Name: 活细胞成像血小板脱水和分泌流量 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-10T10:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 42 s
Description: 学习使用活细胞成像技术在流动条件下追踪血小板脱颗粒和分泌过程。该方法可在亚细胞水平实时观察血小板功能，为血栓与止血机制研究提供多功能平台。

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CM 承认获得了国际C1抑制剂缺乏症患者组织（HAEi）、乌得勒支大学医学中心之友基金会以及兰茨泰纳输血研究基金会（LSBR）的经济支持。

乌得勒支大学医学中心的当地医学伦理委员会已批准采集血液用于 离体 研究目的，包括本研究的目的。
1. 溶液配制
<ol>
	<li>通过将10 mM HEPES、0.5 mM Na2HPO4、145 mM NaCl、5 mM KCl、1 mM MgSO4 和 5.55 mM D-葡萄糖溶解于蒸馏水中，制备4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸（HEPES）Tyrode缓冲液。
	<ol>
		<li>制备两种缓冲液变体：分别将pH值调节至6.5和7.4。每次实验当天新鲜配制缓冲液。根据需要添加10 ng/mL前列环素。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过将50 mM Tris和150 mM NaCl溶解于蒸馏水中，并将pH值调节至9.0，制备Tris缓冲盐水（TBS）。</li>
	<li>通过将85 mM三钠柠檬酸盐、71 mM柠檬酸和111 mM D-葡萄糖溶解于蒸馏水中，制备酸性柠檬酸葡萄糖（ACD）溶液。</li>
	<li>将2%（v/v）多聚甲醛（PFA）加入pH为7.4的HEPES Tyrode缓冲液中，配制固定液。加热溶解（50–70 °C），并将pH调至7.4。分装后于-20 °C保存。使用前在37 °C解冻。</li>
	<li>将1%（m/v）人血清白蛋白（HSA）溶解于pH为7.4的HEPES Tyrode缓冲液中，制备封闭缓冲液。</li>
	<li>将4.8 g聚乙烯醇加入12 g甘油中，充分混合。再加入12 mL蒸馏水，室温下旋转过夜。
	<ol>
		<li>加入24 mL 0.2 M Tris-HCl（pH 8.5），边搅拌边加热至50 °C，持续30分钟。加入1.25 g 1,4-二氮杂双环[2.2.2]辛烷（DABCO），充分混匀。以1,500 × g离心5分钟。将上清液分装（每1 mL可满足15–20张载玻片的用量），于-20 °C保存。分装液仅限使用一次。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 盖玻片准备
<ol>
	<li>将盖玻片（25 × 50 mm2）在未稀释的铬硫酸中浸泡过夜以去除油脂。用蒸馏水冲洗盖玻片，并在60 °C的烘箱中干燥过夜。</li>
	<li>用一滴水将一段石蜡膜（10 × 15 cm2）粘附在实验台面上，通过抚平石蜡膜排除其中的空气。用移液器将80 µL浓度为10 µg/mL的VWF或100 µg/mL的纤维蛋白原液滴加到石蜡膜上。将盖玻片放置于液滴上，蛋白溶液将在两表面之间铺展，覆盖盖玻片整个背面。室温（RT）孵育1.5小时。</li>
	<li>移除石蜡膜，将盖玻片（涂层面向上）放入4孔板中，加入封闭缓冲液进行封闭。37 °C孵育1小时，或4 °C孵育过夜。作为对照，对未包被VWF或纤维蛋白原的盖玻片进行同样封闭处理。</li>
</ol>
3. 富血小板血浆（PRP）的制备
<ol>
	<li>通过静脉穿刺采集枸橼酸盐抗凝全血（终浓度：0.32% 柠檬酸钠（M/V））。</li>
	<li>将血液在室温下以160 × g离心15分钟，不启用刹车。收集上清液（即， 用塑料巴斯德吸管将PRP转移。 
	注意：离心后可观察到三层（从上到下依次为）：富血小板血浆（PRP）、白细胞和红细胞。确保不要收集白细胞和红细胞部分。通常，离心一支9 mL血液采血管后可获得约3 mL PRP。</li>
	<li>如果实验将使用洗涤后的血小板，请继续进行第4部分。如需富血小板血浆（PRP），请继续下一步操作。</li>
	<li>采集PRP后，将剩余血液（含红细胞沉淀）再次以2,000 × g离心10分钟，不启用刹车。收集上清液，其中含有乏血小板血浆（PPP）。 
	注意：通常在此第二次离心步骤后可收集到 2 mL。</li>
	<li>使用细胞分析仪对PRP中的血小板数量进行计数，并用PPP（步骤3.4）将其稀释至浓度为150,000个血小板/µL。 
	注意：稀释后PRP的总体积取决于供体的血小板计数。不同供体之间的血小板计数差异较大，因此PRP的稀释需根据个体情况进行评估。血小板计数在150,000至450,000个/µL范围内被视为正常。</li>
