Name: 镍 - 席夫碱的水解复杂环境条件适宜酸不稳定保护基团的保留 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-06T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 44 s
Description: 学习从镍-席夫碱配合物中温和水解分离非天然氨基酸并进行Fmoc保护的方法。该方案可在pH 4.5-7.5条件下完全保留酸不稳定侧链保护基，适用于固相肽合成。

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由斯莱普里罗克大学提供资助。我们感谢斯莱普里罗克大学的T. Boron III和宾夕法尼亚大学的C. Haney提出的宝贵见解。

1. 镍-席夫碱配合物的水解
<ol>
	<li>在250 mL圆底烧瓶中，于室温下搅拌，将1 mmol的Ni-PBP-席夫碱配合物溶于40 mL N,N-二甲基甲酰胺（DMF）中。</li>
	<li>加入60 mL 0.2 M的水相EDTA溶液，pH调至4.5。</li>
	<li>使用磁力搅拌子和搅拌台，将混合溶液搅拌过夜。随着席夫碱配合物的水解，溶液颜色将由深红色逐渐变为白色。</li>
	<li>当反应完成（以无红色残留为标志）后，将反应液转移至250 mL分液漏斗中。</li>
	<li>加入50 mL二氯甲烷，盖紧分液漏斗并充分混合。将有机相排入废液杯中。重复此步骤三次，以除去PBP及任何残留的Ni-PBP-席夫碱配合物。收集剩余的水相层于250 mL圆底烧瓶中。</li>
</ol>
2. 水解氨基酸的Fmoc保护
<ol>
	<li>使用固体碳酸氢钠将上述步骤 1.5 中分离得到的水相调节至 pH 7。使用 pH 试纸定期检测 pH 值。</li>
	<li>向溶液中加入 168 mg 碳酸氢钠（2.00 mmol，2 当量），并使用磁力搅拌子和搅拌板进行搅拌。</li>
	<li>在 10 mL 小瓶中，将 337 mg Fmoc N-羟基琥珀酰亚胺酯（1.00 mmol，1 当量）溶于最小量的二氧六环（约 4 或 5 mL）中。将该溶液转移至水溶液中，并搅拌过夜。</li>
	<li>待反应液搅拌过夜后，用 1 M 盐酸将反应液酸化至 pH 2。使用 pH 试纸定期检测 pH 值。</li>
	<li>将反应液转移至 250 mL 分液漏斗中，加入 50 mL 乙酸乙酯。盖紧分液漏斗，充分混合后，将有机相收集至 250 mL 锥形瓶中。重复此操作两次，合并所有有机相。用约 3 g 无水硫酸镁干燥合并后的有机相。</li>
	<li>使用旋转蒸发仪浓缩合并后的有机相，得到粗制的 Fmoc 保护氨基酸。</li>
</ol>

