Name: 通过使用多光谱成像流式细胞术测量LC3，p62和LAMP1共定位评估自噬通量 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 39 s
Description: 了解如何使用多光谱成像流式细胞术定量分析Jurkat细胞中LC3、p62和LAMP1的共定位，以客观、统计严谨的方式评估自噬通量。该方法可同时检测三种自噬标志物，提高实验的准确性和可重复性。

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我要感谢我在MilliporeSigma的同事Philip J. Morrissey和Sherree L. Friend多年来给予的支持与指导。同时，我也感谢Vidya Venkatachalam和Bryan R. Davidson在IDEAS软件的BDC3功能方面提供的帮助。, 感谢Ryan P. Jessup对手稿编辑提供的帮助，Raymond Kong在拍摄当天的协助，以及特别感谢化妆师Cynthia Xamonthiene。

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<li>Bjørkøy, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((p62%2FSQSTM1+forms+protein+aggregates+degraded+by+autophagy+and+has+a+protective+effect+on+huntingtin-induced+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">p62/SQSTM1 forms protein aggregates degraded by autophagy and has a protective effect on huntingtin-induced cell death.</a> J Cell Biol. 171 (4), 603-614 (2005).</li>
<li>Phadwal, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+method+for+autophagy+detection+in+primary+cells%3A+Impaired+levels+of+macroautophagy+in+immunosenescent+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">A novel method for autophagy detection in primary cells: Impaired levels of macroautophagy in immunosenescent T cells.</a> Autophagy. 8 (4), 677-689 (2012).</li>
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<li>Pike, L. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+up-regulation+of+ULK1+by+ATF4+contributes+to+cancer+cell+survival%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">Transcriptional up-regulation of ULK1 by ATF4 contributes to cancer cell survival.</a> Biochem J. 449 (2), 389-400 (2013).</li>
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</ol>

我受雇于MilliporeSigma公司，该公司是本研究中所使用的Amnis品牌ImageStream的制造商。

进行此分析时，需考虑一些事项。必须设置适当的对照样本。本实验使用了两种不同的对照：对照组和对照组+氯喹。对照组用于设定区域的阈值，代表未抑制溶酶体降解时自噬的基础水平，是饥饿样本的对照。然而，由于氯喹本身会影响对照组，因此对照组不适合作为饥饿+氯喹样本结果的比较对照，故有必要设置对照组+氯喹样本。
在进行自噬分析之前，重要的是仅对处于焦距清晰的单个细胞进行分析/设门即， 梯度均方根大于60时），若存在多个细胞或图像失焦，结果可能受到影响。自噬体和溶酶体必须处于清晰对焦状态，以确保准确的斑点计数和BDC3分析。在进行自噬分析前，必须剔除凋亡细胞，因其可能干扰结果，不应纳入分析。三种标记物均应有适当的染色（即， LC3、p62 和 LAMP1）。例如，这三种标志物均为细胞内蛋白，应呈现点状信号；如果信号不是点状，或出现在细胞表面，则表明染色不适当，实验或染色需重新进行。此外，为确保 BDC3 结果的准确性，必须对三种目标荧光标志物均呈强荧光的细胞进行设门。设门于阳性事件可避免对非特异性结合、成像伪影和/或背景噪声进行 BDC3 测量。这一点至关重要，因为 BDC3 可能会放大并非真实信号的伪影。由于 BDC3 仅适用于荧光强烈的阳性事件，许多细胞可能无法纳入最终分析；对于未出现 LC3、p62 和/或 LAMP1 积累的对照细胞，尤其如此。因此，该检测方法的一个局限性在于，BDC3 仅分析三种标志物均为阳性的细胞，这在某些自噬实验中可能并不适用。
与先前已有报道的BDS类似15,16,17,20,21,22,23,24,25,26，单独使用BDC3并未考虑共定位的自噬细胞器数量，导致自噬小体数量存在较大变异性。因此，采用了Rajan et al. 提出的双变量分析方法。观察双变量图时，可能会产生疑问：细胞是否必须对LC3、p62和LAMP1均为阳性？为何存在如此多的细胞显示0个斑点？这是因为LC3信号可能足够强以实现共定位，但其强度可能未达到峰掩膜（Peak (M11, Ch11-LC3-AF647, Bright, 4)）所设定的阈值，因而无法被识别为有效斑点。
本方案采用MIFC技术计数LC3点状结构以及三种自噬标志物的共定位，以检测自噬流。在基础条件下（对照样本），自噬小体数量较低，仅有少数细胞被发现含有 &#34;高亮点&#34; 加入氯喹（可抑制自噬体与溶酶体融合）后，LC3斑点数量增加。由于溶酶体无法降解自噬体及其内部的p62蛋白，导致LC3、p62与LAMP1共定位增强，自噬溶酶体积累增多。该效应在营养剥夺条件下进一步增强，因营养剥夺可诱导自噬。然而，在未添加氯喹的情况下，自噬体数量未见显著增加，最可能的原因是自噬周转速率加快所致。当细胞在氯喹存在下进行饥饿处理时，自噬体的共定位程度及数量均增加，支持了饥饿可增强自噬流的结论。已知EBSS是强烈的自噬诱导剂，因此预期其诱导的自噬增加幅度较大。若采用其他方法（如药物诱导）诱导自噬，则对照组与处理组之间的差异可能较为细微。
该特定实验方案旨在检测人源细胞系中的自噬作用，但通过更换针对特定物种的抗体，该检测方法也可适用于其他物种。此外，该分析方法可用于任何需要三种探针/标记物共定位的细胞内应用。

