Name: 心肌肌细胞基致动器和自稳定Biorobot - 第1部分 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-11T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 22 s
Description: 了解如何利用柔性PDMS悬臂梁和心肌细胞构建自稳定游泳生物机器人。本方案详细演示了具有可调浮力和磁性的复合PDMS基底制备工艺，为生物混合机器人系统开发提供可复现的技术路径。

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M. T. Holley 获得路易斯安那州校董会研究生研究员项目的支持，C. Danielson 获得霍华德·休斯医学研究所教授项目的支持。本研究获得美国国家科学基金会资助项目（编号：1530884）的支持。作者感谢先进微结构与器件中心（CAMD）洁净室提供的支持。

1. 计算聚二甲基硅氧烷及添加剂的质量
<ol>
	<li>使用以下公式计算在后续步骤中特定高度所需的PDMS质量， 
	M = ϱ*V = ϱ * 高度*面积&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; (1)， 
	其中“高度”为层的厚度，“面积”为PDMS固化所用容器的底面积，“ϱ”为混合物的密度，“V”为体积。 
	注：用于高度计算的密度值为：PDMS = 0.965 g/mL，Ni-PDMS = 1.639 g/mL，MB-PDMS = 0.648 g/mL。</li>
	<li>使用公式(1)估算在给定容器中为获得生物致动器基底层特定高度（5 mm）所需的PDMS质量。PDMS混合物的密度为0.965 g/mL。 
	注：PDMS基础剂与固化剂的质量比为10:1。 
	Mbase = ϱ*V = ϱ*V*(<img alt="公式" src="/files/ftp_upload/55642/55642eq1.jpg" />)&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; (2) 
	Mcuring agent = ϱ*V = ϱ*V*(<img alt="公式" src="/files/ftp_upload/55642/55642eq2.jpg" />)</li>
	<li>使用公式(1)计算在给定容器中为获得生物机器人底部基底层特定高度（1.5 mm）所需的Ni-PDMS质量。 
	注：质量比分别为1:1.88（镍粉:PDMS基础剂）和1:1.71:0.171（镍粉:PDMS基础剂:PDMS固化剂）。Ni-PDMS混合物的密度为1.639 g/mL。 
	MNickel = ϱ*V = ϱ*V*(<img alt="公式" src="/files/ftp_upload/55642/55642eq3.jpg" />)&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; (3) 
	Mbase = ϱ*V = ϱ*V*(<img alt="公式" src="/files/ftp_upload/55642/55642eq4.jpg" />) 
	Mcuring agent = ϱ*V = ϱ*V*(<img alt="公式" src="/files/ftp_upload/55642/55642eq5.jpg" />)</li>
	<li>同样地，使用公式(1)计算在给定容器中为获得生物机器人顶部基底层特定高度（3.5 mm）所需的MB-PDMS质量。 
	注：质量比分别为1:5（微球:PDMS基础剂）和1:4.54:0.454（微球:PDMS基础剂:PDMS固化剂）。MB-PDMS混合物的密度为0.648 g/mL。 
	MMicroballoon = ϱ*V = ϱ*V*(<img alt="公式" src="/files/ftp_upload/55642/55642eq6.jpg" />)&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; (4) 
	Mbase = ϱ*V = ϱ*V*(<img alt="公式" src="/files/ftp_upload/55642/55642eq7.jpg" />) 
	Mcuring agent = ϱ*V = ϱ*V*(<img alt="公式" src="/files/ftp_upload/55642/55642eq8.jpg" />)</li>
	<li>使用分析脚本检查具有目标尺寸和几何形状的生物机器人的动态稳定性；参见补充材料中的“Biorobot_dynamic_stability.m”和“CG_CB_calculation.m”文件。</li>
</ol>
2. 在固定基底上构建生物驱动器
注意：见图 1a。
<ol>
	<li>旋涂一层PDMS薄膜（见图1a-1和a2）。所得PDMS薄膜的厚度将为 25 &#181;m.
	<ol>
		<li>将硅片置于光刻胶旋涂仪上，并打开泵开关以产生吸力。 
		注意: 硅片直径为4英寸，且 500 &#181;m 厚度</li>
		<li>倒入正性光刻胶（例如 将S1808涂覆到硅片上，直至硅片表面完全覆盖。将旋涂仪程序设置为2,000 rpm旋转20秒，然后踩下脚踏板启动旋涂。旋涂结束后关闭真空吸力。</li>
		<li>将加热板加热至 120 &#176;C使用晶圆镊子从匀胶机上取下硅片，并将硅片直接放置于加热板上。用浅层培养皿覆盖硅片，加热烘烤10分钟。 
		注意: 可使用烤箱以相同的温度和时间烘烤晶圆。 图1a-1 展示了这一过程。</li>
		<li>将一个塑料容器放在电子天平上归零。向容器中加入6 g PDMS基底液，再加入0.6 g PDMS固化剂。充分混合PDMS溶液5分钟。 
