Name: 单分子水平的高精度FRET用于生物分子结构测定 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-13T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 24 s
Description: 学习单分子水平的高精度FRET技术，用于测定NMDA受体配体结合域的三种构象状态。该方法结合多参数荧光检测实现精确距离测量，为受体动力学和结构生物学研究提供可靠工具。

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VJ 和 HS 感谢美国国立卫生研究院（NIH）R01 GM094246 项目对 VJ 的资助。HS 感谢克莱姆森大学创意探究项目（Creative Inquiry Program）以及克莱姆森大学光学材料科学与工程技术创新中心（Center for Optical Materials Science and Engineering Technologies）提供的启动资金。本项目还获得了墨西哥湾海岸联盟（Gulf Coast Consortia）跨学科生物科学培训凯克中心（Keck Center for Interdisciplinary Bioscience Training）培训奖学金（NIGMS 资助编号：1 T32GM089657-05）以及 Schissler 基金会常见人类疾病转化研究奖学金对 DD 的资助。本内容仅由作者负责，不代表美国国立卫生研究院的官方观点。

所有作者声明，他们对本文内容不存在任何竞争性经济利益。

本研究介绍了利用 PIE-MFD 单分子 FRET 实验对染料间距离进行高精度对齐、校准和测量的实验方案。通过精确校准所有仪器参数，可提高所测距离的准确性，并达到埃级精度。为此，采用多种多维直方图来分析并识别待进一步表征的群体。利用平均宏时间验证所测样品的稳定性，可对供体和受体的光漂白进行校正，并根据化学计量参数选择 FRET 群体。然而，受体的光物理性质可能随标记位置的不同而发生变化。因此，可利用 SPIE 分布对受体量子产率进行准确校正。准确的光物理表征对于确定伽马因子（ƴ）至关重要，该因子结合其他校正因子（例如，用于串扰的 α 因子和用于供体激光激发受体的 β 因子），可提高所测染料间距离的准确性。该方法通过两种设计的双链 DNA 标准样品进行了验证，与预期值相比，测得距离的准确性达到约 1 Å。
不同的染料选择需要调整显微镜的光学元件，例如二向色镜和带通滤光片，以匹配所选染料的合适光谱窗口。相应地，也需要选择合适的脉冲激光器。更重要的是，染料的选择至关重要，因为可能存在多种光物理伪影，例如受体和供体漂白、三重态或染料...