<ol><li>Wang, J., Shi, T., Deng, G., Jiang, H., Liu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+Enantio-+and+Diastereoselective+Mannich+Reactions+of+Chiral+Ni%28II%29+Glycinates+with+amino+sulfones.+Efficient+asymmetric+synthesis+of+aromatic+%CE%B1%2C%CE%B2-diamino+acids%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Org.+Chem%22%5BJournal%5D)">Highly Enantio- and Diastereoselective Mannich Reactions of Chiral Ni(II) Glycinates with amino sulfones. Efficient asymmetric synthesis of aromatic α,β-diamino acids.</a> J. Org. Chem. 73 (21), 8563-8570 (2011).</li>
<li>Wang, J., Lin, D., Zhou, S., Ding, X., Soloshonok, V. A., Liu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Asymmetric+synthesis+of+sterically+and+electronically+demanding+linear+%CF%89%2C-trifluoromethyl+containing+amino+acids+via+alkylation+of+chiral+equivalents+of+nucleophilic+glycine+and+alanine%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Org.+Chem%22%5BJournal%5D)">Asymmetric synthesis of sterically and electronically demanding linear ω,-trifluoromethyl containing amino acids via alkylation of chiral equivalents of nucleophilic glycine and alanine.</a> J. Org. Chem. 76 (2), 684-687 (2011).</li>
<li>Wang, J., Zhou, S., Lin, D., Ding, X., Jiang, H., Liu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+diastereo-+and+enantioselective+synthesis+of+syn-%CE%B2%2C-substituted+tryptophans+via+asymmetric+Michael+addition+of+a+chiral+equivalent+of+nucleophilic+glycine+and+sulfonylindoles%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Commun%22%5BJournal%5D)">Highly diastereo- and enantioselective synthesis of syn-β,-substituted tryptophans via asymmetric Michael addition of a chiral equivalent of nucleophilic glycine and sulfonylindoles.</a> Chem. Commun. 47 (29), 8355-8357 (2011).</li>
<li>Belokon, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+catalytic+synthesis+of+%CE%B1%2C-amino+acids+under+phase-transfer+conditions+with+a+novel+catalyst%2Fsubstrate+pair%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed%22%5BJournal%5D)">Highly efficient catalytic synthesis of α,-amino acids under phase-transfer conditions with a novel catalyst/substrate pair.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 40 (10), 1948-1951 (2001).</li>
<li>Zhou, S., Wang, J., Lin, D., Zhao, F., Liu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enantioselective+synthesis+of+2-substituted-tetrahydroisoquinolin-1-yl+glycine+derivatives+via+oxidative+cross-dehydrogenative+coupling+of+tertiary+amines+and+chiral+nickel%28II%29+glycinate%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Org.+Chem%22%5BJournal%5D)">Enantioselective synthesis of 2-substituted-tetrahydroisoquinolin-1-yl glycine derivatives via oxidative cross-dehydrogenative coupling of tertiary amines and chiral nickel(II) glycinate.</a> J. Org. Chem. 78 (22), 11204-11212 (2013).</li>
<li>Belokon, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+of+%CE%B1%2C-amino+acids+via+asymmetric+phase+transfer-catalyzed+alkylation+of+achiral+nickel%28II%29+complexes+of+glycine-derived+Schiff+bases%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Synthesis of α,-amino acids via asymmetric phase transfer-catalyzed alkylation of achiral nickel(II) complexes of glycine-derived Schiff bases.</a> J. Am. Chem. Soc. 125 (42), 12860-12871 (2003).</li>
<li>Ueki, H., Ellis, T. K., Martin, C. H., Soloshonok, V. A. <a target="_blank" href="http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/ejoc.200200688/abstract">Efficient large-scale synthesis of picolinic acid-derived nickel(II) complexes of glycine.</a> Eur. J. Org. Chem. 2003 (10), 1954-1957 (2003).</li>
<li>Dener, J. M., Fantauzzi, P. P., Kshirsagar, T. A., Kelly, D. E., Wolfe, A. B. <a target="_blank" href="http://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/op010204f">Large-scale syntheses of Fmoc-protected non-proteogenic amino acids: useful building blocks for combinatorial libraries.</a> Org. Process Res. Dev. 5 (4), 445-449 (2001).</li>
<li>Cruz, L. J., Beteta, N. G., Ewenson, A., Albericio, F. <a target="_blank" href="http://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/op049917z">&#34;One-pot&#34;, preparation of N-carbamate protected amino acids via the azide.</a> Org Process Res. Dev. 8 (6), 920-924 (2004).</li>
<li>Hart, J. R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHart%2C+JR+%22Ullmann%27s+Encyclopedia+of+Industrial+Chemistry%22">Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry</a>. , Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. (2000).</li>
<li>Adamson, J. G., Blaskovich, M. A., Groenevelt, H., Lajoie, G. A. <a target="_blank" href="http://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/jo00010a050">Simple and convenient synthesis of tert-butyl ethers of Fmoc-serine, Fmoc-threonine, and Fmoc-tyrosine.</a> J. Org. Chem. 56 (10), 3447-3449 (1991).</li>
<li>Seyfried, M. S., Lauber, B. S., Luedtke, N. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple-turnover+isotopic+labeling+of+Fmoc-+and+Boc-protected+amino+acids+with+oxygen+isotopes%5BTitle%5D)+AND+%22Org.+Lett%22%5BJournal%5D)">Multiple-turnover isotopic labeling of Fmoc- and Boc-protected amino acids with oxygen isotopes.</a> Org. Lett. 12 (1), 104-106 (2010).</li>
<li>Bonke, G., Vedel, L., Witt, M., Jaroszewski, J. W., Olsen, C. A., Franzyk, H. <a target="_blank" href="https://www.thieme-connect.de/DOI/DOI?10.1055/s-2008-1067171">Dimeric building blocks for solid-phase synthesis of α,-peptide-β,-peptoid chimeras.</a> Synthesis. 2008 (15), 2381-2390 (2008).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