巨自噬（下文简称自噬）是一种分解代谢途径，通过该途径降解受损或功能异常的组分、长寿命蛋白质以及细胞器 通过 溶酶体中被回收利用1自噬是一个动态的多步骤过程，包括自噬体的形成、自噬体与溶酶体融合形成自噬溶酶体，以及自噬溶酶体内容物的降解。2关键的生物标志物微管相关蛋白1A/1B轻链3（LC3）是哺乳动物系统中用于识别自噬的标志性分子，该蛋白构成自噬体膜。在自噬过程中，胞质中的LC3-I与磷脂酰乙醇胺共价结合形成LC3-II；随后LC3-II被整合到自噬体膜中3另一个广泛用于自噬流检测的标志物是自噬受体sequestosome 1（SQSTM1，p62），它可将自噬底物与自噬膜在物理上连接起来4,5.
传统上用于检测自噬的方法包括蛋白质印迹法（Western blot）和荧光显微镜技术7。然而，这两种方法均未被视为自噬检测的&#34;金标准&#34;2,6，因为它们各自存在一定的技术局限性。蛋白质印迹法仅能提供平均值，因其使用的是组织或细胞匀浆样本，因此无法观察单个细胞内的自噬动态变化。另一方面，荧光显微镜可在单细胞水平提供信息，但通量较低，难以实现客观且具有统计学意义的定量分析。近年来，利用多光谱成像流式细胞术（MIFC，参见材料表）检测LC3和p62的方法日益受到关注，因其具备定量能力强、高通量、多重检测潜力以及可对每个细胞进行成像的优势。目前最广泛使用的基于MIFC（及其配套分析软件，参见材料表）的自噬检测方法之一是通过计数LC3点状结构（puncta）或自噬小体的数量8,9,10,11,12,13,14,15,16,17。然而，自噬小体数量的增加并不一定意味着自噬活性增强，也可能反映自噬过程受阻2。LC3-II的周转率是一个可用于评估自噬流（autophagic flux）的有效参数，通常通过比较在存在与不存在溶酶体降解抑制剂（如氯喹）条件下细胞中的LC3-II水平来实现。氯喹可抑制自噬小体与溶酶体的融合，从而在溶酶体降解发生前阻断自噬流，使得自噬小体的形成量得以被定量，进而反映自噬程度18。此外，p62主要通过自噬途径降解，当自噬小体及其内容物的溶酶体降解被阻断时，p62会出现累积17,19。
自噬是一个多步骤的过程，单独检测LC3或p62并不能完整反映细胞内的实际变化。近期多项研究强调，需要同时观察自噬溶酶体的形成2,17,20,21。多光谱成像流式细胞术（MIFC）能够通过成像自噬小体与溶酶体的共定位，独特地检测自噬溶酶体的形成15-17,20,21,22,23,24,25,26。此外，已有研究利用MIFC检测p62与LC3的共定位，以评估自噬流5。在所引用的分析软件中，用于测量共定位的&#34;特征&#34;被称为&#34;Bright Detail Similarity R3&#34;（BDS），该参数专门设计用于比较两幅图像中微小而明亮的细节区域。BDS是半径小于或等于3个像素的局部亮斑的对数转换后的Pearson相关系数；换句话说，BDS计算的是两个不同荧光通道中重叠像素的程度。这些亮斑可能是相关的（即空间位置相同）或不相关的（即空间位置不同）。因此，相关系数的取值范围为0（无相关性）到1（完全相关）。该系数经过对数转换，以将其范围扩展至从0到无穷大26,27。然而，仅使用BDS可能并不充分；Rajan 等发现，仅依赖BDS可能导致假阳性或假阴性结果21。BDS评估的是两种自噬标志物的共定位情况，但未考虑自噬小体的数量。为纳入自噬小体数量的影响，Rajan 等引入了LC3点状结构的计数分析21。Rajan 等建议采用LC3点状结构数量与BDS的双变量散点图进行分析。通过该双变量图，首先可识别出两个细胞群体：一类是LC3点状结构水平较高的细胞，另一类是LC3点状结构水平较低的细胞。其中高LC3点状结构群体可进一步分为两类：共定位程度低的细胞（即自噬小体积累）和共定位程度高的细胞（即自噬溶酶体积累）。该双变量图有助于区分自噬小体极少的细胞与自噬小体和/或自噬溶酶体积累的细胞21。
迄今为止，使用单一方法同时实现LC3、p62和LAMP1（溶酶体标志物）的共定位尚不可行 &#34;特征类型&#34; 在MIFC伴生分析软件中（参见 材料表）。然而，6.1 版本中最近引入的一项新功能称为亮细节共定位 3（Bright Detail Colocalization 3, BDC3）。BDC3 比较来自三幅图像中每幅图像的亮细节部分（本例中为 LC3、p62 和 LAMP1），并量化三种探针的共定位情况即， LC3、p62 和 LAMP1）。BDC3 特征计算的是扩展至三幅图像的皮尔逊相关系数。由于三幅图像中的亮斑点可能相关或不相关，因此相关系数在 0（不相关）到 1（完全相关）之间变化。该系数经过对数变换以扩大动态范围，从 0 到无穷大。通过将 BDS 特征替换为 BDC3 特征，Rajan 提出的分析方法 等 现在可以在同一系统中同时整合三种最常用的自噬检测标志物。在单次实验中实现这三种自噬标志物的共定位，有助于深入理解自噬的诱导及其调控机制。以下实验方案详细描述了在Jurkat细胞中诱导自噬、使用LC3、p62和LAMP1抗体对细胞进行标记、在多光谱成像流式细胞仪上获取数据，以及分析数据以评估自噬流的完整步骤。

