Name: 在奥运电击鸡听觉脑干中 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 14 s
Description: 学习在鸡听觉脑干中进行卵内电穿孔技术，实现基因表达的时空精确调控。该方法有助于深入理解听觉神经元发育机制及相关病理生理现象，为听觉系统研究提供重要工具。

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我们感谢Leslayann Schecterson博士、Yuan Wang博士、Andres Barria博士以及Ximena Optiz-Araya女士在实验方案初期建立过程中提供的帮助以及质粒的提供。本研究工作由美国国立卫生研究院耳聋与其他沟通障碍研究所（NIH/NIDCD）资助项目DC013841（JTS）支持。

所有实验程序均经西北大学机构动物照护与使用委员会批准，并依照美国国立卫生研究院《实验动物照护与使用指南》进行。
1. 卵的处理
<ol>
	<li>从当地供应商处购买受精卵，并在孵化前将卵置于13 °C的冰箱中保存，保存时间不得超过5天。胚胎活力在1周后会显著下降。</li>
	<li>将卵放入孵化器前，用70%乙醇擦拭每个卵。</li>
	<li>将1-2打卵侧放于孵化器中，温度设定为38 °C，湿度约为50%。此条件可分别确保胚胎在电穿孔时的正确位置及最佳存活率。 
	注意：孵化48-52小时后，胚胎将处于Hamburger-Hamilton（HH）期约12-13期，适合进行电穿孔。</li>
</ol>
2. 准备
<ol>
	<li>质粒混合
	<ol>
		<li>加入 1 µL 0.1% 快绿（0.1% 溶于 18 MΩ 去离子蒸馏水）2O [ddH₂O]2O])，每 7 µL DNA 混合物。</li>
		<li>对于多个质粒的共电穿孔，将质粒按1:1的比例混合，最终DNA浓度应为5-8 µg/µL。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>填充注射移液管
	<ol>
		<li>使用微量移液器拉制仪拉制移液管。用28G注射器针头将1-2 µL质粒溶液吸入移液管中。</li>
		<li>用镊子将移液管尖端折断至10 - 20 µm。使用显微镜辅助判断断裂后移液管尖端的尺寸。将移液管连接至皮升注射仪的移液管固定装置上。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 开窗
注意：窗宽窗位处理步骤此前已有发表13。有关额外的视觉信息，请参见参考文献13。
<ol>
	<li>用70%乙醇擦拭所有仪器和工作区域。</li>
	<li>从培养箱中取出所需数量的受精蛋（6-10枚），置于室温下，并再次用70%乙醇逐个擦拭蛋壳表面。取出培养箱后，鸡蛋至少在2小时内仍保持活性。</li>
	<li>将鸡蛋置于光源照射器上方，以确定胚胎的位置。用铅笔标出深色区域（i.e.，胚胎）的中心位置。</li>
	<li>使用19G针头在鸡蛋的钝端打一个小孔。</li>
	<li>在鸡蛋尖端靠近所画圆圈处再打一个孔。用19G针头去除一小块外层蛋壳（约16 mm2），然后用镊子去除一小块内层蛋壳（约8 mm2）。</li>
	<li>将19G针头连接至3 mL注射器，从钝端的小孔中抽出1.5–2.5 mL蛋清。注意将针头以45°角向下插入。</li>
	<li>用一小块胶带（1 cm × 1 cm）封住钝端的小孔。用较大胶带（2.5 cm × 4 cm）覆盖所画圆圈及第二个孔。</li>
	<li>使用弯头剪刀（刀刃长度为2.5 cm），在圆圈范围内剪出一个窗口。剪刀应与蛋壳表面平行，窗口直径应小于2 cm。</li>
