Name: 利用DNA染色体引发的侧群体表型，从生物样品中检测和纯化癌细胞 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-10T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 57 s
Description: 学习利用侧群体表型从生物样品中检测和纯化癌细胞的方法。该技术基于ABC药物转运蛋白介导的染料外排能力，可在2-3小时内完成，适用于多种癌症类型的癌症干细胞鉴定与下游分析。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Maximilian Boesch 获得奥地利科学基金 FWF 的埃尔温·薛定谔奖学金（项目编号 J-3807）资助。

本方案完全符合标准的机构伦理审查委员会指南。若使用本方案中所述方法研究人体或动物组织，研究人员必须获得其所在机构或国家相关审查委员会的批准。
注意：本实验方案适用生物样本安全操作的标准预防措施。包括佩戴手套和实验服，并在尽可能的情况下于生物安全柜内进行操作。
1. 细胞的制备
<ol>
	<li>癌细胞系
	<ol>
		<li>在37 °C条件下，使用10–30 mL适当的培养基培养相应的人或小鼠癌细胞系（例如，RPMI 1640 培养基添加 10%（v/v) 胎牛血清（FBS）、2 mM L-谷氨酰胺和1×青霉素/链霉素）并在细胞亚汇合时收获细胞（即&#160;70-90%），可使用0.05%胰蛋白酶-EDTA消化或其他细胞解离方法。使用计数板和台盼蓝染色法测定细胞数量并检测细胞活力，活细胞比例应超过85%。 
		注意：携带SP的人类癌细胞系示例&#160;细胞系包括 MCF7/HTB-22 和 SKBR3/HTB-30（乳腺癌）、A2780 和 SKOV-3/HTB-77（卵巢癌），以及 A549（肺癌）26.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>离体 肿瘤组织
	<ol>
		<li>取新鲜的手术肿瘤标本，或 alternatively 从可移植性或基因工程小鼠肿瘤模型中获取肿瘤组织。取 200–1,000 mg 组织，通过机械解离法制备单细胞悬液（例如，使用剪刀或手术刀）和酶消化（例如，使用胶原酶/分散酶/DNase 混合酶溶液。</li>
		<li>通过70 µm孔径的滤网过滤样品。使用计数板和台盼蓝染色法测定细胞数量并检测细胞活力。 
		注意：消化液通常含有 200 µg/mL 胶原酶 P、0.8 U/mL 中性蛋白酶和 25 µg/mL DNase I，孵育时间通常为 20 至 50 分钟。理想情况下，组织解离应根据针对所研究组织优化的实验方案进行 27,28,29.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 测试样品
<ol>
	<li>将细胞浓度用新鲜培养基调整至 1 × 106 个细胞/mL（使用含营养成分的载体非常重要，因为染料外排是一个需要能量的主动过程）。最后，将 1 mL 样品转移至普通的流式细胞术/FACS 圆底管中（标记为“测试”）。
	 
	注意：为获得最佳结果，可能需要对细胞浓度进行滴定（例如 5 × 105、1 × 106、2.5 × 106 个细胞/mL），但通常较低的细胞浓度可获得更高的分辨率19。仅在分选应用中需要回收最大数量的SP细胞时，建议将细胞浓度提高至最高 1 × 107 个细胞/mL。</li>
	<li>向样品中加入 10 µM DCV，并充分混匀，可通过轻柔涡旋或重悬 3–5 次实现。随后进行抑制对照实验。
	 