<table><tbody><tr><td>15 mL 离心管</td><td>Falcon</td><td>352096</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 离心管</td><td>Falcon</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>AF647 标记的驴抗小鼠 IgG&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>A-31571</td><td>驴抗小鼠 IgG (H+L) 二抗，Alexa Fluor 647 标记。浓度 2 mg/mL。https://www.thermofisher.com/antibody/product/Donkey-anti-Mouse-IgG-H-L-Secondary-Antibody-Polyclonal/A-31571</td></tr><tr><td>抗人 CD107a-PE (LAMP1)</td><td>BioLegend</td><td>328607</td><td>克隆号 H4A3。浓度 400 &amp;micro;g/mL。http://www.biolegend.com/pe-anti-human-cd107a-lamp-1-antibody-4967.html</td></tr><tr><td>抗人 CD45- AF488</td><td>BioLegend</td><td>304017</td><td>克隆号 HI30。http://www.biolegend.com/alexa-fluor-488-anti-human-cd45-antibody-2738.html</td></tr><tr><td>抗人 CD45- PE&amp;nbsp;</td><td>BioLegend</td><td>304008</td><td>克隆号 HI30。&amp;nbsp; http://www.biolegend.com/pe-anti-human-cd45-antibody-708.html</td></tr><tr><td>抗人 CD45-AF647&amp;nbsp;</td><td>BioLegend</td><td>304018</td><td>克隆号 HI30。&amp;nbsp; http://www.biolegend.com/alexa-fluor-647-anti-human-cd45-antibody-2739.html</td></tr><tr><td>抗 LC3（人）单克隆抗体，克隆 4E12</td><td>MBL International Corporation</td><td>M152-3</td><td>克隆号 4E+12。&amp;nbsp; 浓度 2 mg/mL。&amp;nbsp; https://www.mblintl.com/products/m152-3</td></tr><tr><td>抗 SQSTM1 / p62 抗体 [EPR4844] - 自噬体标记物（Alexa Fluor 488）</td><td>abcam</td><td>ab185015</td><td>克隆号 EPR4844。&amp;nbsp; 浓度 0.5 mg/mL。&amp;nbsp; http://www.abcam.com/sqstm1-p62-antibody-epr4844-autophagosome-marker-alexa-fluor-488-ab185015.html</td></tr><tr><td>氯喹二磷酸盐</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C6628-25G</td><td></td></tr><tr><td>清洗液 - Coulter Clenz&amp;nbsp;</td><td>Beckman Coulter</td><td>8546931</td><td>用 200 mL 清洗液填充容器。&amp;nbsp; https://www.beckmancoulter.com/wsrportal/page/itemDetails?itemNumber=8546931#2/10//0/25/1/0/asc/2/8546931///0/1//0/</td></tr><tr><td>DAPI 染色液 5 mg/mL</td><td>MilliporeSigma</td><td>508741</td><td>http://www.emdmillipore.com/US/en/product/DAPI-Stain---CAS-28718-90-3---Calbiochem,EMD_BIO-508741</td></tr><tr><td>消泡剂 - 70% 异丙醇</td><td>MilliporeSigma</td><td>1.3704</td><td>用 200 mL 消泡剂填充容器。&amp;nbsp; http://www.emdmillipore.com/US/en/product/2-Propanol-70%25-%28V%2FV%29-0.1-%C2%B5m-filtred,MDA_CHEM-137040?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F</td></tr><tr><td>杜尔贝科磷酸盐缓冲液 10x</td><td>MilliporeSigma</td><td>BSS-2010-B</td><td>&amp;nbsp;无 Ca++ 和 Mg++&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>杜尔贝科磷酸盐缓冲液 1x</td><td>MilliporeSigma</td><td>BSS-1006-B</td><td>PBS 无 Ca++ 和 Mg++&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>厄尔平衡盐溶液 1x</td><td>Gibco</td><td>14155</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>HyClone</td><td>SH30071.03</td><td></td></tr><tr><td>甲醛，10%，无甲醇，超纯</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>04018</td><td>用于配制 4% 和 1% 的福尔马林。警告：甲醛/福尔马林吸入或吞咽有毒。