</ol>
4. 质粒注射
<ol>
	<li>打开微量喷射仪，将压力设置为 18 psi，持续时间为 5 µs。打开解剖显微镜的气罐和光源。</li>
	<li>配制 30 mL 储存液：将市售印度墨汁与无菌磷酸盐缓冲液（PBS）按 1:10 比例稀释，混匀后于 4 °C 保存。注射印度墨汁是清晰观察鸡胚的重要步骤。
	<ol>
		<li>用 1 mL 注射器吸取稀释后的印度墨汁溶液，安装 27G 针头，并排出注射器内的所有气泡。</li>
		<li>将针头插入卵黄膜下方，距离胚胎约 2–3 mm 处，轻柔地将约 0.2 mL 印度墨汁注射至胚胎下方。注射量不得超过 0.5 mL，以免降低胚胎存活率。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将已开窗的鸡胚蛋置于解剖显微镜下的蛋托上，使用最高放大倍数以清晰观察质粒注射位点。</li>
	<li>用镊子去除注射区域上方的膜组织。听觉脑干感兴趣区域（即，NM 和 NL）起源于菱脑节 5 和 6（R5/R6）。R5/R6 位于耳囊（脊椎动物胚胎中发育为内耳的结构）旁侧，耳囊可作为 R5/R6 区域质粒注射的解剖标志。</li>
	<li>使用显微操作仪将装有 DNA 的移液针插入覆盖于 R5/R6 区域且位于耳囊之间的神经管内。理想位置的示意图见 图 1A。</li>
	<li>通过微量喷射仪施加气压（18 psi，持续 5 µs），将 DNA 排入神经管内。</li>
</ol>
5. 电穿孔
<ol>
	<li>打开电流/电压刺激器。</li>
	<li>用 PBS 填充一支 3 mL 注射器，并安装注射器滤器。在胚胎上滴加 1–2 滴 PBS。</li>
	<li>使用显微操作器将双极电极移至胚胎位置，负极置于注射位点上方（内侧），正极置于 R5/R6 外侧（图 1A）。避免电极与胚胎直接接触。使用铂铱合金材料制成的双极电极。用镊子调节电极尖端间距至 0.5 mm。</li>
	<li>使用电流/电压刺激器，以 50 V 电压、1 ms 脉冲时长、1 s 间隔进行 20 次脉冲刺激。</li>
	<li>电穿孔后，在暴露区域滴加一滴 PBS。轻柔移除电极，并用实验室擦拭纸和 70% 乙醇清洁电极。用胶带封闭暴露胚胎的窗口。</li>
	<li>在蛋壳上标记所注射质粒类型及孵化日期。</li>
	<li>将鸡蛋放回孵育箱，窗口面朝上。在 38 °C、50% 湿度条件下孵育，直至达到所需发育阶段。</li>
	<li>若为实现基因表达的时间控制而电穿孔 tet-on 载体，则每 24 小时施用一次多西环素（Dox）以诱导基因表达（参见第 6 节）。</li>
</ol>
6. 用于基因表达时间调控的 Tet-on 系统
<ol>
	<li>使用以下质粒： 
	pCAGGS-T2TP：一种表达转座酶的质粒。 
	pT2K-CAGGS-rtTA-M2：一种稳定表达Dox结合蛋白的质粒。 
	pT2K-BI-TRE-EGFP：一种包含双向tet-on启动子（TRE）的质粒，可驱动EGFP报告基因和另一个目的基因的表达。 
	注意：上述三种质粒需以1:1:1的比例共电穿孔转染。</li>
	<li>储备液配制：
	<ol>
		<li>将Dox溶于无菌PBS中，配制成1 mg/mL的储备液，于-20 °C保存。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dox处理：
	<ol>
		<li>为在特定发育阶段诱导目的基因的表达，需每24小时施加一次Dox。</li>