		注意：混合后，混合物应充满气泡。</li>
		<li>将混合好的PDMS容器放入真空室中。将真空室压力降至100 mbar，保持容器在真空室中30分钟。解除真空，取出容器。使用前保持容器加盖。</li>
		<li>将带有固化光刻胶层的硅片放置在旋涂仪上。缓慢地将全部脱气的PDMS混合物倒在硅片上。 
		注意：缓慢倾倒，以免向混合物中引入新的气泡。</li>
		<li>将旋转器设定为1,200 rpm，离心5分钟。开启旋转器的吸力并启动旋转器。离心结束后关闭吸力。 
		注意：这些设置将导致 25 &#181;m 厚层PDMS</li>
		<li>将烤箱加热至 40 &#176;C使用晶圆镊子从旋转涂覆仪上取下硅片，然后将其放入烘箱中。在烘箱中过夜烘烤后，于室温下冷却硅片。 
		注意： 图1a-2 展示了这一过程。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>薄层PDMS的激光刻蚀。
	<ol>
		<li>打开激光雕刻机及其排风设备的电源开关。开启与激光雕刻机相连的计算机。启动激光雕刻机配套软件。</li>
		<li>在……之下 &#34;文件&#34; 可选步骤：打开图2e所示的生物驱动器设计文件。
		<ol>
			<li>按压 &#34;设置&#34; 按钮。单击 &#34;蓝色&#34; 并将功率设置为3%，速度设置为4%。点击“设置”。点击 &#34;黑色&#34; 并改变 &#34;模式&#34; 跳过。然后单击“Set”。对后续内容执行相同操作 &#34;红色&#34;. 按下 &#34;应用&#34; 按钮以完成设置。</li>
			<li>推入 &#34;激活雕刻仪&#34; 右上角的按钮</li>
		</ol>
		</li>
		<li>按压 &#34;重新定位&#34; 点击按钮将设计移至软件屏幕中央。</li>
		<li>按压 &#34;聚焦视图&#34; 点击程序中的按钮，然后点击屏幕上生物机器人边缘的位置。这将使激光雕刻机的引导激光点移动到相应位置。</li>
		<li>使用镊子手动移动晶圆，使晶圆上与2.2.4步骤中点击位置相对应的点位于引导激光点正下方。</li>
		<li>按压 &#34;开始雕刻上一个任务&#34; 单击按钮以启动刻蚀过程。刻蚀完成后取出晶圆。关闭所有设备。 
		注意： &#34;开始雕刻上一个任务&#34; 按钮为大型绿色三角形。切勿直视雕刻过程，因为激光可能损伤眼睛。 图1a-3 展示了这一过程。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>生物驱动器基底的制备与构建
	<ol>
		<li>将玻璃珠（直径3 mm）倒入15 mL离心管中。加入用去离子水配制的70%乙醇浸没玻璃珠，浸泡24 h。去除乙醇，用去离子水充满离心管，继续浸泡24 h。倒出去离子水，将离心管置于加热板上 50 &#176;C 以促进玻璃珠的干燥。</li>
		<li>在式（1）计算出的PDMS质量基础上增加3 g，以补偿浇注过程中附着在容器壁上的PDMS。使用式（2）计算PDMS基础剂与固化剂的用量。</li>
		<li>将一个塑料容器放在电子天平上并归零。将2.3.2步骤中确定的PDMS基础液量倒入容器中，并再次归零。然后将2.3.2步骤中确定的PDMS固化剂量倒入同一容器中。</li>
		<li>将PDMS充分混合5分钟。 
		注意：PDMS 使用比例为10:1（基础剂：固化剂）。混合物中应含有大量气泡。</li>
		<li>将用于烘烤的容器放在天平上归零。小心地将步骤 2.3.2 中配制（并在步骤 2.3.4 中混合均匀）的适量 PDMS 倒入容器中。以规律间隔将清洗干净的玻璃珠滴入 PDMS 混合物中。每个玻璃珠周围需预留至少 5 mm 的空间，作为生物致动器基部的区域。</li>
		<li>将容器放入真空室中，将真空压力降至100 mbar后关闭真空泵。30分钟后解除真空，取出容器。使用前保持覆盖。 
		注意：随着混合物脱气以及真空室发生泄漏，腔内压力可能会随时间缓慢上升。如果压力升高超过100 mbar，应启动真空泵，将压力恢复至100 mbar。</li>
		<li>将加热板加热至 40 &#176;C将PDMS容器和玻璃珠小心地放在加热板上，盖上容器，过夜烘烤。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>生物驱动器组装。 
	注意：以下步骤可直接用肉眼观察进行。
	<ol>
		<li>使用剃刀从2.3部分制备的块状PDMS中切割出（5 mm × 5 mm × 5 mm）的立方体。 
		注意：每个立方体的中心应放置一个珠子。</li>
		<li>用胶带按压每个生物致动器基座的各个侧面，以去除基座表面的任何污染物，然后揭下胶带。每侧均重复此操作。</li>
		<li>重复步骤 2.3.2 至 2.3.6，制备少量液态 PDMS。将针尖浸入液态 PDMS 中，然后在步骤 2.2 制备的晶圆上已刻蚀的基底区域滴加一滴液态 PDMS。涂抹 PDMS 液滴，使其完全覆盖 5 mm × 5 mm 的基底区域。 
		注意：基底区域是中间的方形部分 图2a.</li>
		<li>使用镊子将2.4.2步骤中清洗后的立方体放置在涂有液态PDMS的基底区域上。</li>
		<li>重复步骤 2.4.3 &#34;滴加一滴液态PDMS&#34; 直至完成每个设备的制作，并执行步骤 2.4.4。</li>
		<li>将加热板加热至 40 &#176;C将带有组装结构的硅片小心地放置于加热板上。盖上盖子，过夜烘烤。 
		注意: 保持组装状态直至使用。 图1a-4 展示最终装置。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 生物机器人制备（图1b）