上述方案的优势在于能够在温和的pH条件下实现从Ni-席夫碱配合物中分离出氨基酸骨架，并通过两个关键步骤对分离得到的氨基酸进行Fmoc保护。第一步是将含有EDTA的DMF/水溶液搅拌，以促进氨基酸从配合物中释放。残留的配合物或有机副产物可通过萃取轻松去除。该方案的第二步是对第一步萃取分离后存在于水相中的氨基酸进行Fmoc保护。我们已证实该方法可在pH 4.5–7.5范围内进行调整，具有较大的灵活性，这对于某些对pH敏感的侧链保护基可能是必要的。
该技术的一个潜在局限性在于，游离氨基酸的Fmoc保护反应浓度较低。由于要实现高效的水解，需要相对于底物使用数当量的EDTA，因此反应条件要求使用大量水相EDTA溶液（对于1 mmol规模的反应为60 mL）。在Fmoc保护反应中使用如此大体积的溶剂，会导致试剂浓度相对较低（约0.015 M）。尽管在如此稀释的反应条件下，概念验证实验仍以令人满意的55%产率获得了产物，但在使用因空间位阻增大而导致亲核性低于甘氨酸的氨基酸时，可能需要提高该反应浓度。
综上所述，我们证明了EDTA在促进通常用...

含有与自然界存在的20种天然氨基酸侧链不同的侧链的非天然氨基酸（UAA）已在多种应用中展现出用途。然而，这些UAA的合成可能较为困难，具体取决于侧链的结构和氨基酸骨架的立体化学。在镍-席夫碱配合物体系中，通过对甘氨酸进行C-H键活化，已成功制备出多种氨基酸衍生物，包括α,β-二氨基氨基酸1以及带有氟代2或杂环侧链3的非天然氨基酸。
加入非天然侧链后，通常通过在盐酸中回流将功能化的非天然氨基酸（UAA）从席夫碱复合物中去除4，随后使用离子交换色谱法进行分离。尽管该方法通常效率较高，但所得到的氨基酸可能不适用于固相肽合成（SPPS）。SPPS 的特性要求侧链保护基团具有酸不稳定性，而典型的镍-席夫碱复合物分解条件酸性过强，导致无法完整保留带有此类保护基团的 UAA。据我们所知，仅有一种替代的分解方法被报道：在升高温度下使用乙二胺四乙酸（EDTA）和肼5，但该条件本身可能不适用于某些侧链保护基团，例如邻苯二甲酰亚胺。
<img alt="PBP 与 H-Gly-OH 在 Ni²⁺ 和 KOH 存在下反应生成 Ni-PBP-Gly 的化学反应；合成示意图。" src="/files/ftp_upload/55677/55677fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 1"> 
图 1：由 Ni2+、PBP 和甘氨酸（Gly）合成 Ni-PBP-Gly。 <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55677/55677fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
本文报道了一种水解Ni-Schiff碱配合物Ni-PBP-Gly的方法（图1）。该配合物由Ni2+、甘氨酸和吡啶-2-甲酸(2-苯甲酰基苯基)酰胺（PBP）衍生而来6，已被证明是合成多种非天然氨基酸（UAA）的有效平台，并可通过两步合成路线便捷获得7。该配合物的合成在文献中已有报道，产率较高6。下文所述结果表明，在弱酸性至中性pH条件下使用EDTA进行水解，适用于带有酸敏感侧链保护基的UAA。水解完成后，可直接分离所得水溶液，并立即进行标准的Fmoc保护反应，从而得到Fmoc保护的氨基酸（图2）。
<img alt="通过Ni-PBP-Gly中间体制备Fmoc-Gly-OH的化学合成路径图；有机化学。" src="/files/ftp_upload/55677/55677fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图2"> 
图2：从Ni-PBP-Gly中分离的氨基酸的水解及Fmoc保护反应。反应条件：i. EDTA（12当量），pH 4.5；ii. 乙酸乙酯洗涤并调节pH至7；iii. Fmoc-OSu（1当量），NaHCO3（2当量）。<a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55677/55677fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