	注意：最佳结果可能取决于诱导染料的滴定浓度（例如 2.5、5、10、20 µM），但通常较高的染料浓度可获得更高的分辨率19。</li>
</ol>
3. 抑制对照
<ol>
	<li>将250 µL含染料的细胞悬液转移至新的流式细胞术/FACS圆底管中（标记为“对照”）。加入50 µM维拉帕米或20 µM FTC，用移液器充分混匀。 
	注意：维拉帕米和FTC是SP分析中最常用的抑制剂，但对不同外排泵具有特异性：维拉帕米可抑制多种ABC药物转运蛋白，包括ABCB1和ABCB5，而FTC特异性抑制ABCG26,19。若样本的SP状态未知，建议在不同的管中分别使用维拉帕米和FTC。</li>
</ol>
4. 染色
<ol>
	<li>将“实验”管和“对照”管均盖紧，在37 °C避光孵育90分钟，每15分钟轻柔振荡一次。SP细胞中的大部分染料外排将在前45分钟内完成，但非SP细胞中的染料积累（有助于分辨）需在75–90分钟后才达到最大值19。</li>
	<li>染色完成后，用3–4 mL预冷的PBS洗涤细胞，并将细胞沉淀重悬于100 µL PBS中。保持细胞避光并置于冰上冷却，随后进行其他标记物的染色。或者，可直接进行流式细胞术分析。</li>
</ol>
5. 其他标记物的共染色
<ol>
	<li>向DCV染色的细胞中加入所需的一组荧光染料偶联抗体，充分混匀后，在4 °C避光孵育20-30分钟。用3-4 mL预冷的PBS洗涤细胞，随后进行死细胞区分。 
	注意：与DCV兼容性良好且几乎无需补偿的抗体荧光染料形式包括PerCP或PerCP-Cy5.5、PE-Cy7、APC、Alexa Fluor 647、APC-Cy7、APC-H7、BV711、Alexa Fluor 750和BV786。与DCV兼容但可能需要补偿的形式包括FITC、Alexa Fluor 488、PE和BV650。几乎不与DCV兼容的形式包括BV421、V450和V500。</li>
	<li>按照特定生产商推荐的浓度，向DCV染色的细胞中加入7-AAD（或PI），避光孵育5-10分钟。将样品通过70 µm孔径的滤网过滤后，进行流式细胞术分析。</li>
</ol>
6. 流式细胞术分析
注意：建议在染色过程中即开启相应的流式细胞仪，以便样本准备就绪时所有设置已完成。这包括系统的常规维护程序，如系统性能监测和储液罐的补充。
<ol>
	<li>在流式细胞仪上获取细胞，并在双变量FSC/SSC点图（图1B）上设门。通过比较FSC的不同信号排除双联体和聚集体即&#160;高度、宽度、面积（图1C）。
	<ol>
		<li>如果已加入死细胞标记物，则对活细胞组分进行圈选（例如，7-AAD阴性）图1D）。在“蓝色”和“红色”DCV发射的双变量点图上观察可存活的单细胞。为此，将“蓝色”荧光通道显示在y轴上例如，450/50）以及横轴上的“红色”荧光通道（例如, 525/50).</li>
		<li>将两个通道均切换至线性模式，并相应调整检测器电压，使SP位于 侧面 位于左下象限的区域。相反，非SP细胞位于右上象限，反映其细胞周期分布（G1和G2期）。圈选SP细胞并停止采集（图1E). 
		注意：可使用配备紫色激光激发源的流式细胞仪检测由DCV定义的SP细胞即&#160;405 nm 激光线）。SP 分析的一个特定之处在于，发射荧光以线性模式在两个独立通道中进行检测，并显示在双变量点图上。DCV 的“蓝色”发射光在约 450 nm 处检测例如，使用450/40标准滤光片）和DCV的“红色”发射光在约510 - 585 nm处测量（例如，使用510/50、525/50或585/15滤光片）19由于该检测的特殊化学性质，SP细胞与非SP细胞在“红色”荧光通道中的分离效果通常更明显19.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>加载抑制对照并采集数据。此时，SP细胞已消失或显著减少（图1F如有必要，根据这些数据优化SP门。</li>
	<li>为研究SP细胞的表面标志物表达，将DCV的“红色”荧光保留在x轴上，并在y轴上以对数模式显示相应的荧光通道（例如，APC）。相应调整检测器电压，并圈选对所研究标志物（s）染色呈阳性的SP细胞亚群（图1G）。SP细胞共表达特定标记物时，会在图中左上象限产生相应的信号30.</li>
	<li>记录数据和/或分选SP细胞。</li>
</ol>

