Name: 用荧光基因编码的 ph 指示剂对果蝇氏小管上皮细胞内 ph 值的光学定量 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-11T12:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 54 s
Description: 学习利用荧光基因编码pH指示剂pHerry对黑腹果蝇马氏管上皮细胞进行实时胞内pH定量成像技术。该方法可精确评估基底侧质子转运动态，适用于研究昆虫及哺乳动物上皮细胞的离子转运机制。

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本研究由美国国立卫生研究院（NIH）资助项目 DK092408 和 DK100227 支持，资助对象为 MFR。AJR 受 T32-DK007013 项目支持。作者谨此感谢 Julian A.T. Dow 博士提供 CapaR-GAL4 和 c724-GAL4 Drosophila 果蝇品系。我们还感谢 Jacob B. Anderson 在实验果蝇杂交系维持过程中提供的协助。

作者无任何利益冲突需要披露。

pH 定量的成功i 在 果蝇 MTs 的质量完全取决于提取的 MTs 的健康状况以及封片和解剖的质量（图 A&#160;-&#160;C）。因此，必须严格按照所述方法小心处理组织。新涂有PLL的载玻片能显著促进微管（MT）的贴附，因为其黏附性明显优于曾接触过溶液的载玻片。精细的贴片操作也有助于识别微管的不同区段图 D健康的微管（MTs）通过减少mCherry的聚集，分别促进pHerry的校准和功能评估，从而实现对酸排出更为一致的定量。在某些情况下，由于实验条件本身可能损伤微管上皮或导致荧光报告基因显著过表达，因此无法避免mCherry的聚集。在此类情况下，可采用伪比率校准方法，将荧光比值归一化，使比值1.0对应于pHi 7.0，并通过点校准实现定量（图 E进行点校准时应格外小心，避免将成像和灌流系统的永久性部件暴露于尼日霉素（nigericin）中，因为该离子载体易吸附于玻璃和塑料表面。若实验操作在实验过程中...

本实验方案的目的是描述细胞内pH（pHi) 使用基因编码的pH指示剂（GEpHI）并演示如何利用该方法评估基底外侧H+ 在一种模式昆虫中的运输D. melanogaster肾脏结构，即马尔皮基管（Malpighian tubule, MT）。MT 是果蝇的排泄器官，在多个关键方面其功能类似于哺乳动物的肾单位1马氏管在果蝇的胸部和腹部呈两对排列（前部和后部）。每根马氏管由单层上皮细胞构成的管状结构组成，其上皮细胞主要为代谢活跃的主细胞，具有明显的顶端（管腔侧）和基底外侧（血腔侧）极性，此外还含有散在的星状细胞。前部马氏管由三个在形态、功能及发育上均不同的区段组成，分别为起始膨大部分、过渡段以及与输尿管相连的分泌主段。2在细胞水平上，上皮细胞通过顶膜质膜上的V-ATPase将离子转运至管腔3 和一种碱金属/H+ 交换器以及基底外侧的 Na+- K+-ATP酶4内向整流性K+ 通道5，Na+驱动的 Cl−/HCO3− 交换体（NDAE1）6和 Na+- K+-2Cl− 共转运蛋白（NKCC；Ncc69）7，而星状细胞介导 Cl- 和水分运输8,9该复杂但易于研究的生理系统，结合多种遗传学和行为学研究工具，为内源性离子转运机制的探究提供了极佳的机会。 黑腹果蝇.
本实验方案的设计 rationale 在于建立一个遗传上易于操控的系统，用于研究上皮细胞离子转运，并具备从细胞水平到行为水平进行整合的潜力，且可将相关工具推广至其他模式系统。通过在马尔pHerry10（一种由绿色pH敏感的超级荧光蛋白 super-ecliptic pHluorin11,12（SEpH）与红色pH不敏感的mCherry13融合而成的GEpHI）的表达，结合高K+/尼日里菌素（nigericin）校准技术14，可在单个马尔皮尼管细胞中定量测定H+转运。由于多种离子转运体均参与H+当量的转运，细胞内pHi的定量可作为多种转运体介导离子运动的功能性指标。Drosophila马尔皮尼管这一模型系统还提供了强大的遗传工具，可用于组织特异性转基因15和RNA干扰（RNAi）16表达，并可与细胞成像及整体器官功能检测方法17,18,19相结合，从而构建出一个从分子到行为实现纵向整合的强有力工具集。这与许多传统的上皮生物学研究方法形成鲜明对比，因为历史上此类测量往往依赖复杂且困难的显微解剖技术、精密的离子选择性电极20,21，以及价格昂贵、加载条件苛刻、在异质组织中细胞特异性差的pH敏感性染料22。GEpHIs已被广泛用于多种细胞类型中pHi的测定23。早期研究利用绿色荧光蛋白（GFP）固有的pH敏感性来监测培养的上皮细胞中的pHi24，但在过去二十年中，GEpHIs已应用于神经元25、胶质细胞26、真菌27和植物细胞28。结合GAL4/UAS表达系统15实现遗传构建体的细胞靶向表达，以及Drosophila马尔皮尼管在生理上的可及性，使该体系成为研究pHi调控和上皮离子转运的理想模型。
细胞内pH（pHi）的调节已研究数十年，对生命活动至关重要。Drosophila 马尔pighian小管（MT）制备物为教学提供了稳定的模型，可用于讲授pHi调节的生理学机制，同时也适用于在离体（ex vivo）和在体（in vivo）条件下开展复杂的pHi调节研究。本实验方案描述了利用NH4Cl脉冲酸负荷技术定量测定果蝇MT上皮细胞基底侧膜H+转运的方法21。由于所用pH指示剂为基因编码，因此该方法及其理论框架可推广应用于任何适合转基因操作并能进行活体成像的研究体系。