<ol>
	<li>旋涂并激光刻蚀一层薄 PDMS 膜
	<ol>
		<li>使用新的硅片重复步骤 2.1 和 2.2 中的所有操作。这将得到一个带有薄层 PDMS 和光刻胶的硅片，其中光刻胶上刻有生物机器人设计。 
		注意：在重复步骤 2.2 时，应使用生物机器人设计进行激光刻蚀，而非之前使用的生物致动器设计。图 1b-1 和 b-3 描述了这些过程。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>PDMS 复合材料的制备与加工 
	注意：以下步骤可用肉眼完成。
	<ol>
		<li>将酚醛微球倒入一个 50 mL 离心管中至装满，加入 70% 乙醇（溶于去离子水中），静置 24 小时。倒出乙醇，加入去离子水，再静置 24 小时。倒出去离子水后，将离心管置于 50 °C 的加热板上，以促进微球在使用前的干燥。</li>
		<li>使用公式 (1)，结合 MB-PDMS 的密度和 3.5 mm 的高度，计算所需 PDMS 的体积。额外增加 3 g 的量，以补偿倾倒后残留在容器中的材料。使用公式 (3) 计算 PDMS 基体和固化剂的用量。使用天平准确称取相应量的 PDMS 基体、固化剂和微球。</li>
		<li>使用公式 (1)，结合 Ni-PDMS 的密度和 1.5 mm 的高度，计算所需 PDMS 的体积。与步骤 3.2.2 一样，额外增加 3 g 的量。使用公式 (2) 计算 PDMS 基体和固化剂的用量。使用天平准确称取相应量的 PDMS 基体、固化剂和镍粉。</li>
		<li>分别将 MB-PDMS 和 Ni-PDMS 的混合物搅拌 5 分钟。使用天平，小心地将步骤 3.2.2 和 3.2.3 中计算出的正确量的 MB-PDMS 和 Ni-PDMS 分别倒入不同的容器中。 
		注意：应使用金属或玻璃棒彻底搅拌混合物，但避免刮擦容器底部表面。混合物中会含有气泡。</li>
		<li>将两个容器放入真空腔中，将压力降至 100 mbar 并维持 30 分钟。解除真空后取出容器，并在使用前保持覆盖状态。</li>
		<li>将加热板加热至 40 °C，将装有 MB-PDMS 和 Ni-PDMS 的容器置于加热板上。盖上每个容器，烘烤过夜。 
		注意：储存时应加盖，直至使用。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>生物机器人组装
	<ol>
		<li>使用剃刀片从 Ni-PDMS 和 MB-PDMS 材料上切割出与各生物机器人尺寸相对应的基底。基底设计参见图 2b-2d。 
		注意：Ni-PDMS 的厚度为 1.5 mm，MB-PDMS 的厚度为 3.5 mm。</li>
		<li>通过将基底按压到胶带并撕下的方式，清洁生物机器人基底的所有表面，以去除表面污染物。每侧均重复此操作。</li>
		<li>打开电晕放电器。将电晕放电器的尖端置于放置在金属板上的 Ni-PDMS 基底上方约 1 cm 处，金属板与基底之间垫有洁净室擦拭纸。移动尖端绕基底处理 15 秒，以完成表面处理。 
		注意：电晕放电器与基底之间应产生放电现象。若未发生放电，应将尖端逐渐靠近，直至出现放电。</li>
		<li>重复步骤 3.3.3，以相同时间处理在步骤 3.1 中刻蚀的生物机器人基底表面。使用镊子将经过处理的 Ni-PDMS 面贴合到薄膜的处理面上，静置 5 分钟。 
		注意：这将使两部分牢固粘合。参见图 1b4。</li>
		<li>使用尖头镊子将生物机器人悬臂梁从硅片上剥离，并将其放置在 Ni-PDMS 基底的底部。使用镊子将整个组件从硅片上取下。 
		注意：悬臂梁将附着在 Ni-PDMS 基底上。图 1b-5 和 b-6 描述了此过程。</li>
		<li>在 MB-PDMS 基底顶部滴加少量未固化的 PDMS（基体与固化剂比例为 10:1）。使用镊子将带有薄层 PDMS 的 Ni-PDMS 面与含有未固化 PDMS 的 MB-PDMS 面贴合。将组件放入塑料培养皿中，然后置于 40 °C 加热板上过夜固化。 
		注意：图 1b-7 展示了最终装置。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 装置的功能化
注意：： 以下，我们描述了用于细胞接种的设备准备过程。
<ol>
	<li>准备所需材料：纤连蛋白溶液（50 µg/mL）、磷酸盐缓冲液（PBS）、添加了10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素抗生素的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM完全培养基）。</li>
	<li>将100 µL纤连蛋白溶液滴加至T-25培养瓶的中央（培养瓶直立时的底部表面）。每个装置需使用独立的培养瓶。</li>
	<li>将生物机器人或生物致动器倒置放置于纤连蛋白溶液液滴上，确保悬臂展开并浸入液滴中。在37 ℃下孵育30分钟。</li>
	<li>孵育结束后，吸除纤连蛋白溶液，并用PBS洗涤两次。</li>
	<li>吸除PBS后，向培养瓶中加入10 mL DMEM培养基。在37 ℃下孵育1小时，以促进PDMS的脱气。为使生物机器人完全浸没于10 mL培养基中，可使用磁铁将装置固定在培养瓶底部。将装有样品的培养瓶置于超声波清洗仪中处理5分钟，以去除气泡。 
	注意：在孵育过程中，PDMS表面会形成气泡，此处称为脱气。生物机器人组装中使用的Ni-PDMS具有磁性。生物致动器无需使用磁铁，因其玻璃微珠的重量足以使其保持在培养瓶底部。生物机器人或生物致动器组装体现已准备就绪，可用于细胞接种，具体步骤详见第2部分。</li>
</ol>