<ol><li>Pattabiraman, D. R., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tackling+the+cancer+stem+cells+-+what+challenges+do+they+pose%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Tackling the cancer stem cells - what challenges do they pose?</a> Nat Rev Drug Discov. 13 (7), 497-512 (2014).</li>
<li>Boesch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneity+of+Cancer+Stem+Cells%3A+Rationale+for+Targeting+the+Stem+Cell+Niche%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Heterogeneity of Cancer Stem Cells: Rationale for Targeting the Stem Cell Niche.</a> Biochim Biophys Acta. 1866 (2), 276-289 (2016).</li>
<li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suppression+of+cancer+relapse+and+metastasis+by+inhibiting+cancer+stemness%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Suppression of cancer relapse and metastasis by inhibiting cancer stemness.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (6), 1839-1844 (2015).</li>
<li>Greve, B., Kelsch, R., Spaniol, K., Eich, H. T., Götte, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometry+in+cancer+stem+cell+analysis+and+separation%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Flow cytometry in cancer stem cell analysis and separation.</a> Cytometry A. 81 (4), 284-293 (2012).</li>
<li>Marcato, P., Dean, C. A., Giacomantonio, C. A., Lee, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aldehyde+dehydrogenase%3A+its+role+as+a+cancer+stem+cell+marker+comes+down+to+the+specific+isoform%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Aldehyde dehydrogenase: its role as a cancer stem cell marker comes down to the specific isoform.</a> Cell Cycle. 10 (9), 1378-1384 (2011).</li>
<li>Golebiewska, A., Brons, N. H., Bjerkvig, R., Niclou, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Critical+appraisal+of+the+side+population+assay+in+stem+cell+and+cancer+stem+cell+research%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Critical appraisal of the side population assay in stem cell and cancer stem cell research.</a> Cell Stem Cell. 8 (2), 136-147 (2011).</li>
<li>Hirschmann-Jax, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+distinct+%26%2334%3Bside+population%26%2334%3B+of+cells+with+high+drug+efflux+capacity+in+human+tumor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">A distinct &#34;side population&#34; of cells with high drug efflux capacity in human tumor cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (39), 14228-14233 (2004).</li>
<li>Zhou, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ABC+transporter+Bcrp1%2FABCG2+is+expressed+in+a+wide+variety+of+stem+cells+and+is+a+molecular+determinant+of+the+side-population+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">The ABC transporter Bcrp1/ABCG2 is expressed in a wide variety of stem cells and is a molecular determinant of the side-population phenotype.</a> Nat Med. 7 (9), 1028-1034 (2001).</li>
<li>Boesch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+side+population+of+ovarian+cancer+cells+defines+a+heterogeneous+compartment+exhibiting+stem+cell+characteristics%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">The side population of ovarian cancer cells defines a heterogeneous compartment exhibiting stem cell characteristics.</a> Oncotarget. 5 (16), 7027-7039 (2014).</li>
<li>Szotek, P. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ovarian+cancer+side+population+defines+cells+with+stem+cell-like+characteristics+and+Mullerian+Inhibiting+Substance+responsiveness%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Ovarian cancer side population defines cells with stem cell-like characteristics and Mullerian Inhibiting Substance responsiveness.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (30), 11154-11159 (2006).</li>
<li>Brown, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+benign+and+malignant+prostate+epithelial+Hoechst+33342+side+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Prostate%22%5BJournal%5D)">Characterization of benign and malignant prostate epithelial Hoechst 33342 side populations.</a> Prostate. 67 (13), 1384-1396 (2007).</li>
<li>Mathew, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ABCG2-mediated+DyeCycle+Violet+efflux+defined+side+population+in+benign+and+malignant+prostate%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">ABCG2-mediated DyeCycle Violet efflux defined side population in benign and malignant prostate.</a> Cell Cycle. 8 (7), 1053-1061 (2009).</li>
<li>Engelmann, K., Shen, H., Finn, O. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MCF7+side+population+cells+with+characteristics+of+cancer+stem%2Fprogenitor+cells+express+the+tumor+antigen+MUC1%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">MCF7 side population cells with characteristics of cancer stem/progenitor cells express the tumor antigen MUC1.</a> Cancer Res. 68 (7), 2419-2426 (2008).</li>
<li>Ho, M. M., Ng, A. V., Lam, S., Hung, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Side+population+in+human+lung+cancer+cell+lines+and+tumors+is+enriched+with+stem-like+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Side population in human lung cancer cell lines and tumors is enriched with stem-like cancer cells.</a> Cancer Res. 67 (10), 4827-4833 (2007).</li>
<li>Kato, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endometrial+cancer+side-population+cells+show+prominent+migration+and+have+a+potential+to+differentiate+into+the+mesenchymal+cell+lineage%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Endometrial cancer side-population cells show prominent migration and have a potential to differentiate into the mesenchymal cell lineage.</a> Am J Pathol. 176 (1), 381-392 (2010).</li>
<li>Bleau, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PTEN%2FPI3K%2FAkt+pathway+regulates+the+side+population+phenotype+and+ABCG2+activity+in+glioma+tumor+stem-like+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">PTEN/PI3K/Akt pathway regulates the side population phenotype and ABCG2 activity in glioma tumor stem-like cells.</a> Cell Stem Cell. 4 (3), 226-235 (2009).</li>
<li>Harris, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+stem+cells+are+enriched+in+the+side+population+cells+in+a+mouse+model+of+glioma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Cancer stem cells are enriched in the side population cells in a mouse model of glioma.</a> Cancer Res. 68 (24), 10051-10059 (2008).</li>
<li>Murase, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Side+population+cells+have+the+characteristics+of+cancer+stem-like+cells%2Fcancer-initiating+cells+in+bone+sarcomas%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Cancer%22%5BJournal%5D)">Side population cells have the characteristics of cancer stem-like cells/cancer-initiating cells in bone sarcomas.</a> Br J Cancer. 101 (8), 1425-1432 (2009).</li>
<li>Boesch, M., Wolf, D., Sopper, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+Stem+Cell+Detection+Using+the+DyeCycle-Triggered+Side+Population+Phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Int%22%5BJournal%5D)">Optimized Stem Cell Detection Using the DyeCycle-Triggered Side Population Phenotype.</a> Stem Cells Int. 2016, 1652389(2016).</li>
<li>Golebiewska, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Side+population+in+human+glioblastoma+is+non-tumorigenic+and+characterizes+brain+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Side population in human glioblastoma is non-tumorigenic and characterizes brain endothelial cells.</a> Brain. 136 (PT 5), 1462-1475 (2013).</li>
<li>Boesch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug+transporter-mediated+protection+of+cancer+stem+cells+from+ionophore+antibiotics%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Drug transporter-mediated protection of cancer stem cells from ionophore antibiotics.</a> Stem Cells Transl Med. 4 (9), 1028-1032 (2015).</li>
<li>Fukunaga-Kalabis, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tenascin-C+promotes+melanoma+progression+by+maintaining+the+ABCB5-positive+side+population%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Tenascin-C promotes melanoma progression by maintaining the ABCB5-positive side population.</a> Oncogene. 29 (46), 6115-6124 (2010).</li>
<li>Dean, M., Fojo, T., Bates, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumour+stem+cells+and+drug+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Tumour stem cells and drug resistance.</a> Nat Rev Cancer. 5 (4), 275-284 (2005).</li>
<li>Goodell, M. A., Brose, K., Paradis, G., Conner, A. S., Mulligan, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+functional+properties+of+murine+hematopoietic+stem+cells+that+are+replicating+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Isolation and functional properties of murine hematopoietic stem cells that are replicating in vivo.</a> J Exp Med. 183 (4), 1797-1806 (1996).</li>
<li>Telford, W. G., Bradford, J., Godfrey, W., Robey, R. W., Bates, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Side+population+analysis+using+a+violet-excited+cell-permeable+DNA+binding+dye%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Side population analysis using a violet-excited cell-permeable DNA binding dye.</a> Stem Cells. 25 (4), 1029-1036 (2007).</li>
<li>Boesch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+prevalence+of+side+population+in+human+cancer+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Oncoscience%22%5BJournal%5D)">High prevalence of side population in human cancer cell lines.</a> Oncoscience. 3 (3-4), 85-87 (2016).</li>
<li>Ali, M. Y., Anand, S. V., Tangella, K., Ramkumar, D., Saif, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+Primary+Human+Colon+Tumor+Cells+from+Surgical+Tissues+and+Culturing+Them+Directly+on+Soft+Elastic+Substrates+for+Traction+Cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation of Primary Human Colon Tumor Cells from Surgical Tissues and Culturing Them Directly on Soft Elastic Substrates for Traction Cytometry.</a> J Vis Exp. (100), e52532(2015).</li>
<li>Azari, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+expansion+of+human+glioblastoma+multiforme+tumor+cells+using+the+neurosphere+assay%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation and expansion of human glioblastoma multiforme tumor cells using the neurosphere assay.</a> J Vis Exp. (56), e3633(2011).</li>
<li>Hasselbach, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+high+grade+glioma+cell+culture+from+surgical+specimens+for+use+in+clinically+relevant+animal+models+and+3D+immunochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Optimization of high grade glioma cell culture from surgical specimens for use in clinically relevant animal models and 3D immunochemistry.</a> J Vis Exp. (83), e51088(2014).</li>
<li>Boesch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DyeCycle+Violet+used+for+side+population+detection+is+a+substrate+of+P-glycoprotein%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">DyeCycle Violet used for side population detection is a substrate of P-glycoprotein.</a> Cytometry A. 81 (6), 517-522 (2012).</li>
<li>Patrawala, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Side+population+is+enriched+in+tumorigenic%2C+stem-like+cancer+cells%2C+whereas+ABCG2%2B+and+ABCG2-+cancer+cells+are+similarly+tumorigenic%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Side population is enriched in tumorigenic, stem-like cancer cells, whereas ABCG2+ and ABCG2- cancer cells are similarly tumorigenic.</a> Cancer Res. 65 (14), 6207-6219 (2005).</li>
<li>Guha, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nicotine+promotes+apoptosis+resistance+of+breast+cancer+cells+and+enrichment+of+side+population+cells+with+cancer+stem+cell-like+properties+via+a+signaling+cascade+involving+galectin-3%2C+alpha9+nicotinic+acetylcholine+receptor+and+STAT3%5BTitle%5D)+AND+%22Breast+Cancer+Res+Treat%22%5BJournal%5D)">Nicotine promotes apoptosis resistance of breast cancer cells and enrichment of side population cells with cancer stem cell-like properties via a signaling cascade involving galectin-3, alpha9 nicotinic acetylcholine receptor and STAT3.</a> Breast Cancer Res Treat. 145 (1), 5-22 (2014).</li>
</ol>