	<li>继续至第5节。</li>
</ol>
4. 洗涤血小板的制备
<ol>
	<li>使用细胞分析仪测定PRP中的平均血小板体积（MPV）。 
	注意：这是血小板预激活的指标11。静息状态血小板的正常MPV为7.5–11.5 fL11。在血小板洗涤过程中，MPV的增加不应超过1.5 fL。</li>
	<li>向PRP中加入1/10体积的ACD以防止血小板预激活，并在室温下以400 × g离心15分钟（不启用刹车）。弃去上清液，将沉淀物小心地重悬于HEPES Tyrode缓冲液（pH 6.5）中，体积与原始PRP相同。</li>
	<li>通过加入TBS将前列环素分装液解冻至浓度为10 µg/mL，并置于冰上保存。</li>
	<li>为防止血小板激活，向重悬的血小板中加入前列环素至终浓度为10 ng/mL，并立即在室温下以400&#160;× g离心15分钟（不启用刹车）。弃去上清液，将沉淀物小心地重悬于HEPES Tyrode缓冲液（pH 7.4）中。</li>
	<li>计数血小板数量（步骤3.5），并测定MPV的变化（步骤4.1）（MPV变化不应超过1.5 fL）。</li>
	<li>用HEPES Tyrode缓冲液（pH 7.4）将血小板数量调整至150,000个/µL。实验前在室温下静置30分钟使其恢复。分离后4小时内使用洗涤后的血小板进行实验。</li>
</ol>
5. 流动腔室组装
注意：这些实验使用了一种实验室自制的流动腔室12。也可使用多种市售的流动腔室，只要其能够容纳盖玻片，并且最好可将盖玻片取出以进行后续分析。本实验所用的流动腔室由聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）制成，可精确适配显微镜载物台插件。腔室包含一个进液口和一个出液口（图1A-C；1, 2），以及一个真空连接口（图1A 和 C；3）。在其顶部放置一个定制的硅胶垫片（图1A 和 D；4）。两个切口形成真空通道（图1A 和 D；5），用于将盖玻片（图1A；6）紧密固定在腔室上。中央的切口构成流动通道（图1A 和 D；7；宽度为 2.0 mm，高度为 0.125 mm）。进液口和出液口与流动通道相连，真空接口则与真空通道相连。
<ol>
	<li>用蒸馏水覆盖流室顶部，并将定制的硅胶片光滑面朝下放置于水面上。通过去除多余的水，使硅胶片漂浮至正确位置，同时保持其位置不变。 
	注意：该硅胶片可重复使用（硅胶以其惰性著称）；通常未观察到血小板在其表面黏附。硅胶片可用洗涤剂清洗后重复使用，直至材料损坏（即撕裂，尤其是通道之间的区域）。一般情况下，一张硅胶片可在每天进行多次实验的情况下使用20天。</li>
	<li>将流室在60 °C下孵育1小时，以蒸发残留水分，使硅胶片牢固地黏附于流室上。</li>
	<li>使用塑料巴斯德吸管，向流道中加入一滴pH 7.4的HEPES-Tyrode缓冲液。将盖玻片（见第2节）有涂层的一面朝下放置于流道上。将真空泵连接至真空接口（图1A 和 C；3），施加约10 kPa的压力。</li>
</ol>
6. 血小板的预染色及抗体的制备
<ol>
	<li>血小板染色
	<ol>
		<li>将洗涤后的血小板与10 µg/mL DAPI在37 °C避光孵育30分钟。为去除未结合的DAPI并防止血小板活化，加入前列环素至终浓度为10 ng/mL，并立即在室温下以400 × g离心15分钟，不启用刹车。</li>
		<li>用HEPES Tyrode缓冲液（pH 7.4）重悬血小板沉淀，调整血小板浓度至150,000个血小板/µL。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>抗体的制备
	<ol>
		<li>将生物素标记的抗体与Alexa标记的链霉亲和素按1:1的摩尔比混合。使用前在室温下孵育至少10分钟（步骤7.6）。 
		注意：不同批次的生物素标记效率可能存在差异。若目标分子的可视化出现问题，应进行对照实验，以确认生物素标记是否成功，以及特定生物素化抗体的目标结合特性。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
7. 灌注
<ol>
	<li>启动荧光显微镜及显微镜软件。使用表1中列出的显微镜设置。 
	注意：通过在显微镜软件中加载适当的实验，启动用于活细胞可视化和记录血小板以及所选荧光标记抗体和/或染料的显微镜和记录设置。流动实验在室温（RT）下进行。</li>
	<li>通过将10 mL注射器连接至进样管路，并将1% HSA封闭缓冲液吸入进样管路，以封闭进样管路。在室温下孵育15分钟。通过将HEPES Tyrode's缓冲液（pH 7.4）吸入进样管路，冲洗进样管路。</li>
	<li>将已封闭的进样管路和未经处理的出样管路（直径均为1.02 mm，长度约20–30 cm）分别连接至腔室的进样口和出样口。将一个10 mL注射器（或更小体积以提高精度）连接至出样管路。开启注射泵。 
