感染病毒学和免疫学效应的关键部位，可能在直肠内攻击后SIV的早期播散中发挥重要作用。尽管现代抗逆转录病毒治疗（ART）能够有效控制病毒血症，肠道相关淋巴组织仍被认为是HIV持续复制的主要部位7。在SIV感染模型中，MLN已被证实是潜伏病毒的重要储存库，甚至可能是主要的病毒储存库8,9。肝脏在慢病毒性感染中也具有重要作用，急性SIV感染期间，猕猴肝脏中会积聚SIV特异性的CD8+ T细胞，即为证据之一10。此外，肝脏也是清除循环中病毒的主要器官11。
HIV 和 SIV 感染与肠道微生物群的改变、肠道上皮完整性的破坏以及微生物及其产物从结肠向全身循环和外周组织的易位增加有关12,13。这些过程与局部及全身性免疫激活相关，并导致 HIV 感染者发病率和死亡率升高14。在 SIV 感染中，已在肠系膜淋巴结（MLN）中观察到易位的细菌15，而微生物产物在肝脏中的积聚已被证实可引起炎症并导致器官损伤16。因此，在 HIV 和 SIV 感染背景下，肠系膜淋巴结和肝脏对于理解由肠道定居细菌驱动的炎症过程具有重要研究价值。
本文介绍了一种用于非人灵长类动物（NHP）肠系膜淋巴结（MLN）和肝脏连续取样的微创腹腔镜技术。我们以两只健康的雌性恒河猴（RMs）为例，成功实施了该技术，每只动物各进行两次取样，每次手术间隔160天。随后，我们利用这些样本通过流式细胞术评估并比较了各器官内关键的白细胞和淋巴细胞群体，并展示了两个时间点之间高度一致的数据结果。