		<li>施加Dox时，取出鸡蛋，打开窗口，用移液器将50 µL Dox滴加到绒毛尿囊膜上，封闭窗口后将鸡蛋放回培养箱。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
7. 脑干切片用解剖区域的准备
注意：以下章节（7 - 9）及操作步骤此前已发表14。如需更多视觉信息，请参阅这些参考文献。
<ol>
	<li>制备琼脂糖溶液（40 mg/mL 琼脂糖， 即 4% in ddH₂O2将琼脂溶液倒入培养皿中，室温下静置使其凝固。将盖好的琼脂平板置于冰箱中保存，以备后续组织脑干切片时使用。</li>
	<li>持续用95% O₂2 和5% CO2 （pH 7.2–7.4，渗透压：295–310 mOsm/L）</li>
	<li>用70%乙醇清洁工作区域和振动切片机，并用蒸馏水冲洗刀片。</li>
	<li>在工作区域放置一块干净的液体吸收垫，并备好相应的解剖工具。</li>
	<li>从冰箱中取出琼脂平板，切下一小块琼脂（10 mm × 10 mm × 8 mm）。使用市售的超级胶水将琼脂块粘附至振动切片机切片室的载物台上。</li>
</ol>
8. 鸡听觉脑干的分离
<ol>
	<li>在已贴胶带标记的窗口位置打开蛋壳。用解剖刀刺破膜囊，取出鸡胚的头部。</li>
	<li>用锋利的剪刀将鸡胚头部完全剪下。</li>
	<li>将剃刀刀尖置于眼睛稍后方位置，沿头尾方向的颅骨中线切开。根据胚胎的发育阶段施加轻微压力，发育较晚的胚胎需要更大的压力。</li>
	<li>轻轻拨开皮肤和羽毛，暴露颅骨，确认中线切口位置准确。</li>
	<li>施加较大力度，用剃刀切开颅骨的前部；立即将刀片移至眼睛后方，贯穿整个颅骨及脑组织进行切割。</li>
	<li>用剪刀在颅骨&#34;的后部区域从中线向两侧做切口，位置略位于颈部肌肉前方，两侧对称。通过掀开颅骨和去除多余组织，暴露大脑和小脑。</li>
	<li>用剪刀剪断与脑干相连的组织，取出脑干，脑干可从颅骨中自由分离。</li>
</ol>
9. 用于脑干切片的制备 体内 电生理学或成像
<ol>
	<li>通过视顶盖固定脑干。</li>
	<li>用剪刀切断小脑脚，移除小脑，暴露第四脑室的底部。</li>
	<li>使用镊子清除脑干表面的膜状组织和血管。</li>
	<li>为对脑干进行切块，在第四脑室底部最前端、皮层后方稍偏尾侧处做一水平切口；再通过视顶盖做垂直于该切口的侧向切割，以分离出脑干。</li>
	<li>在振动切片机载物台上、琼脂块正前方涂少量超级胶水。</li>
	<li>用镊子夹住脊髓端提起脑干，将其腹侧朝下、背侧朝向振动切片机刀片放置于胶水上。用实验纸巾或滤纸吸除多余胶水。</li>
	<li>将充氧人工脑脊液（ACSF）倒入振动切片机载物台中。将振动切片机刀片角度设为20–22°，启动最大振幅振荡模式。将载物台向上移动，使组织顶部与刀片保持平行。</li>
	<li>快速将刀片移向脑干组织，在刀片&#34;接触组织前显著降低推进速度。</li>
	<li>以尽可能慢的前进速度进行切片。当刀片完全穿过整个冠状组织切面后，用移液器轻轻取出切片。</li>
	<li>将载物台下降200–300 µm，再次切片。重复此过程，直至听觉核团的解剖标志清晰可见，例如核团NL特有的背侧/腹侧神经纤维网区域，以及NM相对于NL的内侧位置。</li>
	<li>小心维持切片在ACSF中。此过程可在室温（22°C）或接近生理温度（约41°C）的水浴条件下进行。注意记录切片顺序：第一片对应组织最尾侧区域，最后一片对应最头侧区域。这大致反映了听觉脑干从低频到高频编码区的拓扑性频率排列。</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