<table><tbody><tr><td>聚-L-赖氨酸（PLL）溶液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4832</td><td>4 &amp;deg;C 保存，可重复使用。</td></tr><tr><td>尼日利亚菌素钠盐</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N7143</td><td>注意：需戴手套操作。用DMSO配制成20 mM储备液，分装后于4 &amp;deg;C保存。</td></tr><tr><td>带粘性边缘的灌流室盖玻片，粘性区域直径1 mm，腔室直径&amp;times;厚度为9 mm &amp;times; 0.9 mm，接口直径1.5 mm</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>GBL622105</td><td>可根据灌流系统需要替换。</td></tr><tr><td>Sylgard 184 硅胶弹性体试剂盒</td><td>Ellsworth Adhesives</td><td>184 SIL ELAST KIT 0.5KG</td><td>多家供应商有售。</td></tr><tr><td>焊接辅助支架（Helping Hands Soldering Stands）</td><td>Harbor Freight Tools</td><td>60501</td><td>多家供应商有售。</td></tr><tr><td>开放式重力驱动灌流系统，带阀门控制器，8进1出分流管及储液槽</td><td>Bioscience Tools</td><td>PS-8S</td><td>可使用任何功能相当的灌流系统。</td></tr><tr><td>流速调节器</td><td>Warner Instruments</td><td>64-0221</td><td>可根据灌流系统需要替换。</td></tr><tr><td>Schneider培养基</td><td>Fisher Scientific</td><td>21720024</td><td>以无菌分装形式于4 &amp;deg;C保存。</td></tr><tr><td>#5 不锈钢镊子</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-20</td><td>可根据实验人员习惯替换。</td></tr><tr><td>35 × 10 mm 聚苯乙烯培养皿</td><td>Corning Life Sciences</td><td>Fisher Scientific 08-757-100A</td><td>品牌和尺寸无严格要求。</td></tr><tr><td>75 × 25 mm 显微镜载玻片</td><td>Corning Life Sciences</td><td>2949-75X25</td><td>只要与灌流槽兼容，品牌和尺寸可变动。</td></tr><tr><td>含细丝的硼硅酸盐毛细玻璃管，内径1.5 mm，外径0.86 mm，壁厚0.32 mm</td><td>Warner Instruments</td><td>64-0796</td><td>细丝非必需，玻璃管可根据灌流管路和灌流槽进行替换。</td></tr><tr><td>Tygon 管路，内径1/16&quot;，外径1/8&quot;，壁厚1/32&quot;</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-171-129</td><td>多家供应商有售，可根据灌流系统替换。</td></tr><tr><td>真空硅脂</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z273554</td><td>多家供应商有售。</td></tr><tr><td>塑料流量控制夹</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-869</td><td>多家供应商有售，无需无菌。</td></tr><tr><td>玻璃棒，直径5 mm</td><td>delphiglass.com</td><td>9198</td><td>尺寸依个人偏好而定，多家供应商可选。</td></tr><tr><td>PAP 疏水笔</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z377821</td><td>多家供应商有售。</td></tr><tr><td>密封膜</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7668</td><td>多家供应商有售。</td></tr><tr><td>15 mL Falcon 管</td><td>BD Falcon</td><td>352096</td><td>多家供应商有售。</td></tr><tr><td>50 mL Falcon 管</td><td>BD Falcon</td><td>352070</td><td>多家供应商有售。</td></tr><tr><td>HEPES；4-(2-羟乙基)哌嗪-1-乙磺酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td>多家供应商有售。</td></tr><tr><td>MES；4-吗啉乙磺酸一水合物</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>69892</td><td>多家供应商有售。</td></tr><tr><td>TAPS；N-[三(羟甲基)甲基]-3-氨基丙磺酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T5130</td><td>多家供应商有售。