光片为主的生活的荧光显微镜或固定和染色赤拟谷盗胚胎

该协议的总体目标是在很长一段时间内无创观察 Tribolium castaneum 胚胎的发育。基于光片的荧光显微镜有助于回答新兴昆虫模式生物 Tribolium castaneum 中的形态发生相关问题，解决从早期胚层到肌肉运动开始的细胞迁移和增殖模式。这种方法的主要优点是即使观察胚胎数天，光漂白和光毒性等关键因素也被保持在最低限度。

要使用琼脂糖柱将胚胎安装到样品室中，首先用蒸馏水填充 1 毫米注射器，然后使用小橡胶软管将注射器连接到玻璃毛细管上。用蒸馏水填充毛细管一半，然后使用油漆刷将胚胎转移到玻璃毛细管开口的内侧，并将毛细管插入液体琼脂糖中，慢慢将几微升琼脂糖与胚胎一起吸入毛细管。当胚胎就位时，胚胎上方和下方都应该有几微升琼脂糖。

当琼脂糖凝固时，将毛细管缩短至约 5 毫米的长度。剩余的片段应完全充满琼脂糖，胚胎应在第二个四分位数内找到。然后将带有针的钢筒插入样品室，并将毛细管碎片粘在针的顶部，琼脂糖柱应从包含胚胎的毛细管碎片区域突出几毫米。

要使用琼脂糖半球将胚胎安装到样品室中，首先将 200 微升液体琼脂糖吸入 1 毫米注射器中，然后使用注射器从管道顶部用琼脂糖填充样品室的钢管，直到在底部开口处形成半球。当琼脂糖凝固后，用画笔的尖端拾取胚胎并重新排列胚胎，以便可以接触到前端。将琼脂糖半球浸入液体琼脂糖中，用薄膜覆盖半球，并将胚胎的前端直立在琼脂糖半球的极上。

转动钢管，根据需要使用刷子纠正胚胎的位置。理想情况下，胚胎表面的不到一半应被琼脂糖覆盖，并且侧面应尽可能陡峭。胚胎表面过多的琼脂糖会导致机械收缩和气体和离子交换减少，这对胚胎的存活率有很大影响。

然后将钢管慢慢插入样品室。要使用蜘蛛网支架将胚胎安装到样品室中，首先用画笔选择一个胚胎，然后将画笔放在一边。接下来，用 5 到 8 微升液体琼脂糖覆盖蜘蛛网支架的槽孔，然后去除大部分琼脂糖，直到只剩下一层薄薄的琼脂糖膜。

将胚胎放在琼脂糖膜上并调整其位置，小心地将胚胎移动到槽孔的 x 轴中心，并将其细长的前后轴与槽孔的细长轴对齐。确保在应用后 10-15 秒内将胚胎放在琼脂糖膜上，即琼脂糖仍为液体时，否则将无法正确附着。然后慢慢地将 Cobweb 支架插入样品室，调整支架的位置，使其不会干扰激发光和发射光。

对于实时成像分析，首先配置延时摄影，然后在透射光模式下，将胚胎沿 X 轴和 Y 轴定位到视野中心，而无需将胚胎暴露在激光下。以 90 度的步长将胚胎旋转 360 度，以检查组织在安装过程中是否可能发生任何损伤。在荧光模式下，定义每个方向的 Z 堆栈，在胚胎前后添加 25 到 50 微米的空间缓冲区，并定义 Z 间距。

对于长期成像，请确保样品室中装满了足够的成像缓冲液并盖住样品室开口。然后开始成像过程，监测所有胚胎的所有通道中所有方向的正确采集。在成像期结束时，从样品室中取出样品架，并将胚胎转移到载玻片上。

如果使用琼脂糖柱，请使用锋利的刀片从周围的琼脂糖中提取胚胎。如果使用琼脂糖半球，请将具有平坦面的半球转移到对象载玻片上。对于蜘蛛网支架方法，使用油漆刷轻轻地从琼脂糖膜上去除胚胎。

然后在标准条件下，在饱和湿度气氛中，在小玻璃盘中孵育加载胚胎的物体载玻片，直到幼虫孵化。要处理观察到的胚胎的数据，请在适当的成像分析软件中打开感兴趣的文件，并根据需要旋转 Z 堆栈以将胚胎的前后轴与 Y 轴对齐。沿 X 轴和 Y 轴裁剪 Z 堆栈，以便只剩下最小的背景，然后计算每个 Z 堆栈的 Z 最大投影。

然后，根据转基因品系和成像方式，对时间堆栈进行适当的动态强度调整，以根据需要校正任何光漂白或菌群的表达波动。使用表达组蛋白 2B M-Emerald 融合蛋白的转基因系，在 α-微管蛋白 1 个启动子的控制下，记录了室温下从生殖带回缩到背侧闭合的 66 小时胚胎发育。该增强子陷阱线可用于可视化头部附件内的神经元簇和背侧闭合期间卷曲迁移的动力学。

对携带相同转基因但基因组位置不同的相似转基因系进行成像，从原肠胚形成到生殖带伸长的转变的光学切片显示了新兴生殖带的内部细胞排列。使用神经胶质蓝转基因系，通过样品旋转沿多个方向获取 Z 堆栈，可以观察沿腹侧神经索和腹侧神经胶质细胞的重组，以及它们在同一胚胎中头叶背侧的增殖动力学。小荧光染料也可用于细胞间结构的特异性标记，以突出某些胚胎特征，例如肝硬化 gar、后腹侧肝硬化细胞或浆膜窗关闭期间出现的浆膜羊膜生殖带组织三层。

双色荧光染料染色允许进一步观察同一胚胎中的两个细胞间结构。例如肌动蛋白细胞骨架和核膜。记录完成后，对于实验的质量控制来说，取回胚胎并将其培养成健康、有生育能力的成年人非常重要。

该程序可以与其他技术（如亲本 RNA 差异）结合使用，以分析敲低的表型。