	注意：注射器的直径与泵上设定的流速共同决定了体积流速。结合流动通道的表面积，可根据下方公式13 计算剪切速率。因此，可通过改变注射泵的流速或调整流动通道的尺寸来调控剪切速率。剪切速率800–1,600 s-1通常用于模拟动脉血流，而25–100s-1用于模拟静脉血流。在此装置中，7.5 µL/min的流速对应25 s-1的剪切速率。 
	剪切速率 = 6Q / h2w，单位为s-1 
	其中：Q = 体积流速（mL/s），h = 通道高度（cm）（0.0125 cm；即硅胶片厚度），w = 通道宽度（cm）（本腔室为0.2 cm）。</li>
	<li>在100倍物镜（总放大倍数1,000倍）上滴加一滴浸油，并将腔室安装到显微镜上，使玻璃面朝下。</li>
	<li>将进样管路插入盛有HEPES Tyrode's缓冲液（pH 7.4）的试管中。手动拉动连接在出样管路上的注射器活塞，使溶液流经腔室，以排除系统中的空气。将注射器放入注射泵（图1B 和C；8），短暂运行泵以压紧活塞并确保流动稳定。</li>
	<li>将抗体和/或染料加入血小板悬液或PRP中，用塑料移液器小心混匀，并将混合物转移至1.5 mL离心管中。 
	注意：对于在剪切速率25s-1（7.5 µL/min）下进行的典型30分钟灌注实验，至少需要225 µL血小板悬液。代表性结果中所用抗体见表2。</li>
	<li>在挤压管路（排出空气）的同时，将进样管路从HEPES Tyrode's缓冲液（pH 7.4）转移至含有PRP或洗涤后血小板及抗体和/或染料的1.5 mL离心管中（图1B 和C；9）。 
	注意：转移管路时必须挤压管路以防止空气进入。后续可通过类似方式将进样管路转移至另一试管，从而用多种试剂处理已黏附的血小板。潜在有用试剂列表见表3。</li>
	<li>在软件中选择&#34;实时可视化&#34;选项，将显微镜聚焦于包被盖玻片表面，并以1,600s-1（484 µL/min）的剪切速率启动泵，直至血小板到达流动腔室。此时，通过将注射泵设置调整为7.5 µL/min的流速，将剪切速率降至25s-1。</li>
	<li>监测包被盖玻片表面，待首个血小板开始黏附时，将显微镜聚焦于该血小板，并在软件中启动实验开始记录。本实验所用记录设置见表1。</li>
	<li>目视观察实时记录过程。30分钟后，停止注射泵。 
	注意：确保实验过程中血小板始终处于焦点范围内。通常在1,000倍放大倍数下视野中约有20–30个血小板黏附；整个流动通道中约有2,000–3,000个血小板。</li>
	<li>使用流动腔室进行固定（可选）。
	<ol>
		<li>在注射泵停止、流动终止后，将进样管路（无气泡）转移至固定液中。重新启动泵，并以与步骤7.8相同的流速使固定缓冲液流经通道至少10分钟。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>从显微镜上取下腔室，清除玻璃上的浸油，断开真空，用18 G针头小心地将盖玻片从腔室中取出。 
	注意：防止盖玻片破裂或损坏硅胶片。</li>
	<li>将盖玻片（细胞面朝上）放置于4孔板中的组织上，该组织已用蒸馏水预先润湿。 
	注意：此举可防止盖玻片黏附于孔底表面并避免干燥。</li>
	<li>在盖玻片上加入750 µL固定液，在室温下孵育1小时。若样品无法立即分析，可将其保存于0.5% PFA（用HEPES Tyrode's缓冲液pH 7.4稀释）中，4 °C保存以确保固定稳定。随后进入第8节，对盖玻片进行成像前处理。</li>
	<li>使用后，用蒸馏水冲洗腔室、管路和硅胶片，并在洗涤剂溶液中过夜孵育。再次使用前，用蒸馏水冲洗。</li>
	<li>保存包含所有元数据的显微镜原始数据文件。如需导出，可将视频导出为.MOV（h.264压缩）或.AVI（无压缩）格式。单独帧可保存为JPEG或TIF文件。</li>
</ol>
8. 共聚焦荧光显微镜样品制备
<ol>
	<li>将盖玻片转移至新的4孔板中，用3 mL HEPES Tyrode缓冲液（pH 7.4）清洗5次。每孔加入3 mL封闭缓冲液，室温孵育1小时。</li>
	<li>移除封闭缓冲液；每孔加入3 mL含0.15%甘氨酸（质量/体积）的HEPES Tyrode缓冲液（pH 7.4），室温孵育15分钟。</li>
	<li>移除甘氨酸溶液，用每孔3 mL封闭缓冲液清洗5次。可选：在封闭缓冲液中稀释荧光标记抗体，进行额外染色，室温避光孵育1小时。</li>
	<li>用封闭缓冲液清洗5次，再用蒸馏水清洗2次。用纸巾从边缘向内轻轻吸去多余液体以干燥盖玻片，注意不要触碰细胞。</li>
	<li>用移液器吸取60 µL聚乙烯醇溶液滴加到显微镜载玻片上。将细胞面向下的盖玻片置于液滴上，使聚乙烯醇在两表面间均匀铺展。室温避光孵育过夜。</li>
	<li>通过共聚焦显微镜分析细胞14。</li>
	<li>保存包含所有元数据的原始图像序列数据文件。根据需要，将原始数据文件处理为MOV、h.264压缩或未压缩的.AVI格式文件。将独立的图像序列另存为JPEG或TIF文件。</li>
</ol>

