基于心肌细胞的执行器与自稳定生物机器人——第二部分

本研究的总体目标是将心肌细胞接种到微加工装置中，并表征这些装置上细胞的生物化学和生物力学特性及其随时间推移的功能表现。本文所述方法可轻松修改，适用于其他需要在微加工装置上进行高密度细胞接种的实验。本视频中开发的生物致动器的主要优势在于，其可被便捷地用于量化任何其他细胞类型的细胞收缩力。

该方法还可用于研究干细胞在分化过程中生物力学特性的变化。本方法的可视化演示至关重要，因为仅通过文字描述难以掌握细胞接种步骤。这些步骤必须规范操作，以确保细胞在悬臂臂上形成融合性贴壁，这是保证其正常生物学功能的关键。

本实验操作将由我实验室的 Neerajha Nagarajan 演示。使用生物机器人时，从 T25 培养瓶开始。用磁铁将机器人固定在培养瓶底部。

生物致动器不需要磁铁，因为基部玻璃珠的重量会使其无法移动。将一小片正方形塑料片卷成漏斗状，用作漏斗，并将无菌漏斗置于生物机器人内的致动器上方。调整较宽一端的直径以适配装置，并调整高度，使得当烧瓶顶部拧紧时，漏斗能紧密贴合。

使用一个单独的烧瓶来测试并调整漏斗的适配度。漏斗紧密贴合可确保细胞不会泄漏到其余培养基中，这对于实现悬臂臂的融合覆盖至关重要。

将漏斗放置到位后，用完全DMEM重悬心肌细胞，细胞密度为每毫升1600万个，然后通过每个漏斗缓慢滴加400微升细胞悬液至装置上。接着，缓慢将培养瓶放回培养箱中，注意不要扰动装置或其中的漏斗。在37摄氏度下孵育24小时，使细胞贴壁。

孵育结束后，缓慢移去漏斗。用 PBS 轻柔地清洗样品，并向每个培养瓶中重新加入 10 毫升新鲜的完全 DMEM 培养基。然后，将生物机器人上的磁铁移除，使样品悬浮，并将培养瓶放回培养箱中。

在培养箱中安装配备变焦镜头的相机，以观察培养中的装置。然后，添加LED灯带作为光源。接下来，将相机连接到计算机并打开成像程序。

进入程序后，点击“文件”选项卡中的相机图像，打开所有相机选项并选择已连接的相机。在选项卡列表中选择“实时预览”，通过调节镜头旋钮手动对图像进行聚焦。接下来，从顶部面板选择裁剪感兴趣区域。

然后，在视频画面中手动绘制一个矩形框，将生物驱动装置和悬臂臂包含在内，以标记感兴趣区域。对于生物机器人，应捕获整个屏幕，以记录装置的游动运动。接下来，选择相机设置，并通过调整实时图像的曝光时间和像素比来设定帧率。

将帧率设置为约每秒30帧。最后，点击录制按钮以开始录制视频。通过点击图标打开编程软件。

加载后，单击“文件”，选择“打开”，然后选择用于运行图像分析的 m 脚本文件。确保记录的 TIF 图像及其 AVI 版本与 m 文件位于同一文件夹中，然后单击“运行”以执行脚本。按“播放”以启动实际程序。

运行后，点击“打开”按钮，找到待分析的 TIF 或 AVI 文件。然后点击基座按钮，选择悬臂在顶部与基座连接的点，然后按 Enter 键。

接下来，对于每一帧，在图像上放置一个方形标记，以表示悬臂梁基部的位置。然后，单击标尺按钮，手动点击玻璃微珠的一侧边缘。将鼠标指针移至玻璃微珠的对侧，然后按 Enter 键。

这将绘制一条测量玻璃微珠直径的线，并将该直径与显示的像素关联起来。点击“分析”按钮，然后在悬臂上靠近代表悬臂基部的第一个方块标记的短距离处点击。

继续沿悬臂梁（包括针尖）点击，并在完成后按 Enter 键。这将在悬臂梁的每个点击位置放置一个 X 标记。最后，检查叠加的圆形是否准确地追踪了悬臂梁的轮廓。

如果正确，请点击下一个帧按钮。这将切换到 TIF 文件中的下一个帧。对所有帧重复此过程。

所有帧处理完成后，单击“导出”按钮。首先打开图像分析软件，加载游泳生物机器人视频文件，然后打开电子表格软件。

在已加载的生物机器人视频中，找到一个尺寸参照物，例如玻璃珠。使用直线工具在玻璃珠上画一条线。然后点击“分析”并选择“设置比例尺”。

将“已知距离”字段设置为 3,000 微米，然后点击“确定”。在设备上选择一个在各帧之间不会晃动的点作为标记点，并在电子表格中记录该点的 X 和 Y 坐标。切换回图像分析软件窗口，按右箭头键进入下一帧。再次指向该标记点，并在电子表格中记录新的 X 和 Y 坐标。

对所有帧重复此过程，并使用所得数据按照随附的文字方案分析生物机器人的运动。致动器的静态应力和动态应力每天从表面应力中提取。静态应力是指细胞在静息状态下对表面产生的收缩应力，动态应力是指细胞在最大收缩时产生的应力。

随着细胞在培养过程中逐渐成熟，静态应力和动态应力随时间推移呈逐渐增加趋势。在第6天，细胞表现出的最大细胞牵引力为50毫牛顿每米，最大收缩力约为165毫牛顿每米。与静态和动态应力变化趋势一致，心肌细胞成熟、生长与铺展以及细胞间连接性的标志物也持续增加，直至第6天。

根据视频分析，此处展示了三种具有不同游泳模式的生物机器人在平均游泳速度、拍打频率以及每拍移动距离方面的比较。尽管垂直型生物机器人的拍打频率最低，但其表现出最高的游泳速度和移动距离。观看本视频后，您应能够充分理解如何在微加工装置上接种心肌细胞，以构建可作为生物驱动器和生物机器人的功能系统。

本视频中所述的图像采集及后续数据分析过程，展示了一种便捷的方法，可用于表征细胞行为以及设备性能。在进行该操作时，需注意心肌细胞的寿命有限，其细胞活性在第6天达到峰值，随后随时间逐渐下降。