<table><tbody><tr><td>Ni-PBP-Gly</td><td></td><td></td><td>根据已发表的实验方案合成</td></tr><tr><td>DMF</td><td>Fisher</td><td>D119-4</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Fisher</td><td>S311-100</td><td></td></tr><tr><td>二氯甲烷</td><td>Acros</td><td>AC610050040</td><td></td></tr><tr><td>碳酸氢钠</td><td>Fisher</td><td>S233-500</td><td></td></tr><tr><td>Fmoc-OSu</td><td>Chem-Impex</td><td>&quot;00147&quot;</td><td></td></tr><tr><td>二氧六环</td><td>Fisher</td><td>D111-500</td><td></td></tr><tr><td>盐酸</td><td>Fisher</td><td>A144-500</td><td></td></tr><tr><td>乙酸乙酯</td><td>Acros</td><td>AC610060040</td><td></td></tr><tr><td>硫酸镁</td><td>Fisher</td><td>M65-500</td><td></td></tr><tr><td>ZEOPrep 60ECO 硅胶</td><td>ZEOChem</td><td></td><td></td></tr><tr><td>己烷</td><td>Fisher</td><td>3200250.650.443</td><td></td></tr><tr><td>层析柱</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pH 试纸</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>旋转蒸发仪</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>250 mL 分液漏斗</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>250 mL 圆底烧瓶</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>搅拌子</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>搅拌板</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

使用适用于保留酸敏感保护基条件的镍-席夫碱配合物水解反应

Hydrolysis of a Ni-Schiff-Base Complex Using Conditions Suitable for Retention of Acid-labile Protecting Groups

非天然氨基酸是指侧链官能团在自然界中不常见的氨基酸，其在合成肽序列中的应用日益广泛。某些非天然氨基酸的合成通常涉及使用由镍阳离子稳定的席夫碱作为前体。非天然侧链可被引入该席夫碱配合物中的氨基酸骨架上。随后可通过席夫碱的水解（通常在强酸性溶液中回流）将所得的非天然氨基酸从该配合物中分离出来。然而，这种强酸性条件可能会脱除对非天然氨基酸在微波辅助固相肽合成中所必需的酸敏感侧链保护基团。本文介绍了一种从镍-席夫碱配合物中分离氨基酸后高效进行水解及后续Fmoc保护的方法。本文所提出的水解条件适用于保留酸敏感的侧链保护基团，并可适用于多种非天然氨基酸底物。

我们假设去除 Ni2+ 从Ni-PBP-Gly复合物中可能实现希夫碱在无需剧烈pH条件下高效水解。由于EDTA是一种廉价且研究充分的螯合剂，10 我们假设，在 Ni-PBP-Gly 溶液中加入 EDTA 将有助于 Ni 的螯合2+ 离子，从而促进该复合物的水解。
为了验证我们提出的理论，即仅使用EDTA即可有效促进该配合物的水解，我们将DMF中的Ni-PBP-Gly溶液在室温下与不断增加当量的EDTA水溶液（pH 4.5）混合，该pH值为EDTA二钠盐水溶液未经调节的天然pH。水解反应的进程可通过观察溶液颜色变化进行监测：未反应的Ni-PBP-Gly溶液呈深红色，而从该配合物中释放出的PBP为白色。我们通过监测溶液颜色由红变白的过程来追踪水解反应的进展（表1）。当EDTA用量少于8当量时，溶液颜色均出现一定程度的由红向白转变，但...