<ol><li>Springer, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((von+Willebrand+factor%2C+Jedi+knight+of+the+bloodstream%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">von Willebrand factor, Jedi knight of the bloodstream.</a> Blood. 124 (9), 1412-1425 (2014).</li>
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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

血栓形成是全球范围内导致死亡和疾病负担的主要原因，而血小板在其发生过程中起着核心作用。本文描述了一种在流动条件下对血小板脱颗粒进行活细胞成像的方法。通常认为，血小板一旦被激活，其颗粒内的所有内容物会直接释放到溶液中。然而，本研究结果表明，情况并非总是如此。在黏附和脱颗粒过程中，血小板仍保留了大量多聚磷酸盐（图4）。此外，脱颗粒后，多聚体蛋白VWF仍与血小板表面相关联（图5）。这表明调控血小板颗粒脱颗粒的分子机制比通常认为的更为精细复杂。
为了在流动条件下实现血小板脱颗粒的活细胞成像，实验条件被设定为尽量减少血小板聚集。实验中使用的血小板计数为150,000个血小板/µL，处于正常范围的下限（150,000–450,000个血小板/µL）。此外，血小板黏附和铺展的研究是在固定的VWF或纤维蛋白原上进行的，这仅引起轻微的血小板活化（与例如胶原蛋白相比）。在使用洗涤血小板的研究中，较高的剪切速率会使这些细胞向流体中心移动，从而干扰黏附和后续的铺展过程，并使脱颗粒的观察变得复杂。
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血小板是无细胞核的血细胞，可在血液循环中流动。其主要功能是在损伤部位封闭血管破裂口，防止血液流失。在这些损伤部位，内皮下胶原纤维暴露，并随后被多聚体蛋白血管性血友病因子（von Willebrand factor, VWF）覆盖。VWF通过与血小板表面的糖蛋白Ibα-IX-V复合物相互作用，以依赖该复合物的机制捕获循环中的血小板1，从而减缓血小板的流动速度。这一过程在高剪切力条件下尤为重要。随后，血小板在接收到胶原提供的活化信号后发生形态学改变，导致不可逆的铺展，并最终引发血小板聚集。这两个过程均依赖于颗粒内容物的释放，以促进血小板之间的相互通讯。其中，血小板α颗粒含有纤维蛋白原和VWF，可通过整合素依赖的方式协助血小板黏附并连接血小板。血小板致密颗粒则含有无机化合物2，包括钙离子和二磷酸腺苷（ADP），有助于增强血小板的活化。此外，血小板还含有（过敏性）炎症介质3、补体调控蛋白4以及血管生成因子5,6，这引发了一个问题：在不同条件下，这些内容物是否以及如何被差异性释放。
自20世纪80年代以来，流动模型中血小板功能的研究对血栓形成机制的探讨具有重要价值7自那时以来，已取得大量技术进步，目前已有包含纤维蛋白形成的流体模型被开发出来，用于检测治疗用血小板浓缩物的止血潜力 离体8 或研究剪切速率扰动对血栓形态的影响9稳定黏附和生理性血栓形成（止血）与病理性血栓形成（血栓症）背后的分子和细胞生物学机制之间的差异可能极为细微，这促使研究人员开发出可在实时条件下可视化这些亚细胞过程的流动模型。
一个可从该装置中获益的示例过程是细胞内多聚磷酸盐的（重新）分布以及凝血因子的募集，以揭示其对纤维蛋白超微结构随时间变化的影响10。目前的研究通常局限于终点分析。本方法的主要目的是实现在流动条件下血小板活化过程中动态亚细胞事件的实时可视化观察。

