评估原发性冲击效应 体外

本方法的总体目标是产生在爆炸事件中可能出现的代表性冲击波，并评估这种机械冲击对培养中原代细胞活力的影响。该方法可帮助我们回答与单个细胞类型对高能事件（例如暴露于冲击波）反应相关的关键科学问题。该方法的主要优势在于，能够让我们评估不同细胞对单一冲击波的特异性反应，而非组织或器官水平的反应。

该技术的意义在于有助于识别由冲击波暴露引起的原发性爆震伤所导致的细胞机制改变。尽管本方法以特定类型的细胞为例进行演示，但任何细胞均可在培养后置于测试装置中，以评估其对冲击波的特异性反应。首先，在标准培养条件下培养目标细胞系，直至其达到80%融合度。

然后，吸去培养基。用 PBS 洗涤细胞两次，加入 2 mL 胰蛋白酶-EDTA。在标准培养条件下孵育 5 分钟。

简单检查以确认细胞已成功从培养瓶上脱落。然后向培养瓶中加入4毫升含FBS的培养基，以中和胰蛋白酶，并将细胞转移至15毫升锥形管中。在200 × g下离心4分钟，使细胞沉淀。

然后，缓慢吸走上清液，注意不要扰动沉淀。将沉淀重悬于 5 mL 培养基中。将三个标记好的 35 mL 培养皿放入一个 90 mL 培养皿内。

然后，向每块培养皿中加入两毫升培养基，并分别接种7万个细胞。将细胞孵育过夜，以确保细胞充分贴壁，然后再暴露于冲击波。在开始组装冲击管之前，应穿戴适当的个人防护装备，包括钢头工作靴和实验服。

首先将两根对准杆插入出口法兰水平面上的螺栓孔中。然后将一张腈橡胶垫片覆盖在对准杆的末端，使其位于出口法兰与离体器官培养装置之间。通过将装置沿对准杆滑动，将其连接到激波管的出口法兰上。

确保其方向正确，使放置培养皿的部分位于底部。接着，将四个 M24 螺栓和垫圈插入剩余的孔中，并以对角对称的方式依次拧紧螺母和螺栓，同时目视检查 EVOC 装置与激波管是否已成功对齐。然后，将压力传感器连接到 EVOC 装置上，并使用传感器电缆将其连接至电流源。

此外，使用 BNC 电缆将电流源连接至示波器。确保激波管上的所有泄压阀和流量控制阀均处于关闭状态。然后，打开内置的外部压缩空气管路，并手动顺时针旋转压力调节器，将电磁阀充气至 2.5 bar。

打开压缩空气气瓶，然后缓慢顺时针旋转压力调节器，将压力增至约15 bar。接着，通过将厚度为0.125毫升的塑料片裁剪成10厘米×10厘米的正方形来制备隔膜。用胶带制作手柄，并将其固定在隔膜的顶部和底部。

使用它们小心地将隔膜置于紧靠枪膛前端小凸缘的位置。在闭合枪膛之前，确保隔膜平直且位置正确。然后使用四个 M24 螺栓和螺母将其固定。

在无菌操作台内，准备具有粘性的透气膜，使其每片大小足以覆盖一个35毫升培养皿的顶部。然后，将含有三个实验样本的90毫升培养皿转移至操作台内。吸取其中一个培养皿中的培养基，并用两片膜覆盖其表面，确保膜与培养皿边缘之间形成严密的密封。

将样品转移至EVOC装置，并将其固定在夹具底部，使培养皿顶部与激波管内底面齐平。此时，应佩戴耳罩、护目镜、安全靴和实验服。顺时针旋转调压阀上的流量控制旋钮，对激波管系统加压。

在控制面板底部，选择双开缝入口以产生短持续时间的冲击波，或选择驱动管入口以延长波的持续时间。然后，打开直流电源和示波器以获取波形数据。接下来，打开位于控制面板对面墙上的开关，启动安全警示灯，以便在冲击管充电时提醒其他研究人员不要进入房间。

在电磁阀控制箱上，按下开关以关闭电磁阀。然后，在控制面板上，通过逆时针缓慢旋转旋钮来打开流量控制，逐步增加压缩腔内的压力。当达到隔膜破裂压力时，隔膜将破裂，并可听到爆裂声。

一旦听到此噪音，立即关闭流量控制旋钮。然后，通过关闭电磁阀控制盒上的开关来打开电磁阀，并关闭安全指示灯。将细胞样品转移至无菌操作台。

随后，移除透气性粘合膜，向培养皿中加入两毫升新鲜培养基。在每块实验培养皿重新加入两毫升新鲜培养基后，立即加入200微升氧化还原指示剂试剂。然后，将培养皿转移至标准培养箱中孵育四小时。

孵育结束后，从每个培养皿中转移两份100微升等分试样至相应的96孔板中。使用荧光酶标仪读取数据，然后导出并保存结果。若需对活细胞和死细胞进行荧光成像，需先将细胞接种于35毫升培养皿内的玻璃盖玻片上。

冲击波处理后，吸除培养基，并用一毫升 PBS 洗涤细胞两次。然后，从成像试剂盒中转移 100 微升活死染色试剂至每个样品中，在室温下避光孵育 15 分钟。

孵育结束后，移除试剂，用一毫升 PBS 洗涤细胞一次。使用尖头镊子，小心地将盖玻片从 35 毫米培养皿中取出，并翻转后放置在玻璃显微镜载片上。使用配备数值孔径为 0.25 的 5X 物镜的荧光显微镜，对每个样品采集图像。

然后，使用图像分析软件对每张图像中存活的绿色细胞和死亡的红色细胞进行手动或自动计数。采用本方法描述的实验，将单层培养的细胞暴露于冲击管产生的冲击波中。冲击管内的传感器显示沿管路不同位置测得的压力分布情况。

通过氧化还原指示实验发现，在培养24小时后，施加127千帕的冲击波可显著降低毛乳头细胞的存活率，与对照组相比差异明显。而施加72千帕或更低的冲击波则未导致细胞存活率下降。为支持上述观察结果，活/死细胞染色实验也显示，与对照组相比，暴露于127千帕冲击波的细胞存活率降低。

一旦掌握，该技术可快速完成，每小时可处理约 60 个样本。冲击管可用于产生冲击波，以研究多种原发性爆震损伤，这些损伤可从爆震性肺损伤到异位骨化，后者指在身体软组织内异常形成骨组织。

在进行该操作时，必须牢记使用压缩气体和高能冲击波时存在的风险，并始终遵循正确的安全指南。对激波管进行微小的修改即可改变激波的特性，从而能够评估细胞对不同压力分布和强度的反应，这些条件可代表不同的爆炸场景。

通过此操作流程，可进行下一代测序以回答其他研究问题，例如，冲击波暴露如何改变细胞内的天然转录？