<ol><li>Williams, B., Anand, S., Rajagopalan, J., Saif, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+self-propelled+biohybrid+swimmer+at+low+Reynolds+number%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+commun%22%5BJournal%5D)">A self-propelled biohybrid swimmer at low Reynolds number.</a> Nat commun. 5, (2014).</li>
<li>Nawroth, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+tissue-engineered+jellyfish+with+biomimetic+propulsion%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A tissue-engineered jellyfish with biomimetic propulsion.</a> Nat Biotechnol. 30 (8), 729-797 (2012).</li>
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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露

在水生游泳生物中可以观察到多种运动机制16。本研究中生物机器人所采用的运动机制为基于鳍的运动方式，具体为箱鲀型运动。箱鲀型游泳者通过摆动尾部（悬臂结构）并配合刚性躯体（分层基底）实现推进16。箱鲀和牛鱼等鱼类即采用此类运动方式。箱鲀型游泳者通常速度较慢，且身体形态效率较低。尽管箱鲀式游泳在速度上存在不足，但这种游泳方式使工程师能够在基底或身体部分集成多种功能（如动态稳定性）。本研究开发的生物机器人设计基于一个坚固的基底以实现浮力和稳定性，并采用自驱动悬臂结构作为推进机制。在本研究中制造生物机器人的最重要步骤之一是使用薄膜聚二甲基硅氧烷（PDMS）并通过激光雕刻工艺形成悬臂结构。若悬臂结构不够洁净，或PDMS配比不当（影响弹性）、厚度不准确（影响弹簧常数）、尺寸不合适（无法提供足够表面积以支持心肌细胞融合性黏附并产生运动），则生物机器人将无法正常运作。此外，还必须通过超声处理彻底去除悬臂表面的所有气泡，以创造适合心肌细胞附着的可行表面。
所开发的PDMS复合材料MB-PDMS和Ni-PDM...

