利用荧光基因编码pH探针对黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）马氏管上皮细胞内pH进行光学定量

本成像方案的总体目标是描述利用基因编码的pH指示剂对细胞内pH进行定量，并展示该方法如何用于评估昆虫肾结构模型——马尔皮基管——中的基底侧质子转运。该方法有助于回答细胞转运领域中的关键问题，例如特定转运蛋白在上皮细胞内pH调节中的质子转运作用。该技术的主要优势在于，可在完整上皮组织多个功能不同的区域中快速、简便地评估细胞转运功能。

尽管该方法可用于研究pH调节和昆虫上皮，也可应用于其他系统，例如哺乳动物肾单位以及培养的上皮细胞。开始此操作时，将两组焊台辅助手夹具放置在成像显微镜载物台上，每侧各一个。接下来，插入相应的弯曲玻璃毛细管，连接进液管路以及连接真空的出液管路。

然后，将它们固定在辅助夹持装置中，并与显微镜的成像载物台对齐。将真空脂涂抹在封口膜上，将粘性灌流小室分隔器按压到膜上，使底部均匀涂上真空脂。取下粘性灌流小室分隔器，将涂有真空脂的一面朝下，放置在经多聚-L-赖氨酸包被的载玻片上。

随后，移除灌注孔隔板，使各个特定孔洞以疏水性油脂圈出。接着，在涂有聚-L-赖氨酸的载玻片上，于已涂抹油脂并划出圆圈的孔中加入 200 µL 室温 IPBS 或昆虫磷酸盐缓冲液（insect phosphate buffer saline）。然后，将载玻片置于体视显微镜下，将冰冷的 Schneider's 培养基倒入解剖皿中，并将一只麻醉的雌性果蝇转移至其中。

用镊子夹住果蝇的胸部，另一只镊子轻轻夹住腹部后端。以短而有意识的动作将果蝇后端拉开。一旦看到后腹瓣，夹住其远端，并通过反复短促牵拉将后腹瓣从身体上拉开，从而分离肠道和前肠与下方的气管组织。

然后，当输尿管的第二组前段从腹腔中游离出来后，用精细镊子夹住输尿管前段的前端。用玻璃棒的末端挑起游离的前段，将玻璃棒从输尿管下方滑入，使小管向两侧垂落。接着，将前段垂直向上提起，离开溶液，之后转动玻璃棒，使前段和输尿管附着在玻璃棒的下表面。

将输尿管垂直向下放置在载玻片上，然后通过进一步按压输尿管使其固定，并密封前段的远端。使用玻璃棒的细端轻轻将每根小管在载玻片表面扫过。操作时应使玻璃棒轻触载玻片表面，避免压碎小管，将玻璃棒从远端向近端滑过小管顶部，以使每根小管全长均贴附于聚-L-赖氨酸包被的载玻片表面。

该技术的成功完全取决于对前部马氏管的准确识别和小心操作。受损的马氏管将导致结果不一致。接下来，将粘性灌注小室分隔器重新放回载玻片上，以在固定好的马氏管上方形成一个充满液体的小室。

然后，将样本放置在显微镜载物台上。将流入和流出毛细管分别置于灌注腔室的入口和出口处。在此步骤中，打开显微镜、光源和成像系统，随后启动成像软件。

通过目镜观察，手动调节焦距，直至在透射光下清晰可见 antes 的管腔。然后，点击采集选项卡，在采集加载部分的衰减下拉菜单中选择 2×2。将一块 5% 的中性密度滤光片插入光路，以降低照明光强度，减少光漂白。

在通道菜单中点击 GFP 通道，然后点击“live”以通过相机观察荧光信号。随后，调节时间滑块以设置曝光时间，使强度直方图中最亮像素值约为最大值的 40%。然后点击“stop”以停止照明。