<table><tbody><tr><td>4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸 (HEPES)&amp;nbsp;</td><td>VWR</td><td>441476L</td><td></td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>S-0876</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>31434</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>31248</td><td></td></tr><tr><td>MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Merck KGaA</td><td>1.05886</td><td></td></tr><tr><td>D-葡萄糖</td><td>Merck KGaA</td><td>1.04074</td><td></td></tr><tr><td>前列环素&amp;nbsp;</td><td>Cayman Chemical</td><td>18220</td><td></td></tr><tr><td>柠檬酸三钠</td><td>Merck KGaA</td><td>1.06448</td><td></td></tr><tr><td>柠檬酸&amp;nbsp;</td><td>Merck KGaA</td><td>1.00244</td><td></td></tr><tr><td>盖玻片</td><td>Menzel-Gl&amp;auml;ser</td><td>BBAD02400500#A</td><td>24 × 50 mm，No. 1 = 0.13 - 0.16 mm 厚度。</td></tr><tr><td>铬酸（2% CrO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;）</td><td>Riedel de Haen</td><td>07404</td><td>CAS [65272-70-0]。</td></tr><tr><td>血管性血友病因子 (VWF)</td><td>实验室自制纯化</td><td></td><td></td></tr><tr><td>纤维蛋白原</td><td>Enzyme Research Laboratories</td><td>FIB3L</td><td></td></tr><tr><td>4孔培养皿，未处理</td><td>Thermo Scientific</td><td>267061</td><td></td></tr><tr><td>人血清白蛋白 V 级</td><td>Haem Technologies Inc.</td><td>823022</td><td></td></tr><tr><td>采血管，9 mL，9NC 凝血用 3.2% 枸橼酸钠</td><td>Greiner Bio-One</td><td>455322</td><td></td></tr><tr><td>细胞分析仪&amp;nbsp;</td><td>Abbott Diagnostics</td><td>CELL-DYN 血液分析仪</td><td></td></tr><tr><td>多聚甲醛</td><td>Sigma</td><td>30525-89-4&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>注射泵</td><td>Harvard Apparatus, Holliston, MA</td><td>Harvard apparatus 22</td><td></td></tr><tr><td>10 mL 注射器，直径 14.5 mm</td><td>BD biosciences</td><td>305959</td><td>Luer-Lok 注射器</td></tr><tr><td>抗 CD63-生物素&amp;nbsp;</td><td>Abcam&amp;nbsp;</td><td>AB134331</td><td></td></tr><tr><td>抗 CD62P-生物素&amp;nbsp;</td><td>R&amp;D Systems</td><td>Dy137</td><td></td></tr><tr><td>4&amp;rsquo;,6-二脒基-2-苯基吲哚二盐酸盐 (DAPI)</td><td>Polysciences Inc.&amp;nbsp;</td><td>9224</td><td></td></tr><tr><td>链霉亲和素-Alexa Fluor 488 偶联物</td><td>Thermo Scientific</td><td>S11223&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>浸油</td><td>Zeiss</td><td>444963-0000-000</td><td></td></tr><tr><td>洗涤剂溶液</td><td>Unilever, Biotex</td><td></td><td></td></tr><tr><td>甘氨酸</td><td>Sigma</td><td>56-40-6&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>聚乙烯醇</td><td>Sigma</td><td>9002-89-5</td><td>Mowiol 40-88。</td></tr><tr><td>三羟甲基氨基甲烷盐酸盐</td><td>Sigma</td><td>1185-53-1&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>1,4-二氮杂二环[2.2.2]辛烷 (DABCO)</td><td>Sigma</td><td>280-57-9</td><td></td></tr><tr><td>羊抗人 VWF 多克隆抗体</td><td>Abcam&amp;nbsp;</td><td>AB9378</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488-NHS</td><td>Thermo Scientific</td><td>A20000</td><td></td></tr><tr><td>甘油</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>15523-1L-R</td><td></td></tr><tr><td>石蜡膜</td><td>Bemis</td><td>PM-996</td><td>4 英寸 × 125 英尺卷。</td></tr><tr><td>非增强型硅胶片</td><td>Nagor</td><td>NA 500-1</td><td>200 mm × 150 mm × 0.125 mm。</td></tr><tr><td>定制切割带灌注和真空通道的硅胶片</td><td>实验室自制</td><td></td><td>由非增强型硅胶片 (Nagor, NA 500-1) 制成</td></tr><tr><td>1.5 mL 离心管</td><td>Eppendorf AG</td><td>T9661-1000AE</td><td></td></tr><tr><td>荧光显微镜</td><td>Zeiss Observer Z1&amp;nbsp;</td><td></td><td>配备 LED 激发光源。</td></tr><tr><td>显微镜软件</td><td>Zeiss ZEN 2</td><td>蓝色版</td><td></td></tr><tr><td>18 G 针头 (18 G × 1 1/2&quot;)</td><td>BD biosciences</td><td>305196</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Riedel de Haen</td><td>31248375</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Roche</td><td>10708976</td><td></td></tr><tr><td>塑料巴斯德吸管</td><td>VWR</td><td>612-1681</td><td>&amp;nbsp;7 mL，非无菌，刻度至 3 mL。</td></tr><tr><td>硅胶管</td><td>VWR</td><td>228-0656</td><td>内径 × 外径 × 壁厚 = 1.02 × 2.16 × 0.57 mm。</td></tr><tr><td>显微镜载玻片</td><td>Thermo Scientific</td><td>ABAA000001##12E</td><td>76 × 26 × 1 mm，45 &amp;deg; 磨边，带磨砂端。</td></tr></tbody></table>