&amp;nbsp; 对眼睛、呼吸系统和皮肤有刺激性。&amp;nbsp; 可能通过吸入或皮肤接触引起致敏。对眼睛有严重损伤风险。&amp;nbsp; 有潜在致癌危险。&amp;nbsp; http://www.polysciences.com/default/catalog-products/life-sciences/histology-microscopy/fixatives/formaldehydes/formaldehyde-10-methanol-free-pure/</td></tr><tr><td>汉克斯平衡盐溶液 1x</td><td>Gibco</td><td>14175</td><td></td></tr><tr><td>Jurkat 细胞，克隆 E6-1 (ATCC TIB-152)</td><td>ATCC</td><td>TIB-152</td><td>https://www.atcc.org/products/all/TIB-152.aspx</td></tr><tr><td>MEM 非必需氨基酸 100x</td><td>HyClone</td><td>SH30238.01</td><td></td></tr><tr><td>MIFC - ImageStreamX Mark II</td><td>MilliporeSigma</td><td>100220</td><td>使用配备 405 nm、488 nm 和 642 nm 激光器的双相机 ImageStreamX Mark II。http://www.emdmillipore.com/US/en/life-science-research/cell-analysis/amnis-imaging-flow-cytometers/imagestreamx-Mark-ii-imaging-flow-cytometer/VaSb.qB.QokAAAFLzRop.zHe,nav?cid=BI-XX-BDS-P-GOOG-FLOW-B325-0006</td></tr><tr><td>MIFC 分析软件 - IDEAS 6.2</td><td>MilliporeSigma</td><td>100220</td><td>MIFC（ImageStreamX MKII）的配套软件。&amp;nbsp; IDEAS 版本 6.2</td></tr><tr><td>MIFC 软件 - INSPIRE</td><td>MilliporeSigma</td><td>100220</td><td>用于运行 MIFC（ImageStreamX MKII）的软件。INSPIRE 版本 200.1.388.0</td></tr><tr><td>PE 标记抗人 CD107a (LAMP-1) 抗体，克隆 H4A3</td><td>BioLegend</td><td>328608</td><td>http://www.biolegend.com/pe-anti-human-cd107a-lamp-1-antibody-4967.html</td></tr><tr><td>青霉素/链霉素/谷氨酰胺溶液 100x</td><td>HyClone</td><td>SV30082.1</td><td></td></tr><tr><td>冲洗液 - 超纯水或去离子水</td><td>NA</td><td>NA</td><td>可使用任何超纯水或去离子水。&amp;nbsp; 用 900 mL 冲洗液填充容器。</td></tr><tr><td>RPMI-1640 培养基 1x</td><td>HyClone</td><td>SH30027.01</td><td></td></tr><tr><td>鞘液 - PBS</td><td>MilliporeSigma</td><td>BSS-1006-B</td><td>与杜尔贝科磷酸盐缓冲液 1X 相同，&amp;nbsp; 无 Ca++ 和 Mg++。&amp;nbsp; 用 900 mL 鞘液填充容器。</td></tr><tr><td>硅化聚丙烯微量离心管</td><td>Fisherbrand</td><td>02-681-320</td><td>Fisherbrand 硅化低吸附微量离心管 1.5 mL。https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-siliconized-low-retention-microcentrifuge-tubes-8/p-193936</td></tr><tr><td>丙酮酸钠溶液 (100 mM)</td><td>HyClone</td><td>SH30239.01</td><td></td></tr><tr><td>消毒液 - 0.4 - 0.7% 次氯酸盐</td><td>VWR</td><td>JT9416-1</td><td>这实质上是 10% 的 Clorox 漂白剂，可通过将 Clorox 漂白剂与水稀释配制而成。&amp;nbsp; 用 200 mL 消毒液填充容器。</td></tr><tr><td>系统校准试剂 - SpeedBead</td><td>MilliporeSigma</td><td>400041</td><td>每管约含 10 mL。&amp;nbsp; https://www.emdmillipore.com/US/en/life-science-research/cell-analysis/amnis-imaging-flow-cytometers/support-training/XDqb.qB.wQMAAAFLBDUp.zHu,nav&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>T75 培养瓶</td><td>Falcon</td><td>353136</td><td></td></tr><tr><td>TRITON X-100，蛋白级去垢剂，10% 溶液，无菌过滤</td><td>MilliporeSigma</td><td>648463-50ML</td><td>http://www.emdmillipore.com/US/en/product/TRITON-X-100,-PROTEIN-GRADE-Detergent,-10%25-Solution,-Sterile-Filtered---CAS-9002-93-1---Calbiochem,EMD_BIO-648463</td></tr><tr><td>细胞培养级水&amp;nbsp;</td><td>HyClone</td><td>SH30529.03</td><td></td></tr></tbody></table>