作者声明无利益冲突。在稿件撰写过程中，亦无非作者人员参与。

癌症临床管理水平的进步还依赖于靶向肿瘤干细胞（CSCs）的治疗手段的发展。能够从生物样本中可靠分离CSCs的方法将加速适宜靶点的鉴定，因此在这一研究方向中具有关键重要性。侧群（SP）分析是一种成熟且有价值的技术，可用于鉴定表达ABC药物转运蛋白的CSC群体，而双循环体积（DCV）方法的引入使其可应用于常规流式细胞仪。从机制上讲，SP鉴别利用ABC药物转运蛋白介导的活性染料外排，通过检测低荧光信号来识别CSCs，表现为特征性的低荧光区域定位 侧面 从图左下角到相应的非SP细胞。重要的是，基于DCV的SP检测是一种稳健且简便的方法，其中最关键的步骤包括：（i）细胞的制备；（ii）染色过程；（iii）选择合适的抑制剂；以及（iv）流式细胞术分析。由于染料外排是一个主动的耗能过程，因此起始细胞活力良好尤为关键；只有存活的（表达药物转运蛋白的）细胞才能形成SP。此外，优化染料浓度与细胞密度之间的比例通常具有重要意义，从而增强SP细胞的分离效果（这反过来需要对DCV和细胞进行滴定）。一般原则是，较高的染料浓度和较低的细胞浓度有助于提高分离效果。19成功进行DCV实验的关键在于使用药理...

