重连神经元回路：一种实现快速神经突延伸与功能性神经元连接的新方法

本实验的总体目标是启动新的神经突，快速延伸这些神经突，并精确地将其连接到靶细胞。只有利用在可控且可重复的环境中培养的细胞，才能实现这一过程。该方法使我们能够回答神经科学领域的关键问题。

什么因素限制了神经元的生长速率？它们的生长速度可以达到多快？机械信号是否在其中发挥作用？

我们还可以研究突触是如何形成的，神经元如何找到靶细胞？突触如何老化、成熟？第三，我们可以系统地构建神经网络，研究神经元如何进行计算。

该技术的主要优势在于能够实现简便的操作、实验的可重复性，以及最终在单细胞水平上实现高度的控制。开始此操作时，需清洗并准备好所需数量的无菌盖玻片。接着，将每张盖玻片用0.5至1毫升的100微克/毫升多聚赖氨酸（PDL）溶液覆盖，在室温下孵育至少2小时。

随后，用清水洗涤盖玻片两次，并去除所有液体。在无菌环境中干燥5至10分钟，或直至表面完全干燥。然后，将微流控装置图案面朝上放置于生物安全柜内的紫外灯下照射10分钟。

10分钟后，将微流控装置的图案面朝下，与干净的盖玻片接触并放置。用镊子轻轻按压装置，使其粘附在玻璃上。向单一群体装置中加入培养基时，向右上方的孔中加入50 µL完全细胞培养基。

然后向其对角线方向的孔中加入另外 50 微升完全细胞培养基。为了用培养基填充多群体装置，向其中一排孔中加入 30 微升完全 NBM。确保培养基在孔之间流动。

然后，向其余每个孔中加入 50 µL 培养基。将装置放入一个较大的培养板中，并在板内放置一个装有经高压灭菌水的开放培养皿，将整个培养皿放入培养箱中孵育 1 至 2 小时，同时准备细胞培养。现在，从微流控装置的上层孔中移除培养基，但不要将孔内的液体完全吸干。

然后，将20微升浓缩的细胞溶液加入微流控装置的右上孔中，并在显微镜下观察细胞在单一群体微流控装置内的流动情况。若要在多群体装置中接种细胞，请将20微升浓缩的细胞溶液分别加入顶部的各个孔中。在显微镜下检查细胞是否已进入各个腔室。

随后，将装置放入培养箱中孵育15至30分钟，以促进细胞贴附于基质。待细胞贴附基质后，向单一群体装置的两个上层孔中加入40微升NBM，以帮助去除微通道中的气泡。

向多细胞群装置的上部孔中加入 20 微升 MBM，即之前接种细胞的同一孔中。培养基应略微凸出，形成正弯月面，使孔呈现类似松饼顶部的外观。在微流控装置移除前 1 至 2 天，向每个样品皿中加入 2 毫升预热的 NBM，并浸没各个腔室。

然后，将装置置于培养箱中。随后，使用无菌镊子和移液器吸头将微流控装置从盖玻片上移除，留下神经元的图案化构型。在此步骤中，向细胞培养物中加入40至60 µL已制备好的PDL包被微珠。

然后，将样品放回培养箱中孵育一小时，以促进突触连接的形成。随后，将样品安装至实验装置中，使细胞能够从上方通过两根微电极进行检测，同时可进行光学观察。在此配置下，CCD相机位于显微镜的侧端口，用于图像采集。

将每支装有生理盐水的移液管连接到一个1毫升注射器上，然后用生理盐水溶液灌注样品。接着，在显微镜下检查两个分离的神经元群体之间的间隙，以确保这两个群体在自然状态下未相互连接。选择一个未与视野中神经元连接的PDL微珠。

通过显微镜先对准微珠，再对准微量移液器尖端，使微珠与移液尖端对齐。随后，在显微镜下观察，将移液尖端尽可能靠近微珠。接着，对移液器施加负压以吸附微珠，并在整个实验过程中保持负压状态。

现在，选择视野中附着于神经元的PDL微珠，通过负压将其吸附至第二根微移液管上。通过以每分钟0.5微米的速度缓慢移动显微操作器或样品载物台移动1微米，牵拉PDL微珠-神经元复合物，随后暂停5分钟，以允许神经突起始。再通过以每分钟0.5微米的速度侧向移动2微米，进一步牵拉PDL微珠-神经元复合物，然后暂停5分钟，以促进神经突伸长。

在成功启动并延伸神经突最初的5微米后，以每分钟20微米的速度持续牵拉神经突。为连接神经元，选择神经突密集的区域。利用其他微珠测量移液管尖端高于盖玻片的高度，并降低PDL微珠-神经突复合物，使其与神经突发生物理接触。

在操作第二根微移液管时，使PDL微珠-神经突复合物保持与目标神经突接触。然后，将带有第二个PDL微珠的第二根移液管下降至新形成的神经突上方，位置距离第一个微珠约20微米处，并利用第二个PDL微珠将新生的神经突纤维推向目标细胞。接下来，固定两个微珠至少一小时。

使用显微镜确认是否存在局灶性肿胀，即接触微珠的神经突出现增厚现象。在此期间，缓慢将样品的培养基从生理盐水中更换为预热的、经二氧化碳平衡的NBM。通过释放负压，使微珠从第二根移液管上脱离。

如果新生的神经突仍保持连接，则同样释放第一个微珠。随后，小心将样品放回培养箱中，以增强神经元连接，为后续实验做准备。可采用全细胞膜片钳记录技术来研究经显微操作形成的连接的电生理功能。

图中显示的是在PDMS微流控装置中被100微米间隙分隔的分离神经元群体。采用全细胞构型进行成对膜片钳记录，分析经机械诱导形成的连接，并将其与自然连接的神经元群体及未连接群体进行比较。在自然连接以及通过微操作连接的神经元中，记录到的突触前动作电位引发的电信号反应显著更强，并且在时间上与突触前活动密切相关。

一旦掌握，若操作得当，该技术可在八小时内完成。在进行此操作时，务必记住需要健康且形态良好的长期细胞培养，以确保结果快速且可重复。完成该操作后，可采用多种方法验证微操作连接的电学功能。观看本视频后，您应能够充分理解如何在微流控腔室中培养细胞群体，并利用移液管操作来启动、延伸和连接神经突。