<table><tbody><tr><td>人工泪液润滑性眼膏</td><td>Patterson Veterinary</td><td>97-890-8152</td><td></td></tr><tr><td>Priority Care 氯己定 2% 外科洗手液</td><td>Patterson Veterinary</td><td>07-842-6153</td><td></td></tr><tr><td>Vedco 异丙醇 70%</td><td>Patterson Veterinary</td><td>07-869-6434</td><td></td></tr><tr><td>Vedco Vetadine 外科洗手液</td><td>Patterson Veterinary</td><td>07-869-6772</td><td></td></tr><tr><td>Hospira 乳酸林格氏液 250 mL</td><td>Patterson Veterinary</td><td>07-800-9325</td><td></td></tr><tr><td>青少年剖腹手术单</td><td>Medline</td><td>DYNJP3004</td><td></td></tr><tr><td>Access 40 L 气腹机</td><td>Dyonics</td><td>7205832</td><td></td></tr><tr><td>300XL 氙灯光源</td><td>Dyonics</td><td>7206084</td><td></td></tr><tr><td>460P 3 &amp;ndash; 带镜头的 CCD 数字相机</td><td>Dyonics</td><td>72200086</td><td></td></tr><tr><td>通用相机罩，7&amp;rdquo; x 96&amp;rdquo;</td><td>Endoscopy Support Services</td><td>ESS-6920</td><td></td></tr><tr><td>通用导光束，7.5 英尺</td><td>Endoscopy Support Services</td><td>US.OU225</td><td></td></tr><tr><td>气腹管路</td><td>Endoscopy Support Services</td><td>TM-102</td><td></td></tr><tr><td>多功能硬性内窥镜，2.7 mm x 187.5 mm，0 度</td><td>Endoscopy Support Services</td><td>B30-0007-00</td><td></td></tr><tr><td>2.7 mm x 187.5 mm 内窥镜用检查与保护套管，带一个固定三通阀</td><td>Endoscopy Support Services</td><td>B10-0025-00</td><td></td></tr><tr><td>硬性内窥镜，5 mm x 300 mm</td><td>Endoscopy Support Services</td><td>B30-0071-00</td><td></td></tr><tr><td>Veress 穿刺针，2 mm x 80 mm&amp;nbsp;</td><td>Endoscopy Support Services</td><td>8302.08</td><td></td></tr><tr><td>带刻度实心探针，5 mm x 320 mm</td><td>Endoscopy Support Services</td><td>8383.661</td><td></td></tr><tr><td>Maryland 抓取与分离钳，双动棘轮手柄，3.5 mm x 240 mm&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Endoscopy Support Services</td><td>8390.2054</td><td></td></tr><tr><td>活检钳，3.5 mm x 310 mm</td><td>R. Wolf</td><td>8391.4063</td><td></td></tr><tr><td>带气腹接口的塑料螺纹套管，3.5 mm x 60 mm</td><td>Endoscopy Support Services</td><td>8903.072</td><td></td></tr><tr><td>带气腹接口的塑料螺纹套管，5.5 mm x 60 mm</td><td>Endoscopy Support Services</td><td>8919.333</td><td></td></tr><tr><td>钝头穿刺器</td><td>Endoscopy Support Services</td><td>8903.101</td><td></td></tr><tr><td>锥形头穿刺器</td><td>Endoscopy Support Services</td><td>8903.121</td><td></td></tr><tr><td>CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Airgas</td><td>CD USPE</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH30027FS</td><td>含 L-谷氨酰胺</td></tr><tr><td>RNA later 稳定溶液</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>AM7021</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P4333</td><td></td></tr><tr><td>Liberase TM 研究级酶</td><td>Sigma Aldrich</td><td>5401119001</td><td>市售胶原酶溶液</td></tr><tr><td>牛胰脱氧核糖核酸酶 I</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D5025</td><td></td></tr><tr><td>70 &amp;micro;m 细胞筛</td><td>Morganville Scientific</td><td>CSS0200</td><td></td></tr><tr><td>5 mL 注射器</td><td>BD</td><td>309646</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 圆锥形离心管</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>339652</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH3007003</td><td></td></tr><tr><td>5 mL 圆底聚苯乙烯管</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-959A</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH3025601</td><td></td></tr><tr><td>LIVE/DEAD Aqua 可固定死细胞染色试剂盒</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>L34957</td><td>胺类死细胞染色剂</td></tr><tr><td>CD45-PerCP（克隆号 D058-1283）</td><td>BD Biosciences</td><td>558411</td><td></td></tr><tr><td>PE-CF594 小鼠抗人 CD3（克隆号 SP34-2）</td><td>BD Biosciences</td><td>562406</td><td></td></tr><tr><td>BV605 小鼠抗人 CD4（克隆号 OKT4）</td><td>Biolegend</td><td>317438</td><td></td></tr><tr><td>APC-H7 小鼠抗人 CD8（克隆号 SK1）</td><td>BD Biosciences</td><td>560179</td><td></td></tr><tr><td>PE-Cy5 小鼠抗人 CD20（克隆号 2H7）</td><td>BD Biosciences</td><td>555624</td><td></td></tr><tr><td>BV786 小鼠抗人 CD14（克隆号 M5E2）</td><td>BD Biosciences</td><td>563698</td><td></td></tr><tr><td>16% 甲醛水溶液</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-980-487</td><td></td></tr><tr><td>LSR II 流式细胞仪</td><td>BD</td><td>NA</td><td></td></tr></tbody></table>

猕猴肝脏和肠系膜淋巴结系列采集的腹腔镜技术

Laparoscopic Technique for Serial Collection of Liver and Mesenteric Lymph Nodes in Macaques

肠系膜淋巴结（MLN）和肝脏暴露于来自胃肠道（GI）的微生物及其产物，使其具有独特的免疫学特性。在人类免疫缺陷病毒（HIV）感染中，胃肠道及其相关的MLN是病毒早期复制的部位，而MLN可能是潜伏感染细胞的重要储存库，即使在长期抗逆转录病毒治疗（ART）后依然存在。研究表明，肝脏在应对慢病毒的免疫反应中发挥重要作用，并似乎在清除循环中的病毒方面具有显著作用。非人灵长类动物（NHP）的HIV和获得性免疫缺陷综合征（AIDS）模型能够很好地模拟HIV感染的这些特征，在该模型中对病毒复制的主要部位及相关免疫反应进行连续纵向取样，将有助于阐明感染过程、发病机制中的关键事件，以及各种干预策略对这些事件的影响。目前已有发表的技术可同时采集肝脏和MLN样本，但需进行大型手术和/或尸检，限制了在同一动物个体中对这些重要部位进行系列重复研究的能力。我们此前已描述了一种用于采集MLN的腹腔镜技术。本文中，我们介绍一种微创腹腔镜技术，可通过采集MLN所需的同一两个穿刺口，实现对肝脏和MLN的连续纵向取样。使用相同的两个穿刺口可最大限度减少对动物的影响，无需额外切口。与开腹大手术相比，该技术可提高取样频率，并降低手术并发症以及可能干扰结果解读的局部和全身炎症反应的风险。该操作方法有望在提升动物福利的同时，促进基于非人灵长类动物模型的相关研究。