重复RFP通道中的操作步骤，确认前侧前段起始部位的扩张情况，以及不存在细胞质mCherry聚集体，后者提示组织损伤或过表达。随后，通过勾选时间序列复选框，启动延时成像程序。在时间序列部分的下拉菜单中将持续时间调整为10分钟，并将时间间隔滑块设为零，以实现最大图像采集频率下的总采集时间设置。

然后，在通道部分勾选 GFP 和 RFP 对应的复选框。通过启动相应的阀门控制器打开灌注系统的 PBS 液路，并点击“开始实验”以启动成像程序。一分钟后，打开相应的阀门并关闭 PBS 液路，切换至氯化铵冲洗液，持续 20 秒。

然后，关闭氯化铵管路并重新打开IPBS阀门，返回IPBS。为进行两点校准，将井间分隔条从下方载玻片上剥离移除，并将成像井中的灌注毛细管从夹具中取出。随后，向pH 7.4的校准IPBS缓冲液中加入200 µL。

然后，从成像孔中移除溶液，并替换为另外 200 µL 校准溶液。重复此步骤四次，以确保溶液完全更换。接下来，在成像前将样品与校准溶液孵育 30 分钟。

使用先前确定的相同参数重复成像方案，仅将图像采集时间修改为一分钟。然后加入 200 微升用于校准的 IPBS 缓冲液至 pH 为 9。移除成像孔中的溶液，并替换为另外 200 微升校准溶液。

随后，将样品在第二种校准溶液中孵育10分钟，然后进行成像，并重复成像方案。之后，在图像分析软件中查看捕获的图像序列，通过点击MeanROI并滑动帧滑块浏览图像序列，确认任一通道中均无像素信号饱和，且强度直方图中报告的数值均未达到可检测的最大值。接下来，通过绘制荧光强度和荧光比值随时间变化的曲线来分析图像序列；此处，我们观察到指示剂在pH敏感通道和pH不敏感通道中对氯化铵脉冲刺激所表现出的预期荧光响应。

这些信号的比值揭示了细胞内 pH 的瞬时变化。要执行此分析，首先点击 meanROI 并选择自由绘制工具。按住鼠标左键，描绘一条 50 微米的微管，然后单击右键以完成 ROI 的绘制。

然后，在MT附近的一个区域重复上述操作，以定义背景ROI。接下来，点击“测量”下的“平均强度”，通过点击“导出”、“数据表”、“创建”来生成强度值表格。点击配置时钟轮图标，并取消选中所有参数，仅保留时间和平均强度。

右键单击新创建的数据表标签，选择“另存为”，并将数据导出为 csv 文件。此处显示的是一张宽视野图像，展示了前部前角原理细胞中的超椭圆荧光素荧光以及前部前角星形细胞的荧光。请注意，星形细胞在初始段呈杆状，在过渡段形态可变，在主段则表现出明显的细胞突起。

该图显示了在感兴趣区域中，细胞内 pH 值对持续 20 秒、浓度为 40 毫摩尔的氯化铵脉冲刺激所作出的校准后响应变化。虚线表示在撤除氯化铵后，对酸性恢复阶段拟合的单指数衰减曲线，由此得出衰减常数的数值。

该图显示了酸排出速率随细胞内 pH 值变化的曲线，另一幅图则显示了根据前一张图的指数拟合结果得出的酸通量随细胞内 pH 值变化的曲线。若操作熟练，马氏小管提取可在 10 分钟内完成，前提是操作得当。在进行该操作时，需牢记实验成功完全取决于解剖的质量以及 pH 指示剂的准确校准。

该制备方法可与其他基因编码的生物传感器结合使用，例如荧光钙离子和卤素离子指示剂，以研究上皮细胞中的溶质转运和细胞内信号传导。观看本视频后，您应能够充分掌握如何制备健康的果蝇马尔皮基氏小管、成像基因编码的pH指示剂，并定量分析上皮细胞中的质子转运。请注意，使用硝基异泽灵（nitroizene）可能存在危害，并可能损坏样本，因此在操作过程中应采取预防措施，确保其不会污染需重复使用的任何设备。