在卵内 电穿孔是一种通过表达或敲低目的基因以进行分析的方法 体内 基因功能8,9在鸡胚中，这是一种将质粒编码基因表达于不同听觉脑干区域的创新方法8为确保最佳表达效果，需遵循若干关键步骤。首先，仅注射耳囊清晰可见的胚胎；若耳囊不可见，则表明胚胎未达到电穿孔所需的正确发育阶段。其次，使用较细的移液管尖端更易于穿透神经管，且造成的组织损伤更小；但断裂的尖端应足够大，以确保DNA能够顺利排出。第三，需将快速绿溶液充分扩散至覆盖菱脑节5/6（R5/R6）区域的整个神经管内。最后，将刺激电极尽可能靠近胚胎放置至关重要，但须避免与胚胎直接接触，以防电流脉冲灼伤并损伤组织。
对技术方法的改进有助于提高胚胎的存活率和质粒的表达水平。首先，卵子应在到达后24小时内进行设置，以保持较高的存活率。其次，卵子的开窗处必须用胶带严密封闭，以防液体流失。即，脱水）导致密封不充分会增加胚胎死亡率。...

声音的快速神经编码对于正常的听觉功能至关重要。这些功能包括声音定位能力1、噪声中语音分辨能力2，以及其他具有行为学意义的通信信号的理解3。在鸟类和哺乳动物的听觉脑干中，存在功能类似的神经元，它们高度特化于快速神经编码4。这些神经元包括鸡的巨细胞核（nucleus magnocellularis, NM）、层状核（nucleus laminaris, NL），以及它们在哺乳动物中的对应结构——耳蜗腹前核（anteroventral cochlear nucleus, AVCN）和内侧上橄榄核（medial superior olive, MSO）5。然而，调控听觉脑干中快速神经编码的发育机制尚不明确。因此，研究负责快速神经编码的特定基因，有助于更深入地理解这些基因在听觉发育过程中的表达、调控及其功能。
发育中的鸡胚是研究听觉系统发育基本生物学问题的一种有效且成熟的实验工具6,7近年来，分子技术的进步通过在发育中的鸡胚中表达或敲低目标基因，以分析相关生物学问题 体内 基因功能8,9研究特定基因的调控作用是在理解与听觉功能障碍相关病理机制方面的重要进展。本文介绍 在卵内 将质粒编码的基因电穿孔至鸡听觉脑干中发生快速声音神经编码的区域10通过靶向与菱脑节5和6相关的听觉神经前体区域11,12 （R5/R6），我们展示了在NM和NL中对质粒转染的空间控制。此外，通过采用tet-on载体系统，实现了基因表达的时间调控。这是一种药物诱导方法，在存在多西环素（Dox）的情况下表达目的基因。8.

<table><tbody><tr><td>受精的白来航鸡鸡蛋</td><td>Sunnyside Inc. (Beaver Dam, WI)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Picospritzer</td><td>Parker Hannifin</td><td>052-0500-900</td><td>Picospritzer III，单通道或双通道</td></tr><tr><td>电流/电压刺激器</td><td>Grass Technologies</td><td>SD9</td><td>SD9</td></tr><tr><td>Microfil 注射器针头</td><td>World Precision Instruments</td><td>MF28G67-5</td><td>28 号规格，67 mm 长，（每包 5 支）</td></tr><tr><td>电极夹持器</td><td>Warner Instruments</td><td>64-1280</td><td>MP 系列：非电压力应用</td></tr><tr><td>刺激用微电极</td><td>FHC</td><td>PBSA1075</td><td>PBSA1075</td></tr><tr><td>空气罐/调压器</td><td>NU Laboratory Services</td><td></td><td>干燥空气 300 CF</td></tr><tr><td>快绿染料（Fast green）</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F7258-25G</td><td>F7258-25G</td></tr><tr><td>透明塑料胶带</td><td>Scotch</td><td>191</td><td></td></tr><tr><td>盐酸多西环素（Doxycycline hyclate）</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D9891-1G</td><td></td></tr><tr><td>鸡蛋冷藏箱</td><td>Vissani Wine Refrigerator</td><td></td><td>13.3 - 16.1 &amp;deg;C (56-61&amp;deg; F)</td></tr><tr><td>孵育箱</td><td>Hova-Bator</td><td></td><td>38 &amp;deg; C (100 &amp;deg; F)，约 50% 湿度</td></tr><tr><td>解剖显微镜</td><td>Zeiss</td><td>4.35E+15</td><td>SteREO Discovery V8 显微镜，50.4X</td></tr><tr><td>冷光源</td><td>Zeiss</td><td>4.36E+15</td><td>CL6000 LED</td></tr><tr><td>显微操作器</td><td>Narishige Japan</td><td>型号：MM-3</td><td>2 个显微操作器</td></tr><tr><td>毛细管</td><td>Sutter Instrument</td><td>BF150-86-10</td><td>厚壁硼硅酸盐玻璃（尺寸）</td></tr><tr><td>注射器</td><td></td><td></td><td>1 mL，3 mL</td></tr><tr><td>针头</td><td>BD Precision Glide&amp;nbsp;</td><td></td><td>27 G × 1 1/4，19 G × 1 1/2</td></tr><tr><td>镊子</td><td>Stoelting</td><td></td><td>No. 5 超细 Dumont 镊子</td></tr><tr><td>鸡蛋固定架</td><td>定制</td><td></td><td>使用黏土底座亦可</td></tr><tr><td>微电极拉制仪</td><td>Sutter Instrument</td><td></td><td>型号 P-97</td></tr><tr><td>注射器滤器</td><td>Ultra Cruz</td><td>sc-358811</td><td>PVDF 0.22 &amp;mu;m</td></tr></tbody></table>