利用多光谱成像流式细胞术通过检测lc3、p62和lamp1共定位评估自噬流

Assessing Autophagic Flux by Measuring LC3, p62, and LAMP1 Co-localization Using Multispectral Imaging Flow Cytometry

自噬是一种分解代谢途径，通过溶酶体降解在生长和分化过程中积累的正常或功能异常的细胞组分，并实现其再循环。在自噬过程中，细胞质中的LC3蛋白发生脂化修饰，并被招募至自噬体膜上。随后，自噬体与溶酶体融合形成自噬溶酶体，在其中自噬体囊泡及其内容物被降解。与LC3结合的泛素结合蛋白p62也常用于监测自噬流。发生自噬的细胞应表现出p62、LC3和溶酶体标志物的共定位。免疫荧光显微镜已被用于在单细胞水平上直观识别LC3斑点、p62和/或溶酶体。然而，获得客观且具有统计学严谨性的评估结果往往较为困难。为克服这些问题，本研究结合多光谱成像流式细胞术与一种分析功能，该功能通过比较三种自噬标志物（LC3、p62和溶酶体LAMP1）的亮细节图像，量化其共定位程度，并结合LC3斑点计数，以实现对自噬水平的客观、定量且统计学稳健的测量。

该分析方法利用多个特征来评估自噬流。为了充分理解最终的双变量图，必须首先考察各个分析特征。计数自噬体是测量自噬的一种合理方式；然而，LC3 斑点的大小、形状和亮度在不同细胞之间可能存在显著差异。这种变异性使得通过手动或分析软件中的斑点计数功能进行自噬体计数变得困难。因此，由于自噬体存在较大的变异性，任何斑点计数功能都无法做到完美。然而，一个良好的斑点计数功能可在大多数细胞上有效工作26。 图3 展示了使用不同斑点掩膜对Jurkat细胞中LC3斑点进行斑点掩蔽的示例。本数据集所选用的斑点计数功能为“Spot Count_Peak(M11, Ch11-LC3-AF647, Bright, 4)_4”，即该斑点计数功能统计了在默认通道11掩膜（M11）内、通道11（Ch11-LC3-AF647）上由峰值掩膜识别出的斑点，且斑点与细胞背景的比值为4（Bright, 4）。图4 展示了经抗LC3-AF647标记的对照组、对照组+氯喹、饥饿组以及饥饿+氯喹Jurkat细胞的斑点计数直方图及代表性图像。对照组与饥饿组的平均斑点数无显著差异；而加入氯喹后，对照组+氯喹与饥饿组+氯喹之间的平均斑点数差异显著。
接下来要研究的特征是 BDC3。BDC3 是对三种标记物/探针共定位情况的测量，此处指 LC3、p62 和 LAMP1 的共定位。图 5A-5D 展示了用抗-p62-AF488、抗-LAMP1-PE 和抗-LC3-AF647 标记的对照组、对照组+氯喹、饥饿组以及饥饿组+氯喹处理的 Jurkat 细胞的 BDC3 直方图。对照组均值与饥饿组均值之间，以及对照组+氯喹均值与饥饿组+氯喹均值之间均存在位移。然而，观察 图 5E-5H 中 BDC3 平均得分对应细胞图像，可以发现样本之间的差异比直方图所显示的更为显著。这是因为 BDC3 未考虑共定位自噬细胞器的数量，导致相同 BDC3 得分下自噬体数量存在较大变异性。在大多数情况下，三种探针之间存在重叠，因为即使在基础水平下，p62、LAMP1 和 LC3 也应在一定程度上发生共定位或位于细胞内的相似区域。作为对比，图 6 展示了饥饿组+氯喹样本中三种不应共定位的探针示例：抗-p62-AF488、抗-LC3-AF647 和 DAPI 核染料。
当斑点计数特征与BDC3特征结合时，不同亚群的存在使得区分各种样本/条件的能力得到提升，这一点变得明显。图7展示了四个样本（对照、对照+氯喹、饥饿、饥饿+氯喹）中LC3的斑点计数与BDC3（p62/LAMP1/LC3）的双变量图。对照样本用于设定三种群体的设门策略：低斑点、高斑点/低BDC3以及高斑点/高BDC3。对照样本显示，超过98%的细胞具有1个或更少的斑点。高斑点/低BDC3与高斑点/高BDC3之间的界限设定为BDC3得分为1，因为超过91%的对照样本的BDC3得分低于1。双变量图结果的汇总见表1。
<img alt="流式细胞仪控制面板；荧光强度设置；样品加载；数据采集界面。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55637/55637fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Figure 1"> 
图1：MIFC仪器设置。 本实验所用MIFC仪器设置的截图，详见操作步骤8。 <a href="https://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/55637/55637fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="流式细胞术分析；图谱与直方图；细胞群体数据；荧光强度。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55637/55637fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 2"> 
图 2：分析软件设门策略。 协议第 9 步中所述分析软件设门方案的截图。 <a href="https://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/55637/55637fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="共聚焦显微镜示意图，用于蛋白质定位研究的细胞荧光分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55637/55637fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图3"> 
图3：LC3 斑点掩膜。 用于生成斑点计数特征的 Jurkat 细胞图像及对应掩膜。图中显示了明场（BF）、LC3-AF647、Peak(M11, Ch11-LC3-AF647, Bright,2)、Peak(M11, Ch11-LC3-AF647, Bright,4)、Peak(M11, Ch11-LC3-AF647, Bright,5)、Spot(M11, Ch11-LC3-AF647, Bright,5,3,1) 和 Spot(M11, Ch11-LC3-AF647, Bright,6,2,1)。对所有所示细胞效果最佳的掩膜为 Peak(M11, Ch11-LC3-AF647, Bright,4)。<a href="https://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/55637/55637fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="LC3 斑点计数分布；对照组与氯喹处理组的图表（A-D）及显微镜图像（E-H）" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55637/55637fig4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 4"> 