腹腔镜采集的MLN样本处理的详细方法，以及这些器官中的细胞得率和白细胞频率此前已有报道13. 图1 显示了使用该腹腔镜技术从两只健康的雌性恒河猴（RMs）在相隔160天的两个时间点采集的肠系膜淋巴结（MLN）和肝活检样本的细胞得率和细胞活力数据。我们发现，MLN的细胞得率显著高于肝脏P = 0.0021），平均为 33.5 × 106 和 6.74 x 106 分别获得的细胞。通过流式细胞术进行死细胞染色与分析表明 &gt;从两个器官分离的细胞中，90%具有活性。
通过流式细胞术，我们评估并比较了MLN和肝脏中白细胞与淋巴细胞的丰度。图中显示了肝脏样本的代表性设门方案。 图2，首先对单细胞设门以排除细胞团块，随后选择活细胞，再选择CD45+ 细胞，最后是 CD3+ 细胞。从 CD3+ 群体，我们评估了CD4+ 和 CD8+ T细胞，而我们评估了CD14的丰度+ 和 CD20+ 来自 CD3- 群体的细胞。代表性流式细胞术图显示 CD45+ 和 CD3+ 第0天和第160天两只动物的MLN和肝脏中的细胞群如图所示 图3，而 图4 显示了两只动物两次采样中白细胞和淋巴细胞的丰度。MLN 中 CD45 的丰度显著更高+ 细胞活力高于肝脏（活细胞比例平均分别为76.9%和7.66%） P= 0.0002）。不出所料，MLN 中 CD3 阳性细胞的比例显著更高+ T细胞（P &lt; 0.0001）和 CD4+ T细胞（P = 0.0004）。相反，肝脏中CD14的富集程度显著升高+ 与MLN相比的白细胞P = 0.0036）。MLN 中 CD8 的平均值较高+ T细胞，但这一差异无统计学意义。出乎意料的是，在这两只动物中，两个器官均表现出相似水平的CD20表达。+ B细胞。本研究中从小鼠肠系膜淋巴结（MLN）获得的不同白细胞和淋巴细胞亚群的细胞产量和丰度与既往报道的数值一致。23.
<img alt="MLN 与肝脏的细胞得率和活力柱状图，显示显著差异（P=0.0021）" src="/files/ftp_upload/55617/55617fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 1"> 
图 1. 连续采集的 MLN 与肝脏活检组织的总细胞得率（上图）和细胞活力（下图）。 MLN 的细胞得率显著高于肝脏。然而，两种样本类型均能提供足够数量的细胞用于后续分析。通过流式细胞术使用可固定的死细胞胺染料检测细胞活力，结果显示两种样本类型在组织解离后通常可获得 &gt; 90% 的细胞活力。误差线表示样本间的标准差。<a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55617/55617fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="流式细胞术示意图；CD标志物的细胞门控分析：CD45、CD3、CD4、CD8、CD14、CD20。" src="/files/ftp_upload/55617/55617fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图2"> 
图2. 代表性流式细胞术门控策略。 首先排除聚集的细胞，然后通过可固定的死细胞胺染料染色后仅选择活细胞。接着选择CD45+白细胞，再从中选择CD3+T细胞。在CD3+细胞群中，分别分析CD4+和CD8+T细胞。在CD3-细胞群中，分析CD14+和CD20+细胞。该门控策略也用于MLN的分析。<a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55617/55617fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="流式细胞术点图显示MLN和肝脏细胞在第0/160天FSC-H与CD45/CD3的表达情况" src="/files/ftp_upload/55617/55617fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图3"> 
图3. 两只动物引流淋巴结和肝脏的纵向流式细胞术图谱 两只动物的MLN和肝脏样本相隔160天采集。 （A）. 肠系膜淋巴结 CD45+ 细胞（白细胞）； （B） 肝 CD45+ 细胞（白细胞）； (C) MLN+ CD3+ T细胞（T细胞）； （D） 肝脏 CD3+ 细胞（T细胞）。对于这两种动物，MLN显示出更高比例的CD45+ 和 CD3+ 与肝脏相比，这些细胞群的频率在不同时间点于两种动物中均相似。 <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55617/55617fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<img alt="流式细胞术结果；MLN与肝脏中CD45+细胞频率；显著性P值已标出。" src="/files/ftp_upload/55617/55617fig4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图4"> 
图4. 23次独立取样中CD45+细胞（左）及多种白细胞与淋巴细胞亚群（右）的频率。 肠系膜淋巴结（MLN）中CD45+、CD3+和CD4+细胞的频率显著更高，而肝脏中CD14+白细胞的频率显著更高，表明各器官具有独特的免疫功能。误差线表示样本间的标准差。<a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55617/55617fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