本文介绍了一种高效的方法，用于水解从镍-席夫碱配合物中分离得到的氨基酸，并随后进行Fmoc保护。本文所述的水解条件适用于需要保留对酸敏感的侧链保护基团的情况。该技术可适用于多种非天然氨基酸底物。

非天然氨基酸，即侧链官能团在自然界中不常见的氨基酸，正越来越多地出现在合成肽中……

本实验的总体目标是方便地从镍转移碱基复合物中分离非天然氨基酸，并随后对这些氨基酸进行Fmoc保护。该方法有助于回答有机化学领域中的一些关键问题，例如如何更简便地合成非天然氨基酸。该技术的主要优势在于，能够从镍转移碱基复合物中分离出带有酸敏感侧链保护基的氨基酸。初学者在使用该方法时可能会遇到困难，因为镍配合物在有机溶剂中的溶解度有限。DMF 是最合适的溶剂，因为它能够溶解该配合物，并且与水互溶。我们最初产生该方法的设想，是源于无机化学教授 Dr.Boron 在镍及金属螯合剂方面给予的启发。开始此操作时，向一个250毫升的圆底烧瓶中加入40毫升DMF。在室温下搅拌，使1毫摩尔的镍PBB移位碱基配合物溶解于DMF中。随后，加入60毫升pH为4.5的0.2摩尔的EDTA水溶液。使用磁力搅拌子和搅拌台，将溶液搅拌过夜。反应完成后，将溶液转移至 250 毫升分液漏斗中。加入 50 毫升二氯甲烷（DCM）。然后盖紧分液漏斗并混合。将有机洗涤液排入废液杯中。重复加入二氯甲烷、混合并移除有机洗涤液的操作三次。随后，将剩余的水相收集至一个 250 毫升的圆底烧瓶中。首先使用固体碳酸氢钠将分离得到的水相 pH 值调节至 7。然后加入 168 毫克碳酸氢钠。使用磁力搅拌子和磁力搅拌器搅拌溶液。加入两当量碳酸氢钠前，必须将溶液 pH 调至 7。此步骤至关重要，因为溶液需呈弱碱性，以促进 Fmoc 保护反应的进行。在10毫升小瓶中，加入337毫克Fmoc和羟基琥珀酰亚胺酯以及5毫升二氧六环，溶解。将该混合物转移至水溶液中，过夜搅拌。次日，使用1摩尔盐酸将溶液酸化至pH为2。将反应物转移至一个 250 毫升分液漏斗中。加入 50 毫升 FO-乙酸盐。需注意 pH 值不得低于 2，且该步骤应迅速完成。若未按此操作，可能导致侧链保护基团丢失。盖紧分液漏斗并充分混合，然后将有机相收集至250毫升锥形瓶中。重复加入乙酸乙酯、混匀并收集有机层的操作两次，合并有机相提取物。随后，用约三克无水硫酸镁干燥合并的有机提取物。使用旋转蒸发仪浓缩合并的有机提取物，得到粗制的Fmoc保护氨基酸。本研究在温和的 pH 条件下，从镍转移碱基复合物中分离出氨基酸骨架，随后通过两个关键步骤进行 Fmoc 保护。第一步是将含有 EDTA 的 DMF 水溶液搅拌，以促进氨基酸从复合物中释放。在释放出的氨基酸被分离和提取后，将其置于 Fmoc 保护条件下，得到 Fmoc 保护的氨基酸。通过监测溶液颜色从红色变为白色来追踪水解反应的进程。使用少于八个当量EDTA的反应会显示出一定程度的颜色变化，但反应始终不完全。而不含EDTA的反应则完全不发生颜色变化。因此，至少需要八个当量的EDTA才能使反应完全。随后评估水解反应的有效pH值。在室温下，于pH 4.5至7.5范围内过夜搅拌，可观察到成功的水解反应。这表明了EDTA水解的灵活性。随后，通过一系列带有不同侧链保护基的氨基酸来测试这些水解条件的可行性。在每种情况下，质子核磁共振（1H NMR）结果证明侧链保护基均得到完全保留。一旦掌握，若操作得当，该技术可在48小时内完成。在实施该步骤时，重要的是始终遵循文中所述的指定pH值。在完成该步骤后，还可采用其他方法，例如对带有酸不稳定性侧链保护基的其他氨基酸进行水解，以进一步探究该技术在多种底物中应用的潜力。该技术发展之后，将为从事有机合成领域的研究人员探索合成带有酸敏性侧链保护基的非天然氨基酸提供新的途径。观看本视频后，您应能够充分理解如何在温和pH条件下，从镍-PPB配合物中分离氨基酸。请注意，使用有机溶剂（特别是DMF）具有极高的危险性，因此在操作过程中必须采取适当防护措施，例如佩戴个人防护装备。

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科研

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Biochemistry

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