图 4：LC3 斑点计数直方图。 使用斑点计数功能“Spot Count_Peak(M11, Ch11-LC3-AF647, Bright, 4)_4”获得对照组（A，浅蓝色）、对照组 + 氯喹（B，蓝色）、饥饿处理组（C，粉色）和饥饿处理组 + 氯喹（D，红色）的 LC3-AF647 斑点计数直方图。对照组、对照组 + 氯喹、饥饿处理组和饥饿处理组 + 氯喹的平均斑点数分别为 0.07、1.13、0.10 和 2.77。图中还展示了代表性细胞的明场（BF）、LC3-AF647 信号（红色）、DAPI 核染色（蓝色）以及 LC3-AF647 与 DAPI 图像的叠加结果，分别对应于对照组（E，0 个斑点）、对照组 + 氯喹（F，1 个斑点）、饥饿处理组（G，0 个斑点）和饥饿处理组 + 氯喹（H，3 个斑点）。<a href="https://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/55637/55637fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
<img alt="显示 BDC3 p62/LAMP1/LC3 频率的自噬分析图表及含氯喹的显微镜图像。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55637/55637fig5.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 5"> 
图 5：BDC3 的 p62/LAMP1/LC3 直方图。 BDC3 的 p62/LAMP1/LC3 直方图，分别对应对照组（A，浅蓝色）、对照组 + 氯喹（B，蓝色）、饥饿处理组（C，粉色）和饥饿处理组 + 氯喹（D，红色）。对照组、对照组 + 氯喹、饥饿处理组和饥饿处理组 + 氯喹的平均 BDC3 评分分别为 0.57、0.82、0.74 和 0.98。BF；p62-AF488（绿色）；LAMP1-PE（黄色）；LC3-AF647（红色）；以及代表性细胞的 p62-AF488、LAMP1-PE 和 LC3-AF647 图像的合并图，分别显示对照组（E）、对照组 + 氯喹（F）、饥饿处理组（G）和饥饿处理组 + 氯喹（H）的结果。<a href="https://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/55637/55637fig5large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="自噬标志物分析；BDC3 p62/LC3/DAPI 比值图，荧光显微镜图像。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55637/55637fig6.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图6"> 
图6：饥饿 + 氯喹处理样本的 BDC3 p62/LC3/DAPI 比值直方图。（A）显示了饥饿 + 氯喹处理样本的 BDC3 p62/LC3/DAPI 直方图。平均 BDC3 得分为 0.07。（B）明场（BF）；p62-AF488（绿色）；LC3-AF647（红色）；DAPI（蓝色）；以及代表性细胞的 p62-AF488、LC3-AF647 和 DAPI 图像的合并图，对应于饥饿 + 氯喹处理样本的平均 BDC3 值。 <a href="https://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/55637/55637fig6large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="细胞自噬数据；散点图；LC3 斑点计数；BDC3 及 p62/LAMP1/LC3 分析" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55637/55637fig7.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图7"> 
图7：LC3斑点计数与BDC3 p62/LAMP1/LC3的双变量图 (A对照、对照+氯喹、饥饿及饥饿+氯喹处理的Jurkat细胞中LC3斑点数与BDC3 p62/LAMP1/LC3的双变量图。B明场；p62-AF488（绿色）；LAMP1-PE（黄色）；LC3-AF647（红色）；以及来自三个区域的 p62-AF488、LAMP1-PE 和 LC3-AF647 图像的合并图即， 饥饿+氯喹样本的低信号点、高信号点/低BDC3以及高信号点/高BDC3结果如图所示。 <a href="https://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/55637/55637fig7large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看该图的放大版本。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td>细胞计数</td>
			<td>亮细节共定位3均值</td>
			<td>LC3斑点计数均值</td>
			<td>低斑点百分比</td>
			<td>高斑点/低BDC3百分比</td>
			<td>高斑点/高BDC3百分比</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>对照</td>
			<td>439</td>
			<td>0.57</td>
			<td>0.07</td>
			<td>98.2</td>
			<td>1.8</td>
			<td>0.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>对照 + 氯喹</td>
			<td>1432</td>
			<td>0.82</td>
			<td>1.13</td>
			<td>68.9</td>
			<td>19.5</td>
			<td>11.7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>饥饿</td>
			<td>1204</td>
			<td>0.74</td>
			<td>0.10</td>
			<td>98.4</td>
			<td>0.6</td>
			<td>1.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>饥饿 + 氯喹</td>
			<td>1811</td>
			<td>0.98</td>
			<td>2.77</td>
			<td>32.1</td>
			<td>36.9</td>
			<td>31.0</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1：Jurkat细胞LC3斑点计数汇总 与 BDC3 p62/LAMP1/LC3 双变量图