由于对癌症的遗传学和分子机制的理解取得了显著进展，以及靶向药物（如治疗性抗体和小分子抑制剂）的出现，过去十年中癌症主要疗法的疗效已大幅提升。然而，转移性和复发性癌症通常仍无法治愈，相关临床情况下的发病率和死亡率依然较高。肿瘤干细胞（CSCs）&#160;是肿瘤内一个独特的亚群，具有典型的干细胞特性，如克隆形成能力/致瘤性、多药耐药性以及不对称细胞分裂1,2。因此，CSCs不仅推动了肿瘤的转移进展和异质性，还在治疗过程中持续存在，导致患者容易复发。因此，有效清除CSCs是预防癌症复发、实现长期治愈的重要医学需求3。
鉴定癌症干细胞（CSCs）的脆弱性并阐明根除这些细胞的策略，在很大程度上依赖于能够从生物样本中纯化CSCs的方法，以便后续进行表达谱分析和/或功能研究。而此类方法又依赖于特异性表达于这些细胞的表面标志物、胞内标志物或功能性标志物。CSC特异性的表面标志物包括但不限于CD44、CD133、CD24和CD90，已被用于在多种肿瘤实体中鉴定CSC群体，如乳腺癌和结肠癌4。另一标志物——醛脱氢酶（ALDH）——定位于细胞内，可通过提供相应底物进行功能性检测，其酶促反应可产生发光信号。利用该检测方法，已在多种肿瘤实体中鉴定出CSC群体5。另一种互补方法通常称为SP&#160;分析，本文将对此方法进行详细描述，该方法利用ABC药物转运蛋白的主动染料外排能力，识别出一群荧光微弱、具有干细胞样特性的稀有细胞群体6,7,8。为实现这一目的，将待测样本与一种脂溶性DNA结合荧光染料共同孵育，该染料通过被动扩散进入所有细胞，并与核DNA和线粒体DNA结合。不表达ABC药物转运蛋白的非CSCs会积累染料而呈现强荧光，而CSCs则能主动将染料排出，导致荧光强度降低。通过药理学手段抑制药物转运蛋白活性可消除该现象，并在功能上验证SP表型，因此应将其作为对照手段使用。具有SP特征的CSC群体已在多种肿瘤中被发现，包括卵巢癌9,10、前列腺癌11,12、乳腺癌13、肺癌14、子宫内膜癌15、胶质瘤16,17以及骨肉瘤18。重要的是，SP检测法既适用于癌细胞系，也适用于原代肿瘤组织，尽管后者存在额外挑战，例如需要特定的肿瘤细胞区分策略（某些宿主细胞群体也可能表现出SP特征）19,20。
赋予SP特性的两种最为明确的药物转运蛋白是ABCB1/P-糖蛋白/MDR1/CD243和ABCG2/Bcrp1/CD3388,9,21；然而，其他药物转运蛋白也可能是SP表型的分子决定因素（例如，ABCB5）22ABCB1 可通过维拉帕米有效阻断，而 ABCG2 的活性则可被烟曲霉素 C（FTC）特异性抑制。6,19SP分析的一个显著优势是可与其他染色方法联合使用（例如，表面标志物和ALDH）并允许活细胞回收，因此可与后续功能研究相兼容。此外，由于CSC群体中ABC药物转运蛋白的高度保守性，SP检测具有广泛的适用性9,23.
最初，SP 的检测使用 Hoechst 33342 作为激发染料24。该染料可实现优异的分辨率，但需要紫外激光激发，因此其应用自然局限于高端流式细胞仪。DyeCycle Violet（DCV）25 的出现为 SP 分析开辟了新途径，并将该方法的应用扩展至缺乏紫外激光源的标准流式细胞仪（仅需紫激光源即可分辨 DCV-SP 细胞）。重要的是，Hoechst 33342 与 DCV 具有相同的泵特异性，表明这两种染料应能识别相同的细胞群体。
本文提供了一种基于DCV的SP分析详细实验方案，便于独立实验室快速、简便地重复该方法。因此，我们认为本文可作为癌症干细胞研究领域研究人员的资源，有助于优化和标准化这一有用的细胞生物学技术。