生物驱动器和生物机器人正在被积极研究，以期为多种应用提供一种传统机器人技术的替代方案。目前已开发出能够行走5,6,7,8、游泳1,2,3,4、泵送9,10或抓握11,12,13 的生物机器人。类似地，肌细胞可被整合到三维卷曲的PDMS结构中14。通常，生物机器人的骨架采用软光刻技术，使用水凝胶和PDMS（聚二甲基硅氧烷）等材料制造。这些材料因其柔韧性、生物相容性以及刚度易于调节而成为理想选择。通常将活体肌细胞与这些材料结合，以通过收缩产生驱动力。哺乳动物的心肌细胞（心肌细胞）和骨骼肌细胞在驱动应用中占主导地位。除这两种细胞外，昆虫肌肉组织也已在室温下用于驱动生物机器人3。在本项分为两部分的研究中，选择心肌细胞是因为其具有自发收缩的特性6。
早期关于生物机器人（biorobot）的研究大多集中于开发生物驱动器，而对生物机器人结构的优化及其关键功能的构建则长期被忽视。近年来，已有少数研究报道了受自然界推进模式启发的多种游泳方式的实现。这些方法结合了聚二甲基硅氧烷（PDMS）薄膜与肌细胞，以模拟各种自然推进机制。例如，已有基于鞭毛的推进方式1、仿生水母推进2、生物混合型魟鱼机器人4以及基于薄膜PDMS的游泳装置13的报道。
本文介绍了能够自主稳定游动深度以及俯仰和横滚姿态的自稳定游动生物机器人（biorobot）的制备过程。该生物机器人具有一个固态基底或主体结构，通过表面附着心肌细胞的单个悬臂梁进行驱动。当心肌细胞收缩时，会引发悬臂梁沿纵向发生弯曲变形。这种游动方式被归类为箱鲀型游动（ostraciiform swimming）。箱鲀型游动的一个独特优势在于可在基底上集成额外功能模块。例如，基底可用于提供额外浮力，以携带其他载荷，或集成用于控制心肌细胞收缩的电路系统。
在以往的生物机器人研究中，生物机器人的稳定性常常被忽视。本研究通过设计采用不同复合PDMS材料且具有不同质量密度的基底，实现了生物机器人的自主稳定。该生物机器人因此能够抵抗外界干扰，并在无人工辅助的情况下维持其下潜深度、俯仰角和横滚角。第一层为微球PDMS（MB-PDMS）， 即 PDMS 混合微球，可降低生物机器人密度，使其能够在培养基中漂浮。第二层为 PDMS 悬臂，其厚度经过精确设计，使得心肌细胞产生的力可使悬臂显著弯曲，弯曲角度从 45° 至 90°。底层为镍-PDMS（Ni-PDMS） 即 混有镍粉的PDMS。该层具有多种功能：具有磁性，因此在细胞接种过程中可通过磁铁将生物机器人固定在培养基底部；镍混合物的密度高于MB-PDMS和培养基，可确保生物机器人在漂浮时保持直立状态；该层的重量可在任何俯仰和滚动角度下为生物机器人产生恢复力矩；此外，Ni-PDMS与MB-PDMS之间的体积比可维持生物机器人的浸没深度。本研究所提供的实验方案对于致力于表征肌细胞与组织搏动力的研究人员，以及希望构建游动型生物机器人的研究者具有重要参考价值。
本文第二部分以及近期的研究工作15中详细描述了功能化生物致动器和生物机器人装置的细胞接种、细胞的机械与生化表征，以及装置功能的定量分析。