本研究采用多光谱成像流式细胞术，结合分析功能，对3种自噬标志物的明场细节图像进行比较，并定量分析其共定位情况，同时进行LC3斑点计数，从而以客观、定量且具有统计学稳健性的方式检测自噬水平。

利用多光谱成像流式细胞术通过检测LC3、p62和LAMP1共定位评估自噬流

自噬是一种分解代谢途径，通过该途径，细胞在生长和分化过程中积累的正常或功能异常的组分被降解……

本实验的总体目标是通过结合 LC3 斑点定量，以客观、定量且具有统计学稳健性的方式，对三种自噬标志物的共定位进行量化，从而实现对自噬水平的准确测量。该方法能够在单次实验中同时检测三种自噬标志物的共定位情况，有望为自噬的诱导与调控机制提供新的见解。该技术的主要优势在于，可同时以客观、定量且统计学稳健的方式对三种自噬标志物进行检测。首先，将两倍十的六次方个Jurkat细胞加入已标记相应样本名称的15毫升离心管中。接着，向每根离心管中加入足够的洗涤缓冲液，使各样本终体积达到15毫升，然后通过离心形成细胞沉淀。将沉淀重悬于100微升4%甲醛溶液中，随后将样本转移至已标记的硅化聚丙烯微量离心管中。室温孵育10分钟后，用1毫升新鲜洗涤缓冲液洗涤样本。将沉淀重悬于100微升含目标第一抗体的破膜缓冲液中，室温避光孵育30分钟。用1毫升新鲜破膜缓冲液洗涤标记并破膜处理的细胞，随后按照上述方法加入下一个目标抗体进行标记。所有样本用终末抗体标记后，将沉淀重悬于1%甲醛溶液中，随后加入10微升10× DAPI核染色剂。轻轻涡旋混匀细胞，然后在室温避光孵育10分钟。孵育结束后，在多光谱成像流式细胞仪上加载默认模板，并选择适当的激光器。在每个激光按钮旁边的窗口中输入所需的激光功率，然后单击加载按钮，将1.5毫升离心管装入仪器。对全部细胞群体创建M01面积与M01长宽比的散点图，并在细胞周围绘制一个区域。将该区域命名为Cell。设置采集参数。指定目标文件夹和文件名，并将采集事件数更改为 5,000，然后选择细胞群体，单击“采集”以获取文件，并按照上述相同激光设置依次运行其余样品。采集完成后，单击“返回”以取回样品管。为了分析多光谱成像流式细胞术数据，请点击“开始分析”以在成像分析软件中运行打开文件向导，然后点击凋亡向导图标并点击选择向导按钮以打开凋亡向导。在将所有凋亡细胞从分析中去除后，围绕非凋亡细胞创建一个区域，并将此群体标记为细胞。接下来，点击模块化组件图标。选择一种颜色的荧光阳性，并选择细胞群体和MC通道三的强度。将X轴标记为lamp one强度，并绘制一个包含强度大于10,000的细胞的区域。将该区域标记为lamp one阳性。以相同方式圈选 P62 和 LC3 阳性细胞后，点击分析选项卡并选择掩膜。点击新建，然后选择函数。在函数下，选择峰检测。在掩膜下选择 M11。在通道下选择通道 11。将斑点与细胞背景的比值设为 4。然后单击“确定”关闭定义掩膜功能窗口，再单击“确定”将掩膜添加到掩膜列表中。单击“关闭”退出掩膜管理器，然后再次单击“分析”选项卡并选择“特征”。单击“新建”。在“特征类型”下，选择“点计数”，并选择刚刚创建的峰值掩膜。将名称输入为“点计数 LC3”，然后点击“确定”。再次点击“新建”。在“特征类型”中，选择亮细节共定位三或 BDC3。在“掩膜”中，选择 MC。在“图像一”中，为 P62 选择通道二。在“图像二”中，为 LAMP1 选择通道三。在第三幅图像下方，为 LC3 选择通道 11。将名称输入为 BDC3p62/LAMP1/LC3，然后单击“确定”并关闭以退出特征管理器。单击新的散点图图标，选择 LAMP1 阳性、p62 阳性、LC3 阳性的细胞群。选择 BDC3/p62/LAMP1/LC3 作为 X 轴，选择斑点计数 LC3 特征作为 Y 轴，然后单击确定。在文件菜单下，选择保存数据分析文件，单击保存，再单击是，将饥饿加氯喹的数据以数据分析文件的形式保存，并替换该文件的先前版本。现在打开对照文件，选择适当的补偿矩阵，并将饥饿加氯喹的数据分析文件作为模板。单击“确定”。为了创建自噬小体聚集区域和自噬溶酶体聚集区域，请打开对照样本，并从X轴坐标0.1至3、Y轴坐标1.5至0.3绘制一个矩形区域。将此区域命名为“low spots”。接下来，从 X 轴坐标 0.1 到 1、Y 轴坐标 17.5 到 1.5 的范围内绘制一个区域，并将该区域命名为 high spot low BDC3；然后从 X 轴坐标 1 到 3、Y 轴坐标 17.5 到 1.5 的范围内绘制另一个区域，并将该区域命名为 high spots/high BDC3。保存控制文件以便用作模板，然后使用该控制文件作为模板打开其他文件，包括饥饿加氯喹处理的文件，操作方法如前所述。LC3 斑点在不同细胞中的大小、形状和亮度可能存在显著差异，这一点可通过 Jurkat 细胞中使用不同斑点掩模所获得的 LC3 斑点掩蔽图像观察到。在本实验中效果最佳的掩膜是峰形掩膜，其斑点与细胞背景的比值为4。在这些代表性的抗LC3标记的Jurkat细胞斑点计数中，对照组与饥饿处理组的平均斑点数无显著差异。当加入氯喹后，对照组加氯喹与饥饿处理组加氯喹的平均斑点数之间出现显著差异。在本实验中，对照组 BDC3 共定位均值与饥饿组均值之间，以及对照组加氯喹均值与饥饿组加氯喹均值之间均出现了偏移。BDC3 未考虑共定位的自噬细胞器数量，导致相同 BDC3 评分对应的自噬小体数量存在较大变异性。事实上，在大多数情况下，三种探针之间均存在重叠，因为即使在基础水平，p62、LAMP1 和 LC3 也应在细胞的某些相似区域发生一定程度的共定位。作为对照，此处展示了三种不应共定位的探针（p62、LC3 和 DAPI）上 BDC3 特征的示例。当斑点计数与 BDC3 特征结合时，不同亚群的存在使得区分各种样本和条件的能力显著增强。一旦掌握，该技术若操作得当，大约可在八小时内完成。然而，若需要采用不同的斑点计数功能，则需额外的分析时间。在进行该实验时，务必注意使用适当的对照。例如，使用对照样本设定Beyza水平阈值，并将对照组加氯喹样本作为饥饿组加氯喹样本的对照。该方法也可通过更换为相应的目标抗体，简单拓展应用于其他需要三种不同标记物共定位的细胞内实验。观看本视频后，您应能够充分掌握如何使用自噬标志物对细胞进行标记，如何在多光谱成像流式细胞仪上获取数据，以及如何分析数据以评估自噬流。请注意，使用福尔马林可能具有极高危险性，在进行本操作时，必须采取佩戴适当的个人防护装备等预防措施。