<table><tbody><tr><td>Vybrant DyeCycle Violet</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>V35003</td><td>即用型</td></tr><tr><td>盐酸维拉帕米</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>V4629</td><td>溶于乙醇</td></tr><tr><td>Fumitremorgin C</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F9054</td><td>溶于DMSO</td></tr><tr><td>7-AAD（或碘化丙啶 - PI）</td><td>BioLegend</td><td>420403</td><td>即用型</td></tr><tr><td>常规细胞培养试剂（&lt;em&gt;例如&lt;/em&gt;，培养基、胎牛血清、L-谷氨酰胺、抗生素、PBS、胰蛋白酶-EDTA、&lt;em&gt;等&lt;/em&gt;）</td><td>不同供应商</td><td></td><td></td></tr><tr><td>待测样本/目标细胞（&lt;em&gt;例如&lt;/em&gt;，人或小鼠肿瘤细胞系、人或小鼠肿瘤组织）</td><td>不同供应商</td><td></td><td></td></tr><tr><td>流式细胞仪（FACS；分析仪或细胞分选仪）</td><td>不同供应商</td><td></td><td>需配备紫色激光光源</td></tr><tr><td>FACS管（圆底）</td><td>不同供应商</td><td></td><td>推荐使用带盖管</td></tr><tr><td>70 &amp;micro;m 孔径滤网</td><td>不同供应商</td><td></td><td>可选但推荐使用</td></tr><tr><td>组织消化酶混合液（&lt;em&gt;例如&lt;/em&gt;，胶原酶/分散酶/DNase）</td><td>不同供应商</td><td></td><td>仅适用于组织解离</td></tr><tr><td>荧光染料标记的针对目标表面标志物的抗体</td><td>不同供应商</td><td></td><td>可选</td></tr><tr><td>ALDEFLUOR试剂盒</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>01700</td><td>可选</td></tr></tbody></table>

利用dna染料诱导的侧群表型从生物样本中检测和纯化肿瘤干细胞

Harnessing the DNA Dye-triggered Side Population Phenotype to Detect and Purify Cancer Stem Cells from Biological Samples

癌症是一种由干细胞驱动的疾病，根除这些细胞已成为主要的治疗目标。解析癌症干细胞（Cancer Stem Cells, CSCs）的脆弱性并鉴定合适的分子靶点，依赖于能够在细胞系等异质性样本中特异性区分这些细胞的方法。 离体 肿瘤组织。流式细胞术/荧光激活细胞分选（FACS）是一种强大的多参数单细胞水平分析生物样本的技术，迄今为止仍是分离活细胞用于后续分析的首选方法。通常利用表面标志物（如CD44和CD133）以及醛脱氢酶酶活性检测，通过FACS来定义并分选出肿瘤样本中的肿瘤干细胞（CSCs）。另一种互补的方法（本文将详细描述其技术流程）则利用ATP结合盒（ABC）药物转运蛋白的功能性染料外排能力，可鉴定出一群荧光信号较弱的细胞亚群，通常称为侧群（side population, SP）。SP&#160;癌细胞表现出典型的干细胞特征，可通过抑制染料外排药物转运蛋白（最常见的是ABCB1/P-糖蛋白/MDR1/CD243和ABCG2/Bcrp1/CD338）的试剂对其进行消除并功能验证。此外，SP&#160;该检测可与其他流式细胞术分析兼容，例如表面抗原染色、醛脱氢酶检测以及死细胞区分例如，使用7-AAD或碘化丙啶（PI））。因此，我们描述了一种基于功能参数而非表型参数的、具有重要价值且广泛适用的肿瘤干细胞（CSC）鉴定、分离及亚群表征方法。尽管该方法最初使用Hoechst 33342作为激发染料，但本文重点介绍基于较新紫色染料的侧群（SP）表型，该表型可在任何配备紫色激光光源的流式细胞仪上进行分析。

以下为A2780细胞的代表性SP分析结果，A2780是一种人卵巢癌细胞系，既往研究已证实其含有占细胞总数不到1%的SP细胞群9。细胞在37 °C条件下培养于RPMI 1640培养基中，培养基中添加10%（v/v）胎牛血清（FBS）、2 mM L-谷氨酰胺和1×青霉素/链霉素，并在细胞融合度达到85%时，使用0.05%胰蛋白酶-EDTA处理收获细胞。细胞经PBS洗涤后，通过70 µm孔径滤网过滤。采用计数板和台盼蓝染色法测定细胞数量，并将细胞重悬于新鲜培养基中，调整浓度为1 × 106 个细胞/mL，随后加入10 µM DCV染料，在37 °C避光条件下染色90分钟。同时，取另一份等量细胞样品，在完全相同的条件下加入20 µM FTC进行孵育作为对照。染色后，细胞用4 mL PBS洗涤，并向“检测”管中加入预滴定浓度的APC标记的ABCG2抗体。4 °C孵育25分钟后，再次用PBS洗涤细胞，并加入7-AAD以标记死细胞。样品置于冰上冷却后，使用流式细胞仪进行分析。图示的设门策略基本可普遍...