本文介绍一种用于猕猴肝脏和肠系膜淋巴结（MLN）系列取样的微创腹腔镜技术，该方法可提高取样频率，并与开腹手术相比降低手术并发症的风险。

肠系膜淋巴结（MLN）和肝脏暴露于来自胃肠道（GI）道的微生物及其产物，这使得它们……

本微创腹腔镜手术的总体目标是通过在多个时间点采集肠系膜淋巴结和肝组织活检样本，以更好地评估胃肠道微生物易位的影响，同时改善实验动物福利。该方法有助于回答艾滋病病毒（HIV）生物学领域中的关键科学问题，例如感染及微生物易位对肠系膜淋巴结和肝脏的免疫学影响，以及这些组织的病理变化。该技术的主要优势在于，可在对动物影响极小、且不干扰待评估参数的前提下，实现研究过程中多个时间点的组织取样。该方法可提供对深入研究艾滋病病毒（HIV）至关重要的样本，也可应用于其他胃肠道炎症和微生物易位具有重要意义的模型。本操作将由华盛顿国家灵长类研究中心的兽医外科医生Jeremy Smedley博士和Cassie Moats博士执行。按照文本方案中的说明完成猕猴的手术准备工作后，用无菌带孔洞巾覆盖。接着，使用无菌摄像机洞巾紧密包裹数码相机，并将其插入塔式系统中。将硬质内窥镜与相机头连接。然后将无菌光缆连接到硬性内窥镜上，并将其连接至光源。最后，在气腹机上安装无菌充气管。开始腹腔镜手术时，将15号手术刀片置于脐部左侧约1至2厘米处，在皮肤上做一个约5毫米长的穿刺切口，直至腹壁肌肉层。用非优势手提起切口头侧的腹壁。然后用另一只手将弯针的针尖经切口插入，针尖朝向动物头部方向。用手握住弯针的针杆，用力推进，直至针尖穿过腹壁，进入腹腔时阻力明显降低并产生弹脱感。然后将CO2气腹机的导管连接至穿刺针，打开旋塞阀，使气体进入腹腔。通过使压力达到10至12毫米汞柱，建立气腹。当腹部充分膨胀后，在左前腹部、距最后肋骨后方约2至4厘米处放置15号手术刀片，做一长约5至7毫米的皮肤切口。接下来，通过切口插入一个5毫米的套管穿刺器组件。将该组件插入深度为1至2厘米，方向约为向尾侧内侧45至60度。然后以旋转动作向前滑动套管，达到1.5至3厘米的深度，将套管旋入腹腔。随后，拔出套管针。将气腹管从套管针上断开，然后关闭旋塞阀。将管路连接至套管，并打开旋塞阀以维持气腹状态。确认压力维持成功后，移除内收位穿刺针。接着，通过套管将硬性内窥镜插入腹腔。在摄像头的引导下，扩大内收位穿刺针移除后残留的皮肤切口，切开腹肌和腹膜。最后，将动物体位调整为足部高于头部约15至30度。为采集肠系膜淋巴结活检样本，通过已准备好的切口将实心探针插入腹腔。将探针置于大网膜与肠管之间，以轻柔的扫动动作分离大网膜与肠管，从而暴露并观察其下方隐藏的肠系膜。继续将探针从尾侧向头侧方向移动，以将大网膜推离手术区域。然后使用探针将降结肠推向腹壁。用探针检查肠系膜，以定位沿结肠和肠系膜血管分布的肠系膜淋巴结。一旦确定淋巴结，将探头从腹腔中取出，换用带锁扣的马里兰镊夹住邻近该淋巴结的肠系膜。将肠系膜向切口方向牵拉，并将内窥镜从套管中取出。随后关闭气腹机，并保持套管的旋塞阀开放，以释放腹腔内的气体，从而便于肠系膜的外翻。然后将肠系膜经切口拉出。用镊子夹住外置的肠系膜，以确保切口处的通路通畅。通过触诊或观察肠系膜，辨认出淋巴结，其通常表现为较硬的结节或颜色较灰的区域。接下来，使用弯止血钳在靠近淋巴结的肠系膜上做一个3至5毫米的开口，并钝性分离组织上的任何附着物。如有需要，用4-0不可吸收单丝缝线结扎血管，然后使用手术刀分离淋巴结。随后，将活检组织置于冰上的RPMI 1640培养基中。最后，松解肠系膜并再次向腹腔内充气，以便将组织拉回腹腔。将手术台恢复至水平位置。