结构生物学研究的一个基本目标是揭示生物大分子机器结构与功能之间的关系。20世纪50年代，随着X射线晶体学的发展，人们首次获得了生物大分子（例如蛋白质和核酸）的可视化图像1,2。X射线晶体学可提供高分辨率的静态结构信息，但这些信息受到晶体堆积的限制。因此，X射线结构模型固有的静态特性忽略了生物大分子的动态本质，而这种动态特性对大多数生物学功能具有重要影响3,4,5。核磁共振（NMR）6,7,8通过在水溶液中解析结构模型，为这一问题提供了另一种解决方案。NMR的一大优势在于能够揭示生物大分子的内在动态特性和构象集合，有助于阐明结构、动力学与功能之间的内在联系3,4,5。然而，NMR受限于样品尺寸和所需样品量较大，对于较大的体系需要复杂的标记策略。因此，结构生物学领域迫切需要发展替代性方法。
从历史上看，由于人们误认为荧光共振能量转移（FRET）9 只能提供低精度的距离测量，因此它在结构生物学中并未发挥重要作用。本实验方案的目的在于重新审视 FRET 在纳米尺度距离测定方面的能力，使得这些距离数据可用于构建生物大分子的结构模型。1967 年，Stryer 通过测量不同长度的多聚脯氨酸作为“&#34;光谱尺&#34;”，首次在实验上验证了 FRET 效率与距离的 R-6 依赖关系10。类似实验于 2005 年在单分子水平上得以实现11。然而，多聚脯氨酸分子被证明并非理想材料，因此后续改用双链 DNA 分子进行研究12。这为精确的距离测量打开了新的窗口，也推动了利用 FRET 鉴定生物大分子结构特性的理念发展。
当染料间距离范围为约0.6–1.3时，FRET效果最佳 R0，其中 R0 是 Förster 距离。对于单分子 FRET 实验中常用的典型荧光染料， R0 约为50 Å。通常，与其他方法相比，FRET在解析和区分异质系统中的结构与动力学方面具有诸多优势：（i）由于荧光具有极高的灵敏度，单分子FRET实验13,14,15,16 可通过对单个组分直接计数并同时表征其结构，解析异质性集合体。（ii）单分子FRET研究能够直接解析复杂的反应路径，因为无需对集合体进行同步。（iii）FRET可覆盖时间尺度跨越10个数量级的广泛时域，适用于多种生物学相关的动态过程。（iv）FRET实验可在任意溶液条件下进行， 体外 以及 体内将FRET与荧光显微镜结合，可直接在活细胞中研究分子结构和相互作用15,16,17,18,19，即使具有高精度20. (v) FRET 可应用于几乎任意大小的体系（例如， 聚脯氨酸寡聚物21,22,23,24Hsp9025HIV逆转录酶26和核糖体27（vi）最后，可利用包含生物大分子所有维度信息的距离网络，来推导静态或动态分子的结构模型。18,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37.
因此，单分子FRET光谱可用于获得足够精确的距离数据，进而用于距离限制的结构建模26这可以通过利用多参数荧光检测（MFD）实现。28,38,39,40,41,42，利用八维荧光信息（即， 激发光谱、荧光光谱、各向异性、荧光寿命、荧光量子产率、宏观时间、荧光强度以及荧光团之间的距离）以准确且精确地提供距离限制。此外，脉冲交错激发（PIE）与多参数荧光检测（MFD）相结合（PIE-MFD）42 用于监测直接受激的受体荧光，并筛选出具有1:1供体-受体化学计量比样品中的单分子事件。典型的PIE-MFD装置采用两束脉冲交错激发激光器，连接至共聚焦显微镜主体，光子检测被分为四个不同光谱窗口和偏振特性的检测通道。更多细节见于 图1.
需要注意的是，必须将FRET与计算方法相结合，才能获得与FRET结果一致的原子级结构模型26,30。本实验方案的目的并非详述利用FRET衍生的距离构建结构模型的相关方法。然而，这些方法已与其他技术（例如，小角X射线散射或电子顺磁共振）结合使用，由此催生了整合结构生物学这一领域43,44,45,46。当前的目标是推动FRET成为结构生物学中一种定量分析工具。例如，该方法已被用于识别N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA）受体配体结合域（LBD）中的三种构象状态。最终目标是克服上述局限性，通过提供高精度的测量距离，使FRET成为生物大分子结构解析中常用的整合方法之一。