活细胞成像技术在流动条件下观察血小板脱颗粒与分泌过程

Live-cell Imaging of Platelet Degranulation and Secretion Under Flow

血小板在止血过程中起着至关重要的作用，即通过形成血栓来封闭血管损伤部位。它们也参与血栓形成过程，即血栓堵塞血管并导致器官损伤，可能产生危及生命的后果。这推动了针对血小板功能的科学研究，以及开发在流动条件下实时追踪细胞生物学过程的方法。
可用于研究血小板黏附与聚集（血小板生物学中的两个关键现象）的流动模型种类繁多。本文描述了一种在流动条件下实时研究血小板脱颗粒激活过程的方法。该方法采用与注射泵系统连接的流动腔室装置，并将其置于基于LED光源的倒置宽场荧光显微镜下。此处所述的装置可实现由荧光标记抗体或荧光染料提供的多种荧光团的同步激发。活细胞成像实验完成后，盖玻片可进一步用于静态显微镜分析即， 共聚焦显微镜或扫描电镜

图1展示了流室和实验装置的图像、硅胶片的位置与尺寸以及管路连接方式。图2提供了流室尺寸的详细信息。图3和视频1展示了血小板在固定化的血管性血友病因子（VWF）上黏附和铺展过程的时间序列图像。CD63是一种跨膜蛋白，存在于静息血小板胞内致密颗粒的膜中15。其随时间依赖性地向血小板表面动员的过程以绿色显示。类似地，P-选择素（Psel）是一种插入静息血小板胞内α颗粒膜中的跨膜蛋白。其随时间依赖性地向血小板表面动员的过程以橙色显示。图3B显示了通过共聚焦荧光显微镜在流动实验后以45°角获取的代表性图像。视频2展示了同一实验的倾斜系列图像。请注意，CD63主要位于中央颗粒区，而P-选择素则分布在整个细胞体上，并在边缘区域呈现集中分...