<table><tbody><tr><td>聚二甲基硅氧烷（PDMS）</td><td>道康宁</td><td>184 sil elast kit&amp;nbsp; 0.5kg</td><td>Sylgard 184</td></tr><tr><td>镍粉</td><td>西格玛-奥德里奇</td><td>266981-100G</td><td></td></tr><tr><td>酚醛微球</td><td>US Composites</td><td>BJO-0930</td><td></td></tr><tr><td>硅晶圆</td><td></td><td></td><td>直径4英寸</td></tr><tr><td>PWM101轻型匀胶机</td><td></td><td></td><td>旋涂仪</td></tr><tr><td>正性光刻胶（S1808）</td><td>道康宁</td><td>DEM-10018197</td><td></td></tr><tr><td>加热板</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>真空腔室</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>M206机械对流烘箱</td><td></td><td></td><td>对流烘箱</td></tr><tr><td>激光雕刻机</td><td>Universal Laser System</td><td>VLS2.30</td><td>采用10 W、10.6 &amp;micro;m波长的CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;激光器</td></tr><tr><td>Universal Laser Systems应用软件</td><td>Universal Laser System</td><td></td><td>用于运行VLS 2.30的软件</td></tr><tr><td>Matlab</td><td>MathWorks</td><td></td><td>数值分析程序</td></tr><tr><td>Scotch胶带</td><td>Scotch品牌</td><td></td><td></td></tr><tr><td>实心玻璃珠</td><td>西格玛-奥德里奇</td><td>Z265926-1EA</td><td>钠钙玻璃，直径3 mm</td></tr><tr><td>电子天平</td><td>梅特勒-托利多</td><td>EL303</td><td></td></tr><tr><td>BD-20AC实验室电晕处理仪</td><td>Electrotechnic Products</td><td>12051A</td><td>电晕放电器</td></tr><tr><td>1.9 L超声波清洗机</td><td>费希尔科技</td><td>15-337-402</td><td>40 kHz工业换能器</td></tr><tr><td>牛血浆纤维连接蛋白</td><td>西格玛-奥德里奇</td><td>F1141</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s磷酸盐缓冲液（PBS）</td><td>西格玛-奥德里奇</td><td>D1408-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s改良Eagle培养基（DMEM）</td><td>Hyclone Laboratories</td><td>16750-074</td><td>含4500 mg/L葡萄糖、4.0 mM L-谷氨酰胺和110 mg/L丙酮酸钠</td></tr><tr><td>Fetalclone III血清</td><td>Hyclone Industries, GE</td><td>16777-240</td><td>胎牛血清</td></tr><tr><td>青霉素G钠盐</td><td>西格玛-奥德里奇</td><td>P3032</td><td></td></tr></tbody></table>

基于心肌细胞的驱动器与自稳定生物机器人——第一部分

Cardiac Muscle-cell Based Actuator and Self-stabilizing Biorobot - PART 1

生物机器，通常被称为生物机器人，是一类以活细胞或活体组织为基础的装置，其动力完全来源于活体成分的收缩活动。由于具有内在优势，生物机器人正逐渐引起关注，被视为传统全人工机器人的替代选择。已有多种研究致力于利用生物驱动器的性能，但直到最近，才开始有研究对生物机器人的性能进行定量表征，并通过几何结构优化来提升其功能与效率。本文展示了一种可自我稳定的游动型生物机器人，能够在无需外部干预的情况下维持其俯仰角、深度和滚动状态。本文第一部分描述了用于生物驱动器和生物机器人的PDMS支架的设计与制备，以及随后通过纤连蛋白进行功能化的步骤。在本两部分文章的第二部分中，我们将详细介绍心肌细胞的整合过程，并对生物驱动器与生物机器人的功能进行表征。两者均包含一个基座和尾部（悬臂结构），通过鳍状推进产生运动。尾部采用软光刻技术结合PDMS材料与激光雕刻工艺制造。在将尾部与装置基座组装后，对其进行细胞黏附蛋白功能化处理，并完全接种心肌细胞。生物驱动器的基座由一块实心PDMS块和中央的玻璃珠（作为配重）组成。而生物机器人的基座则由两种复合PDMS材料构成：Ni-PDMS和微球-PDMS（MB-PDMS）。Ni-PDMS中的镍粉可在细胞接种过程中实现磁控操作，并在运动过程中提高稳定性。MB-PDMS中的微球可降低材料密度，使生物机器人能够漂浮并稳定游动。利用这两种具有不同质量密度的材料，可精确调控整体质量分布，从而确保生物机器人在任意角度下均产生正向恢复力。该技术成功实现了磁控自稳定游动型生物机器人的构建。

