猕猴肝脏和肠系膜淋巴结系列采集的腹腔镜技术

本微创腹腔镜手术的总体目标是通过在多个时间点采集肠系膜淋巴结和肝组织活检样本，以更好地评估胃肠道微生物易位的影响，同时改善实验动物福利。该方法有助于回答艾滋病病毒生物学领域中的关键问题，例如感染及微生物易位对肠系膜淋巴结和肝脏的免疫学影响，以及这些组织的病理变化。该技术的主要优势在于，可在对动物影响极小、且不干扰待评估参数的前提下，实现研究过程中多个时间点的组织取样。

该方法可提供对深入理解 HIV 至关重要的样本，也可应用于其他胃肠道炎症和微生物易位具有重要意义的模型。本操作将由华盛顿国家灵长类研究中心的兽医外科医生 Jeremy Smedley 博士和 Cassie Moats 博士完成。

按照文本方案中的说明完成猕猴的手术准备工作后，用无菌带孔洞巾覆盖。接着，使用无菌摄像机洞巾紧密包裹数码相机，并将其插入塔式设备中。将硬质内窥镜与相机头连接。

然后将无菌光缆连接到硬性内窥镜上，并将其连接至光源。最后，在气腹机上安装无菌充气管。开始腹腔镜手术时，将15号手术刀片置于脐部左侧约1至2厘米处，在皮肤上做一个长约5毫米的穿刺切口，直至腹壁肌肉层。

用非优势手提起切口头侧的腹壁。然后用另一只手将弯针的针尖经切口插入，针尖朝向动物头部方向。用手握住弯针的针杆，用力推进，直至针尖穿透腹壁，进入腹腔时阻力明显减小并产生弹脱感。

然后将二氧化碳气腹机的导管连接到穿刺针上，并打开旋塞，使气体进入腹腔。通过使压力达到最高10至12毫米汞柱来建立气腹。当腹部充分膨胀后，在左侧头侧腹部、最后肋骨后方约2至4厘米处放置15号手术刀片，做一长约5至7毫米的皮肤切口。

接下来，通过切口插入一个5毫米的套管穿刺器组件。将该组件插入深度为1至2厘米，方向大致为尾侧内侧45至60度。然后以旋转动作向前滑动套管，到达1.5至3厘米的深度，将套管旋入腹腔。

随后，移除套管针。将气腹管从瓦氏针上断开，然后关闭旋塞阀。将管路连接至套管，并打开旋塞阀以维持气腹状态。

确认压力维持成功后，移除穿刺针。接着，通过套管将硬质内窥镜插入腹腔。在摄像头的引导下，扩大穿刺针移除后残留的皮肤切口，切开腹肌和腹膜。

最后，将动物体位调整为足部高于头部约15至30度。为采集肠系膜淋巴结活检样本，通过已准备好的切口将实心探针插入腹腔。将探针置于大网膜与肠管之间，以轻柔的扫动动作将肠管与大网膜分离，从而暴露并观察其下方隐藏的肠系膜。

继续将探针从尾侧向头侧方向移动，以将大网膜推离手术区域。然后使用探针将降结肠推向腹壁。用探针检查肠系膜，以定位沿结肠和肠系膜血管分布的肠系膜淋巴结。

确定淋巴结后，将探头从腹腔中取出，换用带锁扣的马里兰镊夹住邻近该淋巴结的肠系膜。将肠系膜向切口方向牵拉，并将内窥镜从套管中取出。随后关闭气腹机，并保持套管上的旋塞阀开放，以释放腹腔内的气体，从而便于肠系膜的外置。

然后将肠系膜通过切口拉出。用镊子夹住外置的肠系膜，以确保能够通过切口进行操作。触诊或观察肠系膜，识别其中的淋巴结，淋巴结通常表现为较硬的结节或颜色较灰的区域。

接下来，使用弯止血钳在靠近淋巴结的肠系膜上做一个3至5毫米的开口，并钝性分离组织上的任何附着物。如有需要，用4-0不可吸收单丝缝线结扎血管，然后使用手术刀分离淋巴结。随后，将活检组织置于冰上的RPMI 1640培养基中。

最后，松解肠系膜，并再次向腹腔内充气，以便将组织拉回腹腔。将手术台恢复至水平位置。为采集肝活检样本，通过用于淋巴结采集的切口将带螺纹的套管插入腹腔。

然后使用套管，将硬质内窥镜沿腹腔 cranial 方向插入，以观察肝脏。在摄像头的引导下，通过先前用于腹腔气腹的套管插入活检钳。将活检钳置于目标肝叶边缘下方，使其钳口朝向组织，打开钳口，使肝叶边缘落入钳口中。

调整位置后，闭合镊子并保持压力约20至30秒。随后轻轻将镊子经套管拉出，取出样本。将活检组织置于冰上的RPMI培养基中。

最后，确保活检部位无出血，并缝合切口。图中展示了在两个不同时间点从两只健康的雌性猕猴获取的肠系膜淋巴结和肝脏活检样本所获得的细胞产量。与肝脏活检相比，淋巴结活检所获得的分离细胞数量显著更高，这符合预期结果。

无论来源组织如何，分离得到的细胞中超过85%具有活性。随后对分离的细胞样本进行CD45+白细胞和CD45+CD3+淋巴细胞群体的分析。与肝脏来源的细胞相比，肠系膜淋巴结中CD45+白细胞和CD3+淋巴细胞的比例更高。

对分离细胞群的详细表征显示，肠系膜淋巴结中含有显著更高比例的 CD3+ T 细胞和 CD4+ T 细胞，以及数量升高的 CD8+ T 细胞。相反，肝脏中则显著富集 CD14+ 白细胞。两个器官中 CD20+ B 细胞的丰度相似。

一旦掌握，该技术可在30至40分钟内完成。动物通常在麻醉后数小时内即可苏醒，恢复活动并开始进食，且切口极小，在笼边观察时难以察觉。进行该操作时，保持动物处于有利于手术成功的体况至关重要。

大量的肠系膜脂肪可能构成显著的手术障碍，因为它会遮蔽淋巴结，并增加组织脆性和出血风险。完成该操作后，可进一步开展其他方法，如静脉采血、外周淋巴结活检、上下消化道内镜检查以及直肠活检，以评估全身和黏膜免疫应答、微生物状态及上皮屏障功能，以及病毒载量。该技术建立后，使我们实验室的研究人员能够纵向研究炎症过程中猕猴组织内的微生物群落，而这些组织此前仅能通过尸检获得。

该技术的意义延伸至HIV治疗领域，因为微生物易位是导致炎症并推动HIV发病机制的主要原因。以连续方式评估这一过程可提供潜在的治疗靶点，并有助于评价治疗干预措施的效果。请务必注意，操作任何病毒感染的猕猴都可能具有极高的危险性。

应提供适当的预防措施，例如针对包括猕猴疱疹病毒1型在内的生物危害的正确培训、适当的个人防护装备、咬伤和抓伤处理包，以及适当的医疗随访。