用于表征和分离生物样本中干细胞群体的方法，对于推动靶向干细胞的癌症治疗及其他疾病治疗至关重要。本文中，我们提供了一种利用染料触发的侧群表型分离癌干细胞的详细实验方案。

利用DNA染料诱导的侧群表型从生物样本中检测和纯化肿瘤干细胞

癌症是一种由干细胞驱动的疾病，根除这些细胞已成为主要的治疗目标。解析癌症干细胞的脆弱性……

本实验的总体目标是基于侧群细胞的染料外排能力，在生物样本中检测潜在的肿瘤干细胞群体。该方法针对肿瘤干细胞研究中的一个关键问题，即如何从生物样本中可靠地检测和纯化肿瘤干细胞。该技术的主要优势在于利用功能性标志物，从而提供更高的分辨率。此外，这些 ABC 药物转运蛋白在肿瘤干细胞中高度保守，因此该技术可应用于多种不同的癌症类型。该技术的应用前景在于促进抗肿瘤干细胞治疗药物的发现，因为它有助于对高度纯化的肿瘤细胞进行基因表达谱分析和靶点验证等下游分析。因此，该方法可为揭示肿瘤干细胞的特性提供重要信息。我们还可以利用该方法对表达ABC药物转运蛋白的群体（如骨髓）组成的系统进行表征。演示该实验步骤的是我实验室的技术员Elisabeth Hoflehner。首先，在37摄氏度条件下，将所需的人类癌细胞系接种于10至30毫升RPMI 1640培养基中进行培养，培养基需添加10% FBS、2 mM L-谷氨酰胺和抗生素。当细胞融合度达到约70%至90%时，移除培养基，并加入2毫升0.05%胰蛋白酶-EDTA，使细胞从培养皿表面脱落。随后，用10毫升培养基洗涤细胞，将细胞悬液转移至洁净的15毫升离心管中，在4°C下以250 × g离心5分钟。待细胞沉淀形成后，弃去上清液，并将沉淀重悬于1毫升培养基中。取少量细胞悬液与台盼蓝溶液混合，使用血细胞计数板进行细胞计数。为制备测试样品，将细胞重悬于新鲜培养基中，制成浓度为1 × 10⁶ 个细胞/毫升的细胞悬液。调整细胞密度后，取3毫升样品转移至已标记为“测试”的15毫升圆底试管中。然后，向样品中加入 10 µM 的紫色染料，并轻轻涡旋混匀悬浮液。接下来，取含有染料的细胞悬浮液 500 µL，转移至两支标记为对照的流式细胞术管中，以制备抑制对照。向第一管中加入 50 µM 的维拉帕米。向第二个试管中加入20微摩尔的Fumitremorgin C。用移液器轻轻吹打混合溶液。将所有试管盖上盖子，在37°C避光条件下孵育90分钟。每15分钟轻轻振荡样品一次。染色完成后，用3至4毫升预冷的PBS洗涤抑制对照样本，并将待测样本分装，用于后续与抗体的共染色实验。同样洗涤此分装样品，并通过70微米滤网过滤所有样品，以去除潜在的细胞聚集体。然后在4°C条件下以250 × g离心5分钟。将所得沉淀重悬于100 µL PBS中后，将细胞置于冰上并避光保存。接下来，向已用紫色染料预染色的细胞中加入一组合适的荧光染料偶联抗体。涡旋混匀悬液，并在4摄氏度避光条件下孵育20至30分钟。孵育结束后，用三到四毫升预冷的PBS洗涤细胞，必要时对样品进行过滤。然后在 4°C 条件下以 250 × g 离心 5 分钟。弃去上清液，并将沉淀的细胞重悬于 100 µL PBS 中。最后，向经紫染料预染色的细胞中加入 7-AAD。在避光条件下将样品孵育5至10分钟。使用流式细胞仪分析细胞时，先在FSC与SSC点图上圈选适当的细胞群体，然后根据不同的FSC信号，从选定的群体中排除所有细胞聚集体。排除显示 7-AAD 染色阳性的细胞，以获得活细胞群体。要创建蓝色和红色染料发射的散点图，请将蓝色荧光通道显示在 y 轴上，红色荧光通道显示在 x 轴上。将两个通道均切换至线性模式，并相应调整检测器电压，使侧群位于图的左下部分。然后，圈定侧群细胞，并停止数据采集。接着，加载抑制对照样本并采集数据。最后，创建一个点图，横轴显示紫染料的红色荧光，纵轴显示适当的荧光通道，均以对数模式绘制。加载样本后，相应调整检测器电压，并鉴定表达目标表面标志的侧群细胞比例。然后，记录数据。本文展示了在人卵巢癌细胞中进行的侧群细胞分析的代表性结果。通过分析蓝色和红紫色发射光，在点图的左下象限中识别出侧群细胞，占整个分析细胞群体的0.70%。后续使用外排抑制剂后，先前识别细胞中观察到的荧光信号消失，证实了这些细胞具有侧群细胞表型。最后，还对人卵巢细胞的ABCG2表达进行了表征。在0.67%的细胞中观察到ABCG2阳性染色，这些细胞对应于所鉴定的侧群细胞。一旦掌握，该操作若正确进行，大约可在两到三小时内完成。在尝试该实验操作时，需牢记侧群细胞表型严格依赖于染料浓度与细胞密度之间的最佳比例。因此，强烈建议在实验前对这两个变量进行充分优化。完成该操作后，可进一步开展基因表达谱分析等其他方法，以深入表征侧群细胞，从而为未来药物研发鉴定新的癌症干细胞特异性靶点。该技术问世后，为干细胞生物学领域的研究人员探索小鼠和人类组织干细胞及癌症干细胞的特性开辟了道路。观看本视频后，您应能够熟练掌握紫染料诱导的侧群SA实验操作，并了解如何在您自己的实验室中检测生物样本中的潜在癌症干细胞。请务必注意，操作生物样本可能具有极高危险性，在进行本实验时应采取相应防护措施，例如穿戴个人防护装备（PPE）并使用生物安全柜。