在卵内 鸡听觉脑干中的电穿孔技术

In Ovo Electroporation in the Chicken Auditory Brainstem

电穿孔是一种将目的基因导入鸡胚等具有生物学意义的生物体内的方法。长期以来，鸡胚一直被公认为研究听觉系统发育基本生物学功能的有效研究模型。近年来，鸡胚在研究与听觉相关的基因表达、调控及功能方面变得尤为有价值。在体电穿孔可用于靶向负责高度特化听觉功能的听觉脑干区域，这些区域包括鸡的巨细胞核（NM）和层状核（NL）。NM和NL的神经元起源于菱脑节5和6（R5/R6）的不同前体细胞。本文介绍了通过在体电穿孔将质粒编码的基因导入上述区域，以研究与基因相关的特性。我们展示了一种可实现基因表达时空控制的方法，从而促进功能表型的获得或缺失。通过靶向与R5/R6相关的听觉神经前体区域，我们实现了在NM和NL中的质粒转染。通过采用tet-on载体系统，可实现基因表达的时间调控。这是一种药物诱导方法，在多西环素（Dox）存在的情况下表达目的基因。在体电穿孔技术结合生化、药理学或在体功能检测，为研究听觉神经元发育及相关病理生理现象提供了一种创新性方法。

我们在此表明 在卵内 电穿孔技术可实现基因在正常发育的生物系统中的表达。将质粒编码的基因局部注射至覆盖R5/R6区域的神经管内。图中展示了电极和移液管相对于重要解剖标志的位置示意图 图1A电穿孔后24小时确认质粒注射的正确位置，并在图中显示 图1B将质粒靶向注射至覆盖R5/R6节段的神经管，可实现特定听觉脑干区域（即核髓质（NM）和核外侧丘系（NL））的基因表达。(11). 图1C 显示一个 体外 E12 胚胎脑干切片在微分干涉差（DIC）照明下的图像。感兴趣的听觉区域已用轮廓标出。在荧光照明下（图1C1可见表达 YFP 的 NM 和 NL 内神经元。 图1D 显示高倍镜下E18胚胎的微分干涉差（DIC）成像。多个NM神经元典型的无树突细胞体清晰可见。在荧光照明下（图1D</s...

鸟类和哺乳动物的听觉脑干神经元专门负责快速神经编码，这是正常听觉功能的基本过程。这些神经元起源于胚胎后脑的不同前体细胞。本文介绍了利用电穿孔技术在鸡胚后脑中表达基因的方法，以研究基因在听觉发育过程中的功能。

