利用DNA染料诱导的侧群表型从生物样本中检测和纯化肿瘤干细胞

本实验的总体目标是基于侧群细胞的染料外排能力，在生物样本中检测潜在的肿瘤干细胞群体。该方法针对肿瘤干细胞研究中的一个关键问题，即如何从生物样本中可靠地检测和纯化肿瘤干细胞。该技术的主要优势在于利用功能性标志物，从而提供更高的分辨率。

此外，这些 ABC 药物转运蛋白在肿瘤干细胞中高度保守，因此该技术可应用于多种不同的癌症类型。该技术的应用前景在于促进抗肿瘤干细胞治疗药物的发现，因为它有助于对高度纯化的肿瘤细胞进行基因表达谱分析和靶点验证等下游分析。因此，该方法可为揭示肿瘤干细胞的特性提供重要信息。

我们还可以利用该方法对表达ABC药物转运蛋白的群体（如骨髓）组成的系统进行表征。演示该实验步骤的是我实验室的技术员Elisabeth Hoflehner。首先，在37摄氏度条件下，将所需的人类癌细胞系接种于10至30毫升RPMI 1640培养基中进行培养，培养基需添加10% FBS、2 mM L-谷氨酰胺和抗生素。

当细胞融合度达到约70%至90%时，移除培养基，并加入2毫升0.05%胰蛋白酶-EDTA，使细胞从培养皿表面脱落。随后，用10毫升培养基洗涤细胞，将细胞悬液转移至洁净的15毫升离心管中，在4°C下以250 × g离心5分钟。待细胞沉淀形成后，弃去上清液，并将沉淀重悬于1毫升培养基中。

取少量细胞悬液与台盼蓝溶液混合，使用血细胞计数板进行细胞计数。为制备测试样品，将细胞重悬于新鲜培养基中，制成浓度为1 × 10⁶ 个细胞/毫升的细胞悬液。调整细胞密度后，取3毫升样品转移至已标记为“测试”的15毫升圆底试管中。

然后，向样品中加入 10 µM 的紫色染料，并轻轻涡旋混匀悬浮液。接下来，取含有染料的细胞悬浮液 500 µL，转移至两支标记为对照的流式细胞术管中，以制备抑制对照。向第一管中加入 50 µM 的维拉帕米。

向第二个试管中加入20微摩尔的Fumitremorgin C。用移液器轻轻吹打混合溶液。将所有试管盖上盖子，在37°C避光条件下孵育90分钟。

每15分钟轻轻振荡样品一次。染色完成后，用3至4毫升预冷的PBS洗涤抑制对照样本，并将待测样本分装，用于后续与抗体的共染色实验。

同样洗涤此分装样品，并通过70微米滤网过滤所有样品，以去除潜在的细胞聚集体。然后在4°C条件下以250 × g离心5分钟。将所得沉淀重悬于100 µL PBS中后，将细胞置于冰上并避光保存。

接下来，向已用紫色染料预染色的细胞中加入一组合适的荧光染料偶联抗体。涡旋混匀悬液，并在4摄氏度避光条件下孵育20至30分钟。孵育结束后，用三到四毫升预冷的PBS洗涤细胞，必要时对样品进行过滤。

然后在 4°C 条件下以 250 × g 离心 5 分钟。弃去上清液，并将沉淀的细胞重悬于 100 µL PBS 中。最后，向经紫染料预染色的细胞中加入 7-AAD。

在避光条件下将样品孵育5至10分钟。使用流式细胞仪分析细胞时，先在FSC与SSC点图上圈选适当的细胞群体，然后根据不同的FSC信号，从选定的群体中排除所有细胞聚集体。

排除显示 7-AAD 染色阳性的细胞，以获得活细胞群体。要创建蓝色和红色染料发射的散点图，请将蓝色荧光通道显示在 y 轴上，红色荧光通道显示在 x 轴上。将两个通道均切换至线性模式，并相应调整检测器电压，使侧群位于图的左下部分。

然后，圈定侧群细胞，并停止数据采集。接着，加载抑制对照样本并采集数据。

最后，创建一个点图，横轴显示紫染料的红色荧光，纵轴显示适当的荧光通道，均以对数模式绘制。加载样本后，相应调整检测器电压，并鉴定表达目标表面标志的侧群细胞比例。然后，记录数据。

本文展示了在人卵巢癌细胞中进行的侧群细胞分析的代表性结果。通过分析蓝色和红紫色发射光，在点图的左下象限中识别出侧群细胞，占整个分析细胞群体的0.70%。后续使用外排抑制剂后，先前识别细胞中观察到的荧光信号消失，证实了这些细胞具有侧群细胞表型。

最后，还对人卵巢细胞的ABCG2表达进行了表征。在0.67%的细胞中观察到ABCG2阳性染色，这些细胞对应于所鉴定的侧群细胞。一旦掌握，该操作若正确进行，大约可在两到三小时内完成。

在尝试该实验操作时，需牢记侧群细胞表型严格依赖于染料浓度与细胞密度之间的最佳比例。因此，强烈建议在实验前对这两个变量进行充分优化。完成该操作后，可进一步开展基因表达谱分析等其他方法，以深入表征侧群细胞，从而为未来药物研发鉴定新的癌症干细胞特异性靶点。

该技术问世后，为干细胞生物学领域的研究人员探索小鼠和人类组织干细胞及癌症干细胞的特性开辟了道路。观看本视频后，您应能够熟练掌握紫染料诱导的侧群SA实验操作，并了解如何在您自己的实验室中检测生物样本中的潜在癌症干细胞。请务必注意，操作生物样本可能具有极高危险性，在进行本实验时应采取相应防护措施，例如穿戴个人防护装备（PPE）并使用生物安全柜。