生物致动器与生物机器人具有非常相似的制备流程，因为生物机器人是生物致动器的自然延伸（图1）。首先开发生物致动器，旨在建立生物机器人所需的技术，分析细胞产生的力，并从力学和生物化学角度表征细胞的成熟过程；这些内容在本文第二部分以及我们近期发表的研究15中均有详细描述。
在心肌细胞片完全收缩期间，针对悬臂梁曲率半径的显著变化，评估并调节了驱动器的弹簧常数。随后，在设计生物机器人时，我们特别考虑了其稳定性、细胞接种过程中的可控性以及运动的便捷性。最初选择了几种不同特性的设计方案，如图2b-2d所示，以评估哪些特性对设计需求的影响最大。我们设计并测试了具有短、长和宽悬臂梁的生物机器人，以及具有多个悬臂梁的结构，以探究驱动器变化对生物机器人功能的影响。我们还考虑了浮动基座的不同尺寸。基座的几何形状保持为三角形，因其可产生导致定向运动的不对称性。</...

在本项分为两部分的研究中，利用高柔性的聚二甲基硅氧烷（PDMS）悬臂和活体肌肉细胞（心肌细胞）研制出一种生物驱动器，并对其进行了表征。该生物驱动器结合由改性PDMS材料制成的基底，构建出一种能够自我稳定的游动生物机器人。