<table><tbody><tr><td>活性炭</td><td>Merck KGaA</td><td>K42964486 320</td><td></td></tr><tr><td>注射器滤器</td><td>Fisherbrand</td><td>09-719C</td><td>孔径：0.20 &amp;micro;m</td></tr><tr><td>多孔盖玻片</td><td>Fisher Scientific</td><td>155409</td><td>1.5 硼硅酸盐玻璃，8 孔</td></tr><tr><td>显微镜盖玻片</td><td>Fisher Scientific</td><td>063014-9</td><td>尺寸：24 × 60-1.5</td></tr><tr><td>无核酸酶水</td><td>Fisher Scientific</td><td>148859</td><td>无核酸酶</td></tr><tr><td>吐温-20</td><td>Thermo Scientific</td><td>28320</td><td>10% 聚山梨酯 20 溶液</td></tr><tr><td>受体 DNA 链（高 FRET）</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>178124895</td><td>5&amp;acute;-d(CGG CCT ATT TCG GAG TTG TAA ACA GAG AT(Cy5)C GCC TTA AAC GTT CGC CTA GAC TAG TCC AAG TAT TGC)</td></tr><tr><td>受体 DNA 链（低 FRET）</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>177956424</td><td>5&amp;acute;-d(CGG CCT ATT TCG GAG TTG TAA ACA GAG ATC GCC TT(Cy5)A AAC GTT CGC CTA GAC TAG TCC AAG TAT TGC)</td></tr><tr><td>供体 DNA 链</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>177951437</td><td>5&amp;acute; -d(GCA ATA CTT GGA CTA GTC TAG GCG AAC GTT TAA GGC GAT CTC TGT TT(Alexa488)A CAA CTC CGA AAT AGG CCG)</td></tr><tr><td>DNA 链（无 FRET）</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td></td><td>5&amp;acute; -d(CGG CCT ATT TCG GAG TTG TAA ACA GAG ATC GCC TTA AAC GTT CGC CTA GAC TAG TCC AAG TAT TGC)</td></tr><tr><td>PCR 仪</td><td>Eppendorf</td><td>E6331000025</td><td>nexus gradient</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 C5&amp;nbsp;Maleimide</td><td>Thermo Scientific</td><td>A10254</td><td>文中称为青绿色荧光团</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 C2&amp;nbsp;Maleimide</td><td>Thermo Scientific</td><td>A20347</td><td>文中称为远红荧光团</td></tr><tr><td>罗丹明 110</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>83695-250MG</td><td></td></tr><tr><td>罗丹明 101</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>83694-500MG</td><td></td></tr><tr><td>LB 培养基（Miller 配方）</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1426</td><td>用于培养 &lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt;</td></tr><tr><td>氨苄青霉素</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A0166</td><td>在选择性 LB 培养基中终浓度为 100 &amp;micro;g/mL，用于维持质粒筛选</td></tr><tr><td>四环素&amp;nbsp;</td><td>Calbiochem</td><td>58346</td><td>在选择性 LB 培养基中终浓度为 12.5 &amp;micro;g/mL，用于维持 Origami B(DE3) 菌株中的 gor（谷胱甘肽还原酶）突变，以促进二硫键氧化</td></tr><tr><td>卡那霉素</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP906-5</td><td>在选择性 LB 培养基中终浓度为 15 &amp;micro;g/mL，用于维持 B(DE3) 菌株中的 trxB（硫氧还蛋白还原酶）突变，以促进二硫键氧化</td></tr><tr><td>Origami B(DE3) 感受态细胞</td><td>Millipore</td><td>70837-3</td><td>适用于表达含二硫键蛋白的 &lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt; 感受态细胞</td></tr><tr><td>异丙基-&amp;beta;-D-硫代半乳糖吡喃糖苷（IPTG）</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1755</td><td>用于诱导 &lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt; 蛋白表达</td></tr><tr><td>HiTrap Chelating HP</td><td>GE Life Sciences</td><td>17-0409-01</td><td>用于大规模 FPLC 纯化带 His 标签的蛋白</td></tr><tr><td>咪唑</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>56749</td><td></td></tr><tr><td>Ni-NTA 琼脂糖&amp;nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>30210</td><td></td></tr><tr><td>PD-10 脱盐柱</td><td>GE Life Sciences</td><td>17-0851-01</td><td></td></tr><tr><td>AktaPurifier</td><td>GE Life Sciences</td><td>28406264</td><td>FPLC 仪器</td></tr><tr><td>透析袋</td><td>Spectrum labs</td><td>132562</td><td>截留分子量 15 kD，扁平宽度 24 mm，10 米/卷</td></tr><tr><td>二向色镜</td><td>Semrock</td><td>FF500/646-Di01-25x36</td><td>500/646 BrightLight</td></tr><tr><td>50/50 偏振分光棱镜</td><td>Qioptiq Linos&amp;nbsp;</td><td>G33 5743 000</td><td>10 × 10 薄膜偏振片</td></tr><tr><td>绿色通滤光片</td><td>Chroma</td><td>ET525/50m</td><td>ET525/50m，25 mm 直径安装座</td></tr><tr><td>红色通滤光片</td><td>Chroma</td><td>ET720/150m</td><td>ET720/150m，25 mm 直径安装座</td></tr><tr><td>功率计</td><td>ThorLabd</td><td>PM200</td><td></td></tr><tr><td>紫外-可见分光光度计</td><td>Varian</td><td>Cary300Bio</td><td></td></tr><tr><td>Fluorolog 3 荧光计</td><td>Horiba</td><td>FL3-22-R3</td><td></td></tr><tr><td>Fluorohub TCSPC 控制器</td><td>Horiba</td><td>Fluorohub-B</td><td>用于整体测量的 TCSPC 电子设备</td></tr><tr><td>NanoLed 485L</td><td>Horiba</td><td>485L</td><td>蓝色二极管激光器</td></tr><tr><td>NanoLed 635L</td><td>Horiba</td><td>635L</td><td>红色二极管激光器</td></tr><tr><td>Olympus IX73 显微镜</td><td>Olympus</td><td>IX73P2F</td><td>显微镜主体</td></tr><tr><td>PMA 40 混合探测器</td><td>PicoQuant GmbH</td><td>932200, PMA 40</td><td>优化用于绿色荧光检测</td></tr><tr><td>PMA 50 混合探测器</td><td>PicoQuant GmbH</td><td>932201, PMA 50</td><td>优化用于红移灵敏度检测</td></tr><tr><td>485 nm 激光器</td><td>PicoQuant GmbH</td><td>LDH-D-C-485</td><td></td></tr><tr><td>640 nm 激光器</td><td>PicoQuant GmbH</td><td>LDH-D-C-640</td><td></td></tr><tr><td>Hydraharp 400 及 TTTR 采集软件</td><td>PicoQuant</td><td>930021</td><td>皮秒事件计时器及时间相关单光子计数单元，包含 TTTR 采集软件</td></tr><tr><td>SEPIA II SLM 828 及 SEPIA 软件</td><td>PicoQuant</td><td>910028</td><td>用于皮秒脉冲的激光驱动器，包含 SEPIA 软件控制器</td></tr><tr><td>计算机</td><td>Dell</td><td>optiplex 7010</td><td>CPU：i7-3770，内存：16 GB</td></tr><tr><td>FRET 定位与筛选（FPS）软件</td><td>Heinrich Heine University</td><td></td><td>包含可在 http://www.mpc.hhu.de/software/fps.html 获取的可及体积计算器</td></tr><tr><td>MFD 套件</td><td>Heinrich Heine University</td><td></td><td>包含 BIFL 软件包 Paris；Margarita 用于多参数直方图可视化，以及可在 http://www.mpc.hhu.de/software/software-package.html 获取的概率分布分析软件</td></tr></tbody></table>