harnessing-dna-dye-triggered-side-population-phenotype-to-detect

Research

科研

JoVE Journal

Cancer Research

癌症研究

利用DNA染色体引发的侧群体表型，从生物样品中检测和纯化癌细胞

癌症干细胞（CSCs）已在多种恶性肿瘤中被发现。本方案描述了一种流式细胞术方法，利用醛脱氢酶活性以及CD44和CD24的表达，从人胰腺导管腺癌异种移植瘤中分离癌症干细胞。这些活细胞随后可用于功能性和分析性研究。...

从人胰腺癌异种移植瘤中分离干细胞

在本视频中，我们介绍了使用荧光激活细胞分选仪（FACS）从头颈部鳞状细胞癌细胞系中分离出一群具有癌干细胞样特性的亚群细胞。分离得到的侧群细胞可用于后续的下游分析。...

肿瘤侧群细胞鉴别实验：利用Hoechst染料外排实验分离肿瘤干细胞样细胞的方法

本文介绍了如何将新鲜获取的黑色素瘤组织制备成原代细胞培养物，以及如何去除肿瘤细胞中红细胞和成纤维细胞的污染。最后，我们描述了如何利用磁性激活细胞分选技术（MACS）从CD133-主体细胞中分选出CD133+的黑色素瘤干细胞样细胞。...

患者来源的细胞培养及从黑色素瘤中分离CD133+潜在肿瘤干细胞

直接从人体组织中分离癌症干细胞（CSCs）是对其进行生物学表征的必要步骤。本文描述了一种从人体组织中分离前列腺癌症干细胞的方法，同时提供了针对困难步骤的故障排除建议。...

从人前列腺癌样本中分离癌干细胞

胰腺癌干细胞（CSCs）可被扩增 体外...

研究胰腺癌干细胞特性以开发新的治疗策略

在过去的十年中，了解癌干细胞样细胞在肿瘤复发和治疗耐药性中的作用已成为备受关注的研究课题。本文描述了从头颈部鳞状细胞癌细胞系（HNSCC）中分离和鉴定癌干细胞样细胞亚群的方法。...

分离与鉴定具有干细胞特性的头颈部鳞状细胞癌亚群

本方法的目的是通过成球实验，结合功能分析以及流式细胞术和蛋白质印迹法进行表型鉴定，以可靠地鉴定癌细胞系和原代人肿瘤样本中的肿瘤干细胞（CSC）。...

从妇科及乳腺癌肿瘤中获取肿瘤干细胞球

介绍了一种方便、快速且经济高效的方法，用于测定实体肿瘤细胞系中侧群细胞的比例。...

实体瘤细胞系中侧群细胞的分析

本文介绍了一种用于发现维持结直肠HT29细胞来源的已建立癌干细胞样细胞的过表达驱动基因的实验方案。通过RNA测序结合现有的生物信息学分析，研究并筛选基因表达网络，以阐明与靶向肿瘤细胞存活相关的潜在机制。...

HT29 来源的结直肠癌干细胞样肿瘤球体中驱动基因的发现

本实验方案描述了从乳腺癌细胞和组织样本中分离乳腺癌干细胞（BCSCs）的方法以及相关步骤 体外 和 体内...

从细胞和组织样本中分离与功能评估人乳腺癌干细胞

本文表明，高功率375 nm和405 nm激光器可有效激发Hoechst 33342，并可作为355...

通过流式细胞术有效检测Hoechst侧群细胞

学习利用侧群体表型从生物样品中检测和纯化癌细胞的方法。该技术基于ABC药物转运蛋白介导的染料外排能力，可在2-3小时内完成，适用于多种癌症类型的癌症干细胞鉴定与下游分析。

利用DNA染料诱导的侧群表型从生物样本中检测和纯化肿瘤干细胞

探索更多视频