评估主要爆炸效果体外
September 18th, 2017
了解如何通过接触冲击波来调节细胞, 有助于识别爆炸事件引发的损伤机制。该协议使用 custom-built 激波管设备, 应用冲击波在一系列的压力, 以细胞单分子膜和确定后的影响细胞的生存能力。
该方法的总体目标是产生爆炸事件期间可能发生的代表性冲击波，并评估这种机械冲击对培养物中原代细胞活力的影响。这种方法可以帮助我们回答与单个细胞类型对高能量事件（例如暴露于冲击波）的响应有关的关键问题。这种方法的主要优点是它使我们能够评估细胞对单个冲击波的不同反应，而不是组织或器官水平的反应。
该技术的含义延伸到识别由于暴露于冲击波引起的原发性爆炸损伤而改变的细胞机制。虽然这种方法正在用特定的目标细胞类型进行演示，但任何细胞都可以培养并放置在测试装置中，以评估细胞对冲击波的特异性反应。首先，在标准培养物中培养感兴趣的细胞系，直到它们达到 80% 汇合。
然后，吸出培养基。用 PBS 洗涤细胞两次，并加入 2 毫升胰蛋白酶-EDTA。在标准培养条件下孵育 5 分钟。
简要检查以确保细胞已成功从培养瓶中解离。然后向培养瓶中加入 4 mL 含 FBS 的培养基，以中和胰蛋白酶并将细胞转移到 15 mL 锥形管中。将细胞以 200 x g 离心 4 分钟以沉淀细胞。
然后，慢慢吸出上清液，注意不要使沉淀脱落。并将沉淀重悬于 5 毫升培养基中。将三个贴有标签的 35 毫升培养皿放入一个 90 毫升培养皿中。
然后，向每个培养皿中加入 2 毫升培养基，并为每个培养皿接种 70,000 个细胞。将细胞孵育过夜，以便在细胞暴露于冲击波之前充分粘附细胞。在开始组装减震管之前，请穿上适当的个人防护装备，包括钢头工作靴和实验室外套。
首先，将两个校准杆插入出口法兰水平面上的螺栓孔。然后，在定位杆的末端放置丁腈橡胶垫片，使其位于出口法兰和离体器官培养装置之间。通过将夹具滑过定位杆，将 EVOC 装置连接到减震管的出口法兰上。
确保其方向正确，以便容纳培养皿的部分位于其底部。接下来，将四个 M24 螺栓和垫圈插入剩余的孔中，并以对角对称的方式依次拧紧螺母和螺栓，同时目视检查 EVOC 装置和减震管是否已成功对齐。然后，将压力传感器连接到 EVOC 装置，并使用传感器电缆将其连接到电流源。
此外，使用 BNC 电缆将电流源连接到示波器。确保减震管上的所有释放阀和流量控制装置均已关闭。然后，打开内置的外部压缩管道并手动顺时针转动压力调节器，将电磁阀充电至 2.5 bar。
打开压缩空气气缸，然后顺时针缓慢转动压力调节器，将压力增加到大约 15 bar。接下来，通过将 0.125 毫升厚的塑料片切成 10 厘米 x 10 厘米的正方形来准备隔膜。用胶带制作手柄，并将它们固定在隔膜的顶部和底部。
使用它们小心地将隔膜放置在后膛室旁边的前小法兰旁边。在关闭后膛之前，确保隔膜是直的并且位置正确。然后使用四个 M24 螺栓和螺母将其固定到位。
在无菌罩内，准备粘性透气膜，使每个膜都足够大，可以覆盖一个 35 毫升培养皿的顶部。然后，将包含三个实验样品的 90 毫升培养皿转移到通风橱中。从其中一个培养皿中吸出培养基，并用两个膜段覆盖，确保膜和培养皿边缘之间紧密密封。
将样品转移到 EVOC 装置上，并将其固定到夹具的底部，使培养皿的顶部与冲击管的内底座对齐。此时，戴上护耳器、护目镜、安全靴和实验室外套。通过顺时针转动调节器上的流量控制旋钮对减震管系统加压。
在控制面板的底部，选择双后膛入口以获得短持续时间的冲击波，或选择驱动管入口以获得更长的波持续时间。然后，打开直流电源和示波器，要求提供波形数据。接下来，使用控制面板对面墙上的开关打开安全灯，以通知其他研究人员在电击管充电时不要进入房间。
在电磁阀控制箱上，按下开关以关闭电磁阀。然后，在控制面板上，逆时针转动旋钮，逐渐增加压缩室内的压力，慢慢打开流量控制。当达到隔膜爆破压力时，隔膜会破裂并听到砰的一声。
听到此噪音后，快速关闭流量控制旋钮。然后，通过关闭电磁阀控制箱上的开关打开电磁阀，并关闭安全灯。将细胞样品转移到无菌通风橱中。
在那里，去除粘附性透气膜，并在培养皿中加入 2 毫升新鲜生长培养基。在每个实验皿中重新填充 2 毫升新鲜生长培养基后，直接向每个实验皿中加入 200 微升氧化还原指示剂。然后，将培养皿转移到标准培养箱中 4 小时。
孵育后，将每个培养皿中的两个 100 微升等分试样转移到适当的 96 孔板中。在荧光酶标仪上读取板，然后导出并保存数据。对于活细胞和死细胞的荧光成像，最初需要将细胞接种在 35 mL 培养板内的玻璃盖玻片上。
冲击波处理后，吸出培养基，并在 1 毫升 PBS 中洗涤细胞两次。然后，将 100 μL 活死试剂从成像试剂盒转移到每个样品中。并将细胞和试剂在室温下孵育，避光保存 15 分钟。
孵育后，去除试剂，并使用 1 毫升 PBS 洗涤细胞一次。使用细尖镊子，小心地从 35 毫升培养皿中取出盖玻片，并将其面朝下放在玻璃显微镜载玻片上。使用配备有数值孔径为 0.25 的 5X 物镜的荧光显微镜采集每个样品的图像。
然后，使用图像分析软件手动或自动计算每张图像中活绿色细胞和红色死细胞的数量。使用此处描述的方法，将单层生长的细胞暴露于由激波管产生的冲击波。激波管中的传感器显示在沿激波管的不同位置观察到的压力曲线。
使用氧化还原适应症测定，发现与对照组相比，127 kb 冲击波的应用能够在培养 24 小时后显着降低真皮细胞的活力。施加 72 千帕或更低的冲击波并没有降低活力。为了支持这些观察结果，活死细胞测定还表明，与对照相比，暴露于 127 kb 冲击波的细胞活力降低。
一旦掌握，这项技术就可以以每小时 60 个样品的速度快速完成。激波管可用于产生冲击波，以探索一系列原发性爆炸损伤。这些范围从急迫性肺到异位骨化，即骨骼在身体软组织内的不适当形成。
在尝试此程序时，请务必记住使用压缩气体和高能冲击波时所涉及的风险，并始终遵循正确的安全准则。对激波管进行微小的修改可以使我们能够改变激波。然后，我们可以评估细胞对不同压力曲线和强度的反应，这代表了不同的爆炸场景。
按照此程序，可以进行下一代测序来回答其他研究问题，例如，暴露于冲击波如何改变我们在细胞内的自然铭文？
概述
该协议研究冲击波对细胞活力的影响，旨在了解细胞对机械冲击的响应。通过使用定制的冲击管设备，该研究评估不同压力如何影响细胞单层。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 细胞生物学
- 机械损伤
背景
- 冲击波可以在细胞中造成初级爆炸伤害。
- 了解细胞对冲击波的响应对于损伤机制至关重要。
- 这种方法允许研究单个细胞类型而不是组织响应。
- 使用定制的冲击管设备来产生受控的冲击波。
研究目的
- 评估机械冲击对培养中的原代细胞的影响。
- 识别暴露于冲击波后改变的细胞机制。
- 评估细胞对冲击波的特异性响应。
使用的方法
- 培养细胞至80%融合度并准备暴露于冲击波。
- 组装冲击管设备并确保适当的安全措施。
- 在不同压力下产生冲击波并暴露细胞样本。
- 在孵育后使用荧光板读取仪分析细胞活力。
主要结果
- 观察到细胞类型对冲击波的不同响应。
- 评估暴露后的细胞活力以确定影响。
- 数据表明特定的细胞机制受到冲击暴露的影响。
结论
- 该方法提供了对细胞对机械冲击响应的见解。
- 研究结果可以为减轻爆炸伤害的策略提供信息。
- 进一步的研究可以扩展到不同的细胞类型和冲击参数。
常见问题
Executive Industry Relevance
This method enables biopharma R&D to model primary blast-induced cellular injury in a controlled in vitro system, supporting mechanistic de-risking of mechanosensitive pathways. By quantifying viability thresholds at defined overpressures, it provides predictive confidence for target validation in trauma and neuroinflammatory indications. The scalable shock wave platform facilitates early discovery screening of compounds that mitigate mechanical stress responses.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by linking defined mechanical stress inputs to viability outputs in primary cells.