电穿孔是一种将目的基因导入鸡胚等生物学相关生物体的方法。长期以来已确立……

本实验的总体目标是在鸡听觉脑干中实现基因表达在空间和时间上的精确调控。通过应用鸡胚内电穿孔技术，为研究听觉神经元的发育及其相关的病理生理现象提供了一种创新的方法。该技术可帮助您解答听觉神经发育领域中的关键科学问题，例如：基因表达的调控如何促进或导致表型的获得或缺失，而这些表型正是听觉脑干正常发育所必需的。演示该实验步骤的是我实验室的博士后研究员Ting Lu医生。首先，通过在每七微升DNA混合物中加入一微升的Fast Green溶液来制备质粒溶液。接下来，将DNA溶液按1:1的比例混合，以实现多个质粒的同步电穿孔转染。质粒溶液制备完成后，使用显微拉针仪制备玻璃微电极。然后用28号注射器针头将一至两微升质粒溶液注入微电极中。使用镊子将微电极尖端折断至10至20微米，并在显微镜下确认尖端大小，随后通过微电极夹持器将微电极连接至压电喷射仪。在操作前，将从当地供应商购买的鸡蛋置于13摄氏度的冰箱中保存，时间不超过五天。开始时，用70%乙醇对鸡蛋进行消毒，然后为获得适当的胚胎定位，将鸡蛋侧放于38摄氏度、相对湿度约50%的环境中孵育，以确保最佳存活率。孵育48至52小时后，当鸡蛋发育至Hamburger-Hamilton分期约12至13期时，用70%乙醇对操作区域及所有器械进行消毒。然后将鸡蛋从培养箱中取出，在室温下放置，并用70%乙醇再次擦拭。使用透射光源，找到胚胎的位置（表现为一个深色区域），并用铅笔在其中心周围画一个圆圈进行标记。用19号针头在鸡蛋的钝端打一个小孔，然后在鸡蛋尖端靠近所画圆圈的位置再打第二个孔。使用19号针头取下外层蛋壳的一小块，再用镊子取下内层蛋壳膜的一小块。接着，将连接在3毫升注射器上的19号针头从蛋的钝端小孔插入，抽出1.5至2.5毫升的蛋清。用一块1厘米×1厘米的胶带封住蛋钝端的小孔，然后用一块2.5厘米×4厘米的胶带覆盖已画出的圆圈和第二个小孔。使用刃口长度为 2.5 厘米的弯头剪刀，并保持剪刀与蛋壳平行，在已标记的圆圈内切出一个窗口。为注射质粒，打开皮升注射仪（picospritzer），调节仪器参数，以 18 PSI 的压力持续 5 微秒，然后打开气罐，并开启解剖显微镜的照明灯。接下来，将市售的印度墨水用无菌 PBS 配制 30 毫升的储备液。用1毫升注射器吸取印度墨水溶液，然后安装27号针头，并排出注射器中出现的任何气泡。为观察胚胎，将针头插入卵黄膜下方，距离胚胎约2至3毫米处，注入约0.2毫升印度墨水。随后将开窗的鸡蛋转移至蛋托中，置于解剖显微镜下，并切换至最高放大倍数，以获得质粒注射部位的最佳视野。用镊子移除覆盖注射区域的膜。找到听囊，并以其为解剖标志，识别邻近的第五和第六菱脑节（rhombomeres 5 和 6），耳蜗大细胞核（nucleus magnocellularis）和层状核（nucleus laminaris）即起源于此区域。使用显微操作仪，将含有 DNA 的移液管定位至听囊之间、覆盖 R5-R6 区域的神经管内。使用皮升注射仪将DNA注入神经管。开始电穿孔前，先打开电压刺激器，然后将0.22微米的注射器滤器连接至预先装有3毫升PBS的注射器上，并将一到两滴过滤后的PBS滴加到胚胎上。随后，使用显微操作器将双极电极移向胚胎，将负极置于注射部位上方，同时将正极置于R5-R6节段的侧方。使用电压刺激器，以50伏特电压施加20次脉冲，每次持续1毫秒，间隔1秒。你会在电极尖端附近观察到气泡。电穿孔后，在暴露区域滴加一滴PBS，轻轻取出电极，并用实验室纸巾和70%乙醇清洁电极，然后用胶带封住覆盖在胚胎上的窗口。最后，记录注射的质粒类型以及蛋壳上的孵化日期，并将鸡蛋放入孵育箱中，窗口朝上。在38摄氏度、50%湿度条件下孵育鸡蛋，直至达到所需的发育阶段。电穿孔24小时后，从孵育箱中取出鸡蛋，打开窗口，使用体视显微镜确认目标质粒注射位置正确。如果使用了Tet-on载体，用移液器将50微升多西环素滴加到尿囊绒毛膜上，封闭窗口，然后将鸡蛋放回孵育箱中。图中展示了在胚胎发育第12天的鸡脑干切片，分别在微分干涉差（DIC）照明和荧光照明下拍摄的照片。在脑干切片中可以辨认出巨细胞核和层状核。在荧光照射下，两种结构均显示出黄色荧光蛋白的表达，证实了电穿孔基因的有效空间表达。在来自胚胎第18天鸡的脑干切片（包含巨细胞核）中，也可观察到电穿孔基因的表达。在80倍放大下，通过微分干涉差显微镜观察可清晰看到典型的无树突细胞体。树突状细胞体显示出黄色荧光蛋白的表达，进一步证明了在卵内电穿孔技术可诱导特定听觉脑干区域的基因表达，从而用于听觉神经元发育的研究。一旦掌握并正确操作，该技术可在约两到三小时内完成，适用于约12枚具有活性的鸡胚蛋。在完成该操作后，可进一步采用生化、药理学以及体外-体内功能检测等其他方法，以回答有关基因表达表型如何调控正常听觉脑干发育的更多科学问题。观看本视频后，您应能充分理解如何在鸡听觉脑干中实现基因表达的空间和时间控制。在卵内电穿孔技术可实现对听觉脑干发育过程中解剖和生理特化以及明确时间阶段的遗传调控。