为采集肝活检样本，通过用于淋巴结采集的切口将带螺纹的套管插入腹腔。然后使用套管针，将硬质内窥镜沿腹腔 cranial 区域滑入，以观察肝脏。在摄像头的引导下，通过先前用于腹腔充气的套管针插入活检钳。将活检钳置于目标肝叶边缘下方，使其钳口朝向组织，打开钳口，使肝叶边缘落入钳口中。调整位置后，闭合镊子并保持压力约20至30秒。随后轻轻拉动镊子穿过套管，取出样本。将活检组织置于冰上的RPMI培养基中。最后，确保活检部位无出血，并缝合切口。图中显示的是在两个不同时间点从两只健康的雌性猕猴获取的肠系膜淋巴结和肝脏活检样本的细胞得率。与肝脏活检相比，淋巴结活检所获得的分离细胞数量显著更高。无论来源组织如何，分离得到的细胞中超过85%具有活性。随后对分离的细胞样本进行CD45+白细胞和CD45+CD3+淋巴细胞群体的分析。与肝脏来源的细胞相比，肠系膜淋巴结中CD45+白细胞和CD3+淋巴细胞的比例更高。对分离细胞群的详细表征显示，肠系膜淋巴结中含有显著更高比例的CD3+ T细胞和CD4+ T细胞，以及数量升高的CD8+ T细胞。相反，肝脏中CD14+白细胞显著富集。两个器官中CD20+ B细胞的丰度相似。一旦掌握，该技术可在30至40分钟内完成。动物通常在数小时内从麻醉中恢复，恢复活动并开始进食，且切口极小，在笼边观察时难以察觉。实施该操作时，保持动物处于有利于手术成功的体况至关重要。大量肠系膜脂肪可能构成显著障碍，因其会遮蔽淋巴结并增加组织脆性和出血风险。完成该操作后，可进一步开展其他方法，如静脉采血、外周淋巴结活检、上下消化道内镜检查及直肠活检，以评估全身和黏膜免疫应答、微生物状态、上皮屏障功能以及病毒载量。该技术建立后，使本实验室研究人员得以纵向探索猕猴组织中的微生物群落变化，而这些组织此前仅能在尸检时获取。该技术的意义延伸至HIV治疗领域，因为微生物易位是导致炎症并推动HIV发病机制的主要原因。以连续方式评估这一过程可提供潜在的治疗靶点，并有助于评估治疗干预的效果。请务必注意，操作任何病毒感染的猕猴都可能具有极高的危险性。应提供适当的预防措施，包括针对猕猴B病毒（macaquesin herpesvirus 1）等生物危害的规范培训、合适的个人防护装备、咬伤和抓伤应急处理包，以及规范的医疗随访。

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医学

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基于丝线引导的腹腔镜肝肿瘤三维定位肺段切除术

本方案描述了一种可存活的小鼠肠系膜淋巴结清扫术，该手术安全且耐受性良好，可沿肠系膜淋巴结链的四个站点分别进行。本方案具有可调整性，可用于选择性阻断远端结肠、近端结肠和/或小肠的淋巴通路。...

小鼠肠系膜淋巴结切除术以选择性阻断特定区域肠道的淋巴通路

本实验方案描述了一种肝淋巴管插管大鼠模型，可实现对肝脏淋巴系统和血管系统引流的直接且定量的评估。该模型能够同时采集肝淋巴液和全身血液，用于研究肝脏物质转运、代谢及免疫信号传导，支持药物药代动力学和肝脏特异性生物学的研究。...

一种通过同时采集淋巴管和血管血液评估肝脏转运通路的综合性大鼠模型

了解腹腔镜技术用于猕猴肝脏和肠系膜淋巴结的连续采集方法。该技术可在多个时间点进行采样，减少手术创伤，改善动物福利，为HIV病理学和免疫学研究提供关键样本。

猕猴肝脏和肠系膜淋巴结系列采集的腹腔镜技术

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