- Operational Value: Enables functional target validation through dose-response assessment of shock wave effects on cell survival.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by establishing damage thresholds that inform go/no-go decisions for mechanoprotective candidates.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated monolayer systems for reproducible compound testing under controlled mechanical injury conditions.
- Operational Value: Delivers quantitative redox and live/dead readouts that enable assay standardization and Z'-factor assessment.
- Scalability: Supports medium-throughput workflows at 60 samples per hour, enabling platform reuse across multiple cell types and pressure profiles.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Bridges discovery findings to preclinical models by defining cellular responses that mirror primary blast injury mechanisms.
- Mechanistic De-risking: Identifies pressure-sensitive pathways that can be targeted to reduce late-stage failure in trauma-related indications.
- Biomarker Alignment: Enables transcriptional and epigenetic profiling post-shock to support translational biomarker discovery.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target hypothesis testing through lead identification, providing mechanobiological readouts that inform early compound evaluation.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by isolating mechanical shock as an independent variable to clarify stress-response pathways.
- Screening: Delivers assay-ready, standardized monolayers with quantitative viability outputs for reliable compound screening.
- Analytics: Generates fluorescence-based viability measurements and imaging data that enable condition comparison and EC50 estimation.
- Translational Research: Connects to preclinical work by defining cellular damage thresholds relevant to blast lung, brain injury, and heterotopic ossification models.
- Enterprise Reuse: Establishes a modular shock wave capability applicable across dermal, neural, and pulmonary cell systems for cross-program mechanobiology studies.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing ambiguity in mechanotransduction mechanism assignment.
- Operational Value: Ensures reproducibility through standardized shock wave generation and sealed sample presentation.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early de-risking of mechanoprotective targets before costly in vivo studies.
- Portfolio Impact: Informs risk-adjusted advancement decisions by providing quantitative thresholds for blast-induced cellular dysfunction.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cell culture, shock wave physics, and fluorescence-based viability assays.
- Needs shock tube instrumentation, pressure transducers, oscilloscopes, and sterile workflow infrastructure.
- Demands cross-team standardization between cell biology and biophysics groups for consistent pressure calibration.
- Involves adaptation considerations for suspension vs. adherent cells and tissue explants via rig modifications.
- Limited by the challenge of perfectly replicating in vivo blast dynamics, though useful for defining comparative thresholds and mechanism screening.