本研究介绍了一种基于荧光显微镜的方法，用于在流动条件下研究血小板的黏附、铺展和分泌。这一多功能平台可用于血小板功能的研究，为血栓形成和止血机制的探索提供支持。

血小板在止血过程中起着至关重要的作用，即通过形成血栓来封闭血管损伤。它们也参与血栓形成，即……

本实验的总体目标是利用活细胞成像技术在流动条件下追踪血小板的脱颗粒和分泌过程。该方法有助于解答血小板生物学领域的关键科学问题。该技术的主要优势在于，能够在活细胞中对血小板内容物进行亚细胞水平的多方面研究。尽管该方法可为血小板功能提供研究依据，但也适用于其他细胞类型，例如肥大细胞。通常，初次使用该方法的研究者会因血小板在分离过程中出现预激活而面临困难。我们最初提出该方法的构想，是源于意识到血小板分泌功能只能在终点阶段进行评估。实时图像可提供血小板颗粒释放动力学的信息。血小板分离步骤将由本研究所的学生 Silvia Pignatelli 进行演示。随后，Arjan Barendrecht 将演示实时成像实验。首先，将盖玻片浸入未稀释的铬硫酸中，于室温下孵育过夜以脱脂。次日，用蒸馏水冲洗盖玻片，随后将其置于60摄氏度的烘箱中过夜干燥。接下来，在实验台上滴加一滴水，并将一张10厘米×15厘米的石蜡膜覆盖在水滴上，去除实验台与石蜡膜之间的空气。然后用移液器将80 µL含10 µg/mL血管性血友病因子或100 µg/mL纤维蛋白原的溶液滴加到石蜡膜上。将干燥的盖玻片放置于液滴上，在室温下孵育一个半小时。接下来，向四孔板的每个孔中加入三毫升封闭缓冲液。将盖玻片有涂层的一面朝上，分别转移至板的各个孔中。在4°C下孵育过夜。将9毫升枸橼酸抗凝全血以160 ×g离心15分钟，期间不得中断。然后使用塑料巴斯德移液管收集含有富血小板血浆的上清液。按体积将1份酸性枸橼酸葡萄糖溶液加入9份血小板中，以防止血小板预先活化。然后在400 × g条件下离心血小板15分钟，期间不刹车。接着去除上清液，保留血小板沉淀。随后在pH为6.5的HEPES Tyrode缓冲液中小心地将沉淀重悬，恢复至血小板样品的原始体积。然后，向重悬的血小板中加入前列环素。立即离心样品，随后弃去上清液。小心地将沉淀重悬于pH 7.4的HEPES-Tyrode缓冲液中。接下来，将洗涤后的血小板放入细胞分析仪中，计数血小板数量。用pH为7.4的HEPES Tyrode缓冲液将样品中的血小板浓度调整至每微升150,000个血小板。重悬后，在室温下静置30分钟，使血小板恢复，然后进行实验。用蒸馏水覆盖流室顶部，并将定制的硅胶片光滑面朝下放置于水面上。通过去除多余的水，同时保持硅胶片位置不变，使其漂浮至适当位置。将流室在60摄氏度下孵育一小时，以蒸发残留水分，并使硅胶片牢固地粘附在流室上。使用塑料巴斯德移液管，向流道中加入一滴 pH 为 7.4 的 HEPES Tyrode 缓冲液。然后将制备好的盖玻片有涂层的一面朝下放置在流道上。打开真空泵，调节压力至约 10 千帕，并将真空泵连接至流室的真空接口。向洗涤后的血小板中加入终浓度为10微克/毫升的DAPI染料，并用铝箔包裹含有血小板的离心管，于37摄氏度孵育30分钟。为防止血小板活化，加入终浓度为10纳克/毫升的前列环素，随后立即在400 × g条件下离心15分钟（不使用刹车）以去除未结合的DAPI。用HEPES Tyrode缓冲液将血小板沉淀重悬，调节pH至7.4，恢复至原始体积，浓度为每微升150,000个血小板。然后打开荧光显微镜并启动显微镜软件。按照随附文本方案中表一描述的参数设置成像条件。通过连接一个10毫升注射器并将封闭缓冲液吸入入口管路，从而封闭入口管路。在室温下封闭15分钟，然后通过将HEPES Tyrode缓冲液7.4吸入入口管路来冲洗入口管路。将已封闭的入口管路和未经处理的出口管路分别连接至腔室的入口和出口。然后将10毫升注射器连接到出口管路上。在100倍物镜上滴加一滴浸油，并将腔室安装到显微镜上，使玻璃表面朝下。接着，将进样管插入含有pH为7.4的HEPES Tyrode缓冲液的试管中。手动拉动连接出口管路的注射器活塞，使溶液流过腔室，以排出系统中的空气。然后将注射器放入注射泵中，短暂运行泵以固定活塞并确保流速稳定。待流动系统准备就绪后，向血小板悬液中加入抗体和/或染料，并小心混匀。然后挤压进样管路，将其从缓冲液中移至含有标记血小板的离心管中。在软件中选择实时可视化模式。调节显微镜聚焦于盖玻片表面，并以484微升每分钟的流速启动泵。运行泵，直至血小板到达流室。随后，将流速降低至 7.5 µL/min。监测盖玻片表面。一旦第一个血小板开始黏附，立即将显微镜聚焦于该血小板，并通过软件启动实验开始记录。持续记录30分钟，然后停止注射泵。保存包含所有元数据的显微镜原始数据文件。必要时，将视频导出为 MOV H.264 压缩格式或 AVI 无压缩格式。将单独的帧保存为 JPEG 或 TIF 文件。成像结束后，从显微镜上取下培养腔，清除玻片上的浸油，断开真空连接，并使用 18 号针头小心地将盖玻片从培养腔中取出。将细胞面向上放置的盖玻片置于已用蒸馏水润湿的滤纸上的新四孔板中。随后在盖玻片上加入750微升固定液，于室温避光条件下孵育1小时。若样品无法立即进行分析，可将其置于0.5%多聚甲醛中，于4摄氏度保存，以确保固定效果稳定。这是在涂有固定化血管性血友病因子的玻璃载片上，血小板黏附和铺展过程的时间序列图像。绿色显示的是CD63，这是一种跨膜蛋白，会随时间依赖性地转移到血小板表面。同样，橙色显示的P-选择素也是一种跨膜蛋白，存在于细胞内α颗粒膜上，参与血小板的滞留。流实验结束后，可利用共聚焦荧光显微镜对血小板黏附情况进行倾斜系列成像。如图所示，CD63 主要位于中央颗粒区，而 P-选择素则分布在整个细胞体上，并在细胞边缘区域呈现集中分布。在这些实验中，不含细胞核 DNA 的血小板预先与呈现蓝色的 DAPI 进行孵育。在此情况下，DAPI 对多聚磷酸盐和致密颗粒进行染色。随后出现的绿色染色显示 CD63 随时间依赖性地动员至血小板表面。尽管存在明显的致密颗粒释放迹象，单细胞分析仍显示多聚磷酸盐保留在这些血小板内部或表面。掌握该技术后，可在六小时内完成四次独立的流式实验。在进行该操作时，重要的是防止血小板预先活化，这可通过小心操作细胞悬液来实现。完成此操作后，可采用共聚焦显微镜等其他方法，进一步研究目标分子在三维空间中的分布情况。观看本视频后，您应能够充分理解如何在单细胞水平下研究血小板在流动条件下的功能。

