利用高尔基-考克斯法评估老龄小鼠海马树突复杂性

本方法的总体目标是对脑组织进行适当的高尔基染色，以观察并量化树突的形态和复杂性。该方法有助于回答神经科学领域的一些关键问题。由于高尔基染色仅标记少量细胞亚群，因此该技术可用于追踪神经元的结构。

该技术的主要优势在于，脑切片可轻松完成染色，且在任何洗涤步骤中均不会存在干燥或脱落的风险。本实验操作将由艾伦博士实验室的研究生弗雷德·基弗（Fred Kiffer）、泰勒·亚历山大（Tyler Alexander）和朱莉·安德森（Julie Anderson）进行示范。首先，将新鲜获取的未固定的啮齿类动物半脑浸入5毫升基于氯化汞的溶液中。

由于氯化汞溶液对光敏感，需用铝箔包裹试管。将样品在室温下避光保存。次日，将溶液缓慢倾入临时容器中，然后将其正确弃置于生物危害废物容器中。

加入 5 毫升新鲜的氯化汞溶液，并确保脑组织完全浸没。将样品放回室温避光环境中继续孵育 13 天。14 天后，将 30 克粉末状后浸渍缓冲液溶于 90 毫升蒸馏水或去离子水（DH2O）中，配制后浸渍缓冲液。

向六孔板的每个孔中加入 6.5 毫升浸渍后缓冲液，每只脑组织使用一个孔。然后，按前述方法从脑组织中去除氯化汞溶液。用 DH2O 冲洗组织，再将组织转移至含有浸渍后缓冲液的六孔板中。

用铝箔覆盖培养板，置于室温避光处保存。次日，吸除浸润后缓冲液，更换新的浸润后缓冲液。重新覆盖培养板，并于4°C冰箱中保存。

每份脑组织准备两到三个12孔板，首先在板盖上从左到右、从上到下按升序编号，并标注被切片脑组织的识别编号。向每块板的每个孔中加入2毫升1×PBS，然后设置好切片阶段并启动振动切片机。

然后，将胶带贴在标本夹的组织块上，并在其上方添加少量氰基丙烯酸盐胶水。从六孔板中取出一个脑组织，放置在塑料或玻璃培养皿上。使用不锈钢双刃刀片从尾侧切下小脑，确保保留在脑组织上的小脑部分表面平整。

然后，将剩余小脑的平面朝下贴附在胶水上。待胶水干燥后，将带有组织的样本架放入样本槽中。将样本槽置于振动切片机上，并用PBS覆盖组织样本。

然后，将刀片安装到振动切片机的刀片架上，并缓慢将刀片降入样品槽中，直至完全浸没并略低于组织顶部。接着，将振动切片机的切削速度设为7，振幅设为6，切削角度设为12度。启动振动，切取200 µm的切片。

使用大号画笔将组织切片从标本浴中转移至12孔板中指定的各个孔内。继续切割组织，直至获得所需数量的组织切片。切片完成后，用移液器吸去12孔板各孔中的PBS，然后每孔加入2毫升PBS-T，在振荡条件下洗涤30分钟。

在洗涤阶段即将结束时，将三份氨水溶液与五份去离子水混合稀释。随后，移除 PBS-T，加入稀释后的氨水溶液。用铝箔包裹避光，对切片染色 19 至 21 分钟。

然后，在安全移除氢氧化铵溶液后，加入染色后缓冲液。用铝箔包裹避光，再染色19至21分钟。最后，用PBS-T缓冲液冲洗切片，每次5到10分钟，共冲洗三次。

用大号画笔将切片贴附于1%明胶包被的载玻片上。室温下干燥20至30分钟，然后放入考普林瓶中过夜。将载玻片从考普林瓶中取出，置于通风橱内的塑料架上。

将切片置于含有100%乙醇的染色缸中，5分钟。再用两次5分钟的乙醇洗涤进行脱水。随后，将玻片放入玻璃架中，并使用金属手柄将架放入含有99%二甲苯的玻璃染色缸中。

将载玻片在两份二甲苯中各浸泡清洗五分钟，共更换两次。第二次清洗时间结束后，依次取出载玻片，并迅速在组织上滴加约 0.25 毫升封片介质。接着取一片盖玻片，将其覆盖在介质上。

使用钝头物体（如画笔末端）将盖玻片下残留的气泡推至边缘。将载玻片置于避光处，静置干燥两到三天。干燥后，使用显微镜进行图像采集，并利用相应软件进行分析。

这幅明场图像显示了一个符合成像和进一步分析标准的高尔基染色神经元。三种树突棘类型均可清晰可见。整个树突长度上的染色均匀一致，且该树突与其他神经元分离。

该图显示，与生理盐水处理组相比，经5-氟尿嘧啶处理后，齿状回内高尔基染色神经元在第四级和第六级分支的长度减少。高尔基染色可用于检测树突棘密度的显著差异。在CA1区顶端锥体树突中，对活体小鼠给予5-氟尿嘧啶显著降低了树突棘密度。

在基底树突中，树突棘的总体密度未见显著变化。对CA1区顶端锥体树突进行Sholl分析显示，5-氟尿嘧啶处理显著降低了距胞体40至160微米范围内的树突分支。在基底树突中，5-氟尿嘧啶处理使距胞体30至110微米范围内的树突分支减少。

一旦掌握，若操作得当，每份脑组织的该技术（包括高尔基染色过程以及切片的贴附、清洗和封片）可在三小时内完成。该技术问世后，为神经生物学领域的研究人员利用小鼠模型探索神经解剖学连接开辟了道路。在进行该操作时，需谨记将切片置于氢氧化铵溶液中的时间应严格控制在19至21分钟之间，以避免神经元过度染色。

观看本视频后，您应能够充分掌握如何正确对脑组织进行染色、切片和漂洗。请注意，使用含氯化汞的溶液、氢氧化铵溶液和二甲苯具有极高的危险性，因此在操作过程中务必采取预防措施，佩戴实验手套并在通风橱内进行操作。