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科研

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Biology

生物学

通过使用多光谱成像流式细胞术测量LC3，p62和LAMP1共定位评估自噬通量

自噬是一种普遍存在的过程，使细胞能够降解并回收蛋白质和细胞器。我们采用先进的荧光显微技术，对自噬诱导过程中发生的微小但关键的物理变化进行可视化和定量分析，包括自噬体和溶酶体的形成与分布，以及它们融合形成自噬溶酶体的过程。...

利用先进的三维荧光显微镜对自噬进行定量分析

通过荧光标记的自噬标志物进行延时显微成像，可实现对动态自噬反应的高时间分辨率监测。结合三种不同颜色的特异性自噬和细胞器标志物，我们能够在稳定的空间和时间背景下追踪某蛋白质在自噬体形成过程中的作用。...

活细胞成像观察早期自噬事件：omegasome 及其相关过程

活跃的自噬作用与有效的肌肉再生密切相关，而肌肉再生对于肌肉干细胞（MuSC）的活化至关重要。本文提供了一种 原位 检测对照组和损伤小鼠肌肉组织切片中 MyoD 阳性肌卫星细胞（MuSCs）内自噬标志物...

原位 肌肉干细胞自噬的免疫荧光染色

本文介绍了一种在哺乳动物细胞中测量整体自噬捕获活性的简单且经过充分验证的实验方案。该方法基于定量分析可沉淀细胞组分中乳酸脱氢酶（LDH）所占的比例，并将其与细胞总LDH水平进行比较。...

乳酸脱氢酶封存检测——一种测定哺乳动物细胞大分子自噬封存活性的简单可靠方法

我们描述了通过自噬和蛋白酶体在小鼠肝脏中测量蛋白质分解代谢生物节律的实验方案。...

测量自噬和蛋白酶体流的昼夜节律

线粒体自噬是线粒体质量控制的主要机制。然而，线粒体自噬的评估 体内 由于缺乏可靠的定量检测方法，该过程受到限制。本文介绍了一种利用细胞膜通透性绿色荧光线粒体染料和红色荧光溶酶体染料，在活细胞中观察线粒体自噬的实验方案。...

利用线粒体与溶酶体荧光染料可视化线粒体自噬

本实验方案的目的是通过LC3免疫荧光染色及LC3点状结构定量分析，检测胰腺癌细胞和胰腺腺泡细胞中的自噬水平。...

利用LC3免疫荧光评估两种不同胰腺细胞模型中的自噬水平

本文介绍了一种基于内源性荧光标记的优化切片上相关光镜-电镜联用技术方案，用于研究稀有蛋白质相对于细胞超微结构的定位。该方法的优势通过在未使用巴佛洛霉素处理的饥饿细胞中实现内源性LC3蛋白的超微结构定位得以展示。...

通过切片上相关联的光学-电子显微镜对内源性LC3进行超微结构定位

本文介绍了通过免疫印迹法简洁评估细胞外囊泡（EVs）中自噬体标志物LC3-II水平的方法。对EVs中LC3-II水平、自噬溶酶体形成以及omegasome形成的分析表明，当自噬体与溶酶体融合受阻时，STX6在释放LC3-II阳性EVs中具有新的作用。...

通过细胞外囊泡评估LC3-II的释放及其与细胞内LC3阳性囊泡积聚的关系

本文介绍了IP-FCM方法，该方法无需基因工程或大量样本，即可对天然蛋白质-蛋白质相互作用进行灵敏、稳健的生化分析。...

IP-FCM：通过流式细胞术检测的免疫沉淀

了解如何使用多光谱成像流式细胞术定量分析Jurkat细胞中LC3、p62和LAMP1的共定位，以客观、统计严谨的方式评估自噬通量。该方法可同时检测三种自噬标志物，提高实验的准确性和可重复性。

利用多光谱成像流式细胞术通过检测LC3、p62和LAMP1共定位评估自噬流

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