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科研

JoVE Journal

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生物学

活细胞成像血小板脱水和分泌流量

血小板黏附级联反应发生在剪切流存在的条件下，而传统的（静态）孔板检测方法并未考虑这一因素。本文报道了一种利用微流控孔板形式模拟生理剪切流条件的血小板聚集检测方法。...

基于微流控流动小室的血小板黏附与聚集流动实验

本文报道了一种荧光活体显微技术，用于在活体小鼠的血管炎症和血栓形成过程中，可视化活化内皮上血小板与中性粒细胞之间的异型相互作用。该显微技术将有助于研究血管疾病的分子机制，并可在病理生理条件下评估药理学试剂的作用。...

活体小鼠血管炎症和血栓形成过程中活化内皮上血小板-中性粒细胞异型相互作用的实时成像

白细胞通过细胞旁路或跨细胞途径穿过内皮单层。我们建立了一种简单的方法，用于在生理流动条件下追踪内源性连接蛋白VE-cadherin和PECAM-1在白细胞跨内皮迁移过程中的分布，以区分这两种迁移途径。...

生理流动条件下中性粒细胞跨内皮迁移过程中内皮细胞间连接的实时成像

采用血液重建和微流控流动腔模拟血小板输注与止血过程，以研究血液库保存血小板的功能。体外实验数据展示了血小板储存损伤对止血功能的影响。...

使用重建血液的微流控流动腔室体外模拟止血和血小板输注 In Vitro

本文描述了一种同时测量血小板功能和凝血功能的止血实验模型。该模型可实时检测血小板和纤维蛋白的荧光信号，并测定血小板黏附速率、凝血速率以及凝血启动时间。该模型用于评估输注用浓缩制剂中血小板在流动条件下的促凝血特性。...

一种用于血小板输注与止血研究的微流控流动腔模型可实时测量血小板沉积与纤维蛋白形成

微流控流动腔, 血小板输注, 止血, 血小板沉积, 纤维蛋白形成, 实时监测, 血栓形成, 凝血功能评估, 体外模型, 血液动力学

血管壁损伤或炎症期间，白细胞会积极地与血管细胞和血小板相互作用。本文介绍一种基于层流的简便检测方法，用于表征白细胞与其细胞伙伴之间相互作用的分子机制。...

基于层流的检测方法用于研究白细胞在培养的血管细胞和黏附血小板上的募集作用

我们描述了一种在溶液中利用锥板黏度计对血小板表面受体施加均匀剪切力的方法。该方法也可更广泛地用于对其他细胞类型和细胞碎片施加剪切力，且无需针对特定的配体-受体对。...

通过锥板黏度计法检测人血小板及细胞表面受体的均匀剪切力测定

本文描述了利用双光子显微镜对活体小鼠颅骨骨髓中的巨核细胞及其血小板前体（proplatelets）进行成像的方法。...

体内 小鼠颅骨骨髓中巨核细胞与前血小板的双光子成像

促凝血血小板的形成与血栓风险增加相关。本文介绍一种从人血中分离洗涤血小板的精确方案，旨在定量检测磷脂酰丝氨酸的暴露和微囊泡的释放，这两者是促凝血血小板的显著特征。...

通过检测人纯化血小板磷脂酰丝氨酸暴露及微囊泡释放表征促凝血血小板

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微流控技术在血小板功能评估中的应用

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学习使用活细胞成像技术在流动条件下追踪血小板脱颗粒和分泌过程。该方法可在亚细胞水平实时观察血小板功能，为血栓与止血机制研究提供多功能平台。

活细胞成像技术在流动条件下观察血小板脱颗粒与分泌过程

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