利用染色质免疫沉淀分析c-KIT配体启动子

本染色质免疫沉淀实验的总体目标是评估转化生长因子β1（TGFβ1）诱导的转录因子SMAD2在c-kit启动子区SMAD结合元件上的结合情况。该方法可解答细胞生物学领域中的关键问题，例如细胞因子诱导的基因转录机制。该技术的主要优势在于，能够潜在地证明转录因子及其他转录调控蛋白在活体条件下与其DNA结合位点的直接结合。

将细胞在10厘米组织培养皿中培养至70%至80%汇合度。根据实验目的对细胞进行刺激。移除组织培养基，加入5 mL固定液。

然后，在室温下将细胞置于摇床上孵育10分钟。去除固定液，用10毫升预冷的1×PBS洗涤细胞两次。去除1×PBS，加入5毫升甘氨酸终止固定液。

将细胞在室温下于摇床上孵育五分钟后，移除甘氨酸终止固定液，并用 10 毫升冰预冷的 1× PBS 洗涤细胞两次。移除 PBS 后，加入 2 毫升细胞刮取液，使用细胞刮刀收集细胞。然后将收集的细胞转移至冰上放置的锥形管中。

将样品在 4°C 条件下以 600 × g 离心 10 分钟。弃去上清液，将沉淀重悬于 1 毫升 1× 细胞裂解缓冲液中，冰上孵育 30 分钟。沉淀在细胞裂解缓冲液中重悬后，将细胞悬液转移至预冷的达恩斯匀浆器（Dounce homogenizer）中，使用 B 型研杵进行 10 次抽打，以实现细胞破碎。

然后，将细胞悬液转移至微量离心管中，在 2,400 × g、4 °C 条件下离心 10 分钟。弃去上清液，将沉淀重悬于 350 µL 细胞核消化缓冲液中。将样品在 37 °C 孵育 5 分钟后，加入微球菌核酸酶，并通过涡旋振荡混匀。

将样品在37摄氏度孵育5至20分钟，每隔两分钟通过倒置混匀样品。孵育时间可能需要根据具体浓度和细胞系的不同进行优化，以避免酶切效果不理想的情况。使用市售Sonicare设备的替代剪切步骤详见文本方案。

加入微球菌核酸酶孵育后，加入7微升冰上预冷的0.5摩尔EDTA以终止反应。将含有剪切DNA的样品在4摄氏度、16,200 × g条件下离心10分钟。将含有剪切DNA的上清液转移至新的微量离心管中。

取50微升分装至另一微量离心管中，用于按照文本方案所述确认DNA剪切是否成功。剩余体积应立即用于免疫沉淀，或于-80摄氏度保存。将10至25微克剪切后的交联染色质与25微升染色质免疫沉淀级蛋白G磁珠混合。

然后，加入10 µL免疫沉淀稀释缓冲液和1 µL蛋白酶抑制剂混合物。孵育4小时后，向一个1.5 mL微量离心管中加入1至10 µg抗体，并加入蒸馏水至终体积为100 µL。

将样品置于4°C条件下，在端对端旋转仪上孵育4至12小时。孵育结束后，将试管置于磁力架上。待磁珠聚集至管壁一侧后，小心移除并弃去上清液。

用800微升洗涤缓冲液一洗涤磁珠三次。每次洗涤时，通过反复倒置试管数次使磁珠充分混匀。然后将试管置于磁力架上，待磁珠在管壁一侧聚集后，小心移除洗涤缓冲液。

接下来，使用相同的步骤，用800微升洗涤缓冲液二清洗磁珠一次。洗涤后，将磁珠重悬于50微升洗脱缓冲液中，并在室温下于旋转摇床上以末端对末端方式孵育15分钟。然后，借助磁力架，将上清液转移至新的离心管中。

加入6 µL 5 M氯化钠以逆转交联，随后加入2 µL蛋白酶K。混匀样品后，在65 °C下孵育2小时。此时，样品可直接按照文本方案中所述分析蛋白质结合位点，或在-20 °C下保存。为验证TGFβ1诱导的SMAD2与SCF启动子的结合，进行了染色质免疫沉淀实验。

TGF β1 处理导致 SMAD2 在人肝癌细胞系 HepG2 和 Hep3B 中结合于 SCF 启动子区域。在未给予 TGF β1 刺激的情况下，未检测到 SMAD 结合。作为 TGF β1 诱导 SMAD 激活的阳性对照，对 PAI-1 进行了染色质免疫沉淀实验。

PAI-1 启动子是 TGF-β 和 SMAD 的已知靶点。通过使用非特异性 IgG 抗体验证了 SMAD2 免疫沉淀的特异性。使用 IgG 进行免疫沉淀后，未检测到 SMAD2 与 SBE 的结合。

为了验证TGF Beta 1诱导的STAT3与TGF beta配体基因的结合，使用经TGF beta 1处理的HepG2和Hep3B细胞进行了染色质免疫沉淀实验。TGF beta 1处理导致STAT3结合至TGF beta基因的第二个假定STAT3结合位点，但未结合至第一个位点。在本示例中，STAT3对STB-2的阳性结合作为内部阳性对照。

与其他染色质免疫沉淀实验类似，使用IgG进行免疫沉淀后，未观察到STAT3与ST-2的结合。只要掌握该技术，若操作得当，可在一至两天内完成，具体时间取决于所用抗体。在进行该实验时，遵循实验室安全规范并在方案的每一步骤中保持高度准确性至关重要。

进行此操作时，应采取一些预防措施，例如查阅材料安全数据表（MSDS）并穿戴防护装备，如手套、白大褂和护目镜。观看本视频后，您应能够充分理解如何分析蛋白质与特定DNA结合序列的结合。在遵循本方案的基础上，还可进一步采用其他方法，如启动子活性检测，以验证染色质免疫沉淀实验所展示的蛋白质-DNA结合的功能相关性。