单分子水平高精度fret用于生物大分子结构测定

High Precision FRET at Single-molecule Level for Biomolecule Structure Determination

本文介绍了一种在多参数荧光检测（MFD）模式下单分子水平上利用荧光共振能量转移（FRET）进行高精度染料间距离测量的实验方案。MFD充分利用荧光的所有&#34;维度&#34;，以减少光物理和实验中的伪影，从而在刚性生物大分子中实现精度高达约1 Å的染料间距离测量。该方法已被用于鉴定N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA）受体配体结合域的三种构象状态，进而解释受体在配体结合后的激活机制。在将已知的晶体结构与实验测量结果进行比较时，对于更具动态性的生物大分子，两者差异小于3 Å。若能获得覆盖生物大分子全部构象维度的一组距离约束数据，则有望构建出动态生物大分子的结构模型。

在使用MFD装置的典型单分子FRET实验中（激光波长：485 nm，功率60 µW；640 nm，功率23 µW，见第5.1节），荧光样品被稀释至低皮摩尔浓度（10-12 M = 1 pM）并置于共聚焦显微镜中，通过亚纳秒激光脉冲激发在激发体积内自由扩散的标记分子。典型的共聚焦体积为 &lt;4飞升（fL）。在如此低的浓度下，每次仅能检测到单个分子。标记分子发出的荧光通过物镜收集，并利用针孔进行空间滤波。此步骤定义了一个有效的共聚焦检测体积。随后，信号在两个（或多个）不同的光谱窗口被分为平行和垂直分量。例如， “绿色”和“红色”）。每个光子探测器通道随后连接至时间相关单光子计数（TCSPC）电子系统，用于数据采集（图1).
完成MFD装置的校准（该步骤总结于表1中的第5–6步）后，即可开始对dsDNA标准品进行测量。随后，采用PIE-MFD分析多...

本文介绍了一种用于单分子水平高精度FRET实验的方案。此外，该方法还可用于鉴定N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA）受体配体结合域中的三种构象状态。精确测定距离是基于FRET实验构建结构模型的第一步。

单分子水平高精度FRET用于生物大分子结构测定

一种利用单分子水平上的荧光共振能量转移（FRET）进行高精度染料间距离测量的实验方案

本实验方案的总体目标是利用多参数荧光检测技术对F

high-precision-fret-at-single-molecule-level-for-biomolecule

Research

科研

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

单分子水平的高精度FRET用于生物分子结构测定

本文中，我们描述了如何利用自动扫描共聚焦显微镜，从固定在表面的单个DNA分子获得FRET轨迹。...

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本文提供了使用开源、低成本的 smfBox 对单个自由扩散的生物分子进行完全校正且精确的 FRET...

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自动化二维时空分析可移动单分子FRET探针

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荧光共振能量转移定位：一种阐明全局结构特征的新方法

本文介绍了在共聚焦显微镜模式下，利用单分子时间分辨荧光各向异性研究生物大分子局部柔韧性和动力学特性的实验方案。...

单分子时间分辨荧光各向异性用于表征生物大分子局部柔性

学习单分子水平的高精度FRET技术，用于测定NMDA受体配体结合域的三种构象状态。该方法结合多参数荧光检测实现精确距离测量，为受体动力学和结构生物学研究提供可靠工具。

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