生物机器，通常被称为生物机器人，是基于活细胞或组织的装置，其动力完全来源于活体细胞的收缩活动……

本视频的总体目标是介绍如何利用心肌细胞中的柔性PDMS悬臂梁开发并表征一种生物驱动器。随后将这些驱动器与经过改造的基底结合，构建出自稳定游动生物机器人。本文所述的验证方法具有独特性，即通过改造机械基底结构，形成一种能够自稳定游动的生物机器人，并可通过外部磁体确定其位置。该技术的主要优势在于，可通过改变基底性质来调节装置的浮力并实现自稳定。该方法可用于开发其他需要自稳定和漂浮功能的新型装置。通常，初次接触该方法的研究人员会遇到困难，因为对悬臂梁进行机械变形具有挑战性。由于其尺寸较薄，容易撕裂或粘连成不规则形状。该方法的视觉演示至关重要，因为若无视觉辅助，相关步骤与组装过程难以掌握。首先，将硅片放置在光刻胶旋转涂布仪上。在晶圆上涂覆一层薄薄的光刻胶，并以 2,000 RPM 转速旋涂 20 秒，以获得 1.2 微米的目标厚度。接着，使用晶圆镊子将涂覆好的晶圆转移至预热至 120 摄氏度的加热板上。用浅底培养皿覆盖晶圆，并烘烤 10 分钟。称取六克PDMS基础剂，与0.6克PDMS固化剂混合。将PDMS组分充分搅拌五分钟。将PDMS混合物放入真空腔，抽真空至100毫巴并维持30分钟。完成后，解除真空，取出容器。在需要使用PDMS之前，保持容器加盖。待晶圆冷却后，将其重新放回光刻胶旋涂仪上。将脱气后的PDMS混合物缓慢倾倒在整个晶圆上，避免引入新的气泡。然后以1,200 RPM的转速旋涂晶圆5分钟。使用晶圆镊子将晶圆从旋涂仪上取下，并放入预热好的烘箱中。将晶圆烘烤过夜，然后冷却至室温。接下来，准备激光刻蚀仪以对薄层PDMS进行图案化。首先打开激光刻蚀仪及其排风系统。然后打开连接激光雕刻机的计算机，并启动激光雕刻机软件。在“文件”菜单下，打开生物致动器设计文件。按下“设置”按钮，点击“蓝色”，将功率设置为3%，速度设置为4%；点击“设置”，再点击“红色”，将模式更改为跳过。然后单击“设置”。对黑色执行相同操作。按“应用”按钮以完成设置。接下来，选择激活雕刻机，然后按“重新定位”以将设计移至屏幕中央。接着，按下“聚焦视图”按钮，并单击设计边缘，使引导激光点移动到相应位置。使用戴着手套的手小心地将晶圆与引导激光点对齐。对齐后，选择“开始雕刻上一个任务”以启动雕刻过程。为了制备生物致动器基底，需要一个用于烘烤的容器。首先，将该容器放在天平上并归零。然后倒入预混好的PDMS，并将清洁过的直径为3毫米的玻璃珠以一定间隔放置在PDMS混合物上。每个玻璃珠周围需预留至少5毫米的空间，用于生物致动器基底。将容器放入真空室，将真空度降低至100毫巴，然后关闭真空泵。30分钟后解除真空，取出容器。在使用前保持容器加盖。接下来，将加热板升温至40摄氏度，小心地将装有PDMS和玻璃珠的容器置于加热板上。盖上容器，过夜烘烤。冷却后，使用刀片从块状PDMS中切割出边长为5毫米的立方体，使每个立方体中心包含一颗玻璃珠。用针尖蘸取新制备的液态聚二甲基硅氧烷，在晶圆刻蚀的基底区域滴加一滴。涂抹液滴使其完全覆盖5毫米×5毫米的基底区域。最后，用镊子将含有玻璃珠的立方体放置于已覆盖液态聚二甲基硅氧烷的基底区域上。对每个器件重复此过程。完成后，将晶圆转移至40摄氏度的热板上，加盖后烘烤过夜。使用一对尖头镊子将悬臂从晶圆上剥离，并将其粘附至基座的侧壁上。然后通过拉拽基座，小心地将整个组件从晶圆上剥离。首先，重复生物致动器的制备流程，直至激光雕刻步骤；但在制备生物机器人时，在激光切割步骤中应采用生物机器人设计。接下来，按照随附的文字实验方案制备微气球PDMS混合物和镍粉PDMS混合物。使用天平将溶液小心倒入不同的容器中。将两个容器放入真空室，将压力降至100毫巴，持续30分钟。脱气完成后，将容器置于40摄氏度的加热板上过夜。使用剃刀刀片根据每种生物机器人尺寸对应的尺寸，从各聚合物中切割出生物机器人基底，如图所示。将镍-PDMS基底放置在金属板上，中间垫一张洁净室纸巾。然后打开电晕放电器，将放电尖端置于基底上方1厘米处。在基底表面移动尖端，持续处理15秒。以相同时间重复此过程，对激光雕刻的基底表面进行处理。然后使用镊子将镍-聚二甲基硅氧烷（PDMS）的处理面放置在薄膜的处理面上。让装置静置五分钟，使各部分结合在一起。接着，使用一对尖头镊子将生物机器人悬臂从晶圆上剥离，并将其放置在镍-PDMS基底的底部。然后将整个组件从晶圆上取下。为了将微气球PDMS连接到该组件上，首先在组件顶部放置一滴未固化的PDMS。接着用镊子将带有薄膜PDMS的镍基PDMS侧面置于未固化PDMS液滴上。将整个组件放入一个塑料培养皿中，然后置于40摄氏度的加热板上过夜固化。为准备细胞接种装置，首先为每个装置取一个独立的T25培养瓶，在其中心加入100微升纤连蛋白溶液。然后将生物机器人或生物驱动器倒置在纤连蛋白溶液液滴上方。确保悬臂梁完全展开并浸入液滴中，随后将烧瓶在37摄氏度下孵育30分钟。孵育结束后，移除纤连蛋白溶液，并用PBS洗涤装置两次。然后移除PBS，向烧瓶中加入10毫升DMEM，该培养基补充有10% FBS和1%青霉素。将装置在 37 摄氏度下孵育 1 小时，以脱除 PDMS 中的气体。然后使用磁铁将生物机器人固定在烧瓶底部，并将装有样品的烧瓶置于超声清洗仪中处理 5 分钟，以去除所有气泡。为确定每层复合材料的合适厚度，测试了多种镍与微米级空心球在 PDMS 中的不同混合比例。镍制PDMS层可实现对机器人的磁控与稳定。此外，微气球PDMS层使生物机器人能够漂浮并稳定游动。这两层结构的结合形成了生物机器人的自稳定框架。通过计算机脚本对稳定性进行了数值分析，并证明采用这种双层方法具有较强的恢复力矩。在整个操作过程中，必须注意保持悬臂的清洁，并维持PDMS混合物的正确比例以及悬臂的适当厚度。观看本视频后，您应理解弹性体材料如何被加工成支持心肌细胞的薄型悬臂，以及如何对其进行改性以获得浮力或磁性等新特性，从而实现更高级的功能。可通过结合其他技术（如图案化对齐立方体）来修改此验证程序，以促进细胞定向并提高第四代细胞的产量。请注意，使用激光雕刻仪可能具有极高的危险性，在执行此操作时，必须采取佩戴适当的防护服和护目镜等安全预防措施。

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生物工程

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