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发育生物学

在奥运电击鸡听觉脑干中

鸡胚体内电穿孔是一种能够对禽类胚胎进行遗传操作的技术。该技术的常见应用包括基因及假定增强子元件的功能分析。本视频展示了在HH...

鸡胚HH10期在卵电穿孔实验

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利用 in ovo 电穿孔技术解析鸡胚神经管中遗传定义神经元群体的轴突通路

鸡的听觉脑干由负责双耳声音处理的核团组成。单个冠状切片制备可保持完整的神经环路，而培养方法则为在分子、细胞和网络水平上研究神经元结构和听觉功能的发育提供了独特的制备手段。...

鸡听觉脑干切片的制备与培养

本视频的总体目标是展示如何在汉普格尔和哈密尔顿22-23期（约胚胎发育第4天，E4）对鸡胚视网膜进行靶向视网膜注射以及in...

在卵内 鸡胚视网膜电穿孔技术

为了评估中脑多巴胺能神经元发育过程中基因的功能及其调控机制，我们描述了一种方法，该方法涉及将质粒DNA构建体进行卵内电穿孔转染至鸡胚中脑腹侧多巴胺能神经元前体细胞中。in ovo...

in ovo 鸡胚中脑电穿孔技术用于研究多巴胺能神经元发育中基因功能

听觉器官介导听觉功能。本文介绍了一种改良的 在卵内 用于研究发育中鸡听觉器官内听觉前体细胞增殖与分化的优化微电穿孔方法...

通过 in ovo 微电穿孔法将基因导入鸡听觉器官

本文介绍了一种获取鸡胚非冠状位听觉脑干切片的实验方案，用于在单个脑干切片中研究听觉频率拓扑特性（tonotopic...

切片胚胎鸡听觉脑干以评估音调拓扑梯度与微环路

我们采用了标准的听觉脑干反应（ABR）技术，并将其应用于雏鸡，这是一种听觉功能的早熟鸟类模型。该方案详细阐述了动物准备和ABR信号采集的技术步骤，这些步骤可推广至其他鸟类或啮齿类动物模型。...

雏鸡听觉脑干反应的评估

鸡是一种经济、易得且广泛可用的模式生物，适用于多种研究。本文详细描述了一系列实验方案，旨在揭示禽类内耳发育与再生的分子机制。...

In Ovo 与 Ex Ovo 研究禽类内耳发育的方法

通过在卵内电穿孔技术，我们建立了一种方法，可在鸡胚发育过程中特定电路组装阶段，选择性地转染听觉内耳及耳蜗核，实现细胞群特异性的脆性X智力低下蛋白敲低。...

通过听觉环路解析脆性X智力低下蛋白的细胞自主功能 在卵内 电穿孔

学习在鸡听觉脑干中进行卵内电穿孔技术，实现基因表达的时空精确调控。该方法有助于深入理解听觉神经元发育机制及相关病理生理现象，为听觉系统研究提供重要工具。

在卵内鸡听觉脑干中的电穿孔技术

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