</td></tr><tr><td>10倍/0.45 数值孔径空气物镜</td><td>Zeiss</td><td>000000-1063-139</td><td>可使用功能相当的物镜。单细胞成像可使用40倍物镜。</td></tr><tr><td>解剖体视显微镜</td><td>Zeiss</td><td>Discovery.V8</td><td>可使用任何类型的解剖体视显微镜。</td></tr><tr><td>UAS-pHerry 转基因 &lt;em&gt;Drosophila melagnogaster&lt;/em&gt;</td><td>可从Romero实验室获取</td><td></td><td>首次发表：引文10</td></tr><tr><td>capaR-GAL4 驱动品系 &lt;em&gt;Drosophila melagnogaster&lt;/em&gt;</td><td>可从Romero实验室获取</td><td></td><td>首次发表：引文32</td></tr><tr><td>c724-GAL4 驱动品系 &lt;em&gt;Drosophila melagnogaster&lt;/em&gt;</td><td>可从Romero实验室获取</td><td></td><td>首次发表：引文2</td></tr><tr><td>单色高灵敏度数码相机</td><td>Zeiss</td><td>Axiocam 506 mono</td><td>品牌和型号可变动，可用任何适用于活细胞成像的单色高灵敏度相机替代。</td></tr><tr><td>GFP/FITC滤光片组，激发470/40 nm，发射515 nm长通，二向色镜500 nm</td><td>Chroma</td><td>CZ909</td><td>可使用任何GFP/FITC滤光片组替代。</td></tr><tr><td>RFP/TRITC滤光片组，激发546/10 nm，发射590 nm长通，二向色镜565 nm</td><td>Chroma</td><td>CZ915</td><td>可使用任何GFP/FITC滤光片组替代。</td></tr><tr><td>倒置落射荧光显微镜</td><td>Zeiss</td><td>Axio Observer Z.1</td><td>可使用任何具备电动滤光片切换功能的类似显微镜。直立显微镜可配合开放式灌流槽和水浸物镜使用。</td></tr><tr><td>统计分析软件</td><td>Microcal</td><td>Origin 6.0</td><td>可使用功能相当的软件替代。</td></tr><tr><td>图像分析软件</td><td>美国国立卫生研究院</td><td>ImageJ 1.50i</td><td>可使用功能相当的软件替代。</td></tr><tr><td>图像采集软件</td><td>Zeiss</td><td>Zen 1.1.2.0</td><td>可使用功能相当的软件替代。</td></tr><tr><td>单刃碳钢剃刀片</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>71960</td><td>多家供应商有售。</td></tr><tr><td>显微镜载玻片收纳盒</td><td>Fisher Scientific</td><td>16-04</td><td>多家供应商有售。</td></tr><tr><td>本生灯</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-110-1231</td><td>多家供应商有售。</td></tr><tr><td>带棉塞的聚苯乙烯果蝇培养管</td><td>Genesee Scientific</td><td>32-109BF</td><td>可使用类似产品替代。</td></tr><tr><td>2.5 L 实验室冰桶</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-210-129</td><td>多家供应商有售。</td></tr><tr><td>NMDG；N-甲基-D-葡糖胺</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2004</td><td>多家供应商有售。</td></tr><tr><td>200 uL 防污染移液器吸头</td><td>MidSci</td><td>AV200</td><td>多家供应商有售。</td></tr><tr><td>200 &amp;#956;L 可调体积移液器</td><td>Gilson Incorporated</td><td>PIPETMAN P200</td><td>多家供应商有售。</td></tr></tbody></table>

利用荧光基因编码ph探针对黑腹果蝇（drosophila melanogaster）马氏管上皮细胞内ph进行光学定量

Optical Quantification of Intracellular pH in Drosophila melanogaster Malpighian Tubule Epithelia with a Fluorescent Genetically-encoded pH Indicator

上皮离子转运对于全身离子稳态以及维持细胞必需的电化学梯度至关重要。细胞内pH（pHi受多种离子转运蛋白的影响，因此监测pHi 是评估转运蛋白活性的有用工具。现代基因编码的pH指示剂（GEpHIs）可对pH进行光学定量i 在完整细胞的细胞级和亚细胞级水平上。本方案描述了细胞内pH的实时定量i 马尔皮基管（MTs）中的调控 黑腹果蝇 通过 离体 pHerry 的活体成像，一种具有 p 值的伪比率型 GEpHIKa 非常适合用于追踪细胞质中的pH变化。成年果蝇马尔皮基氏小管（MTs）由形态和功能上截然不同的单层上皮细胞区域组成，可作为研究上皮运输的便捷且遗传上易于操作的模型。与传统的pH敏感性荧光染料和离子选择性电极相比，GEpHIs具有多项优势。只要具备适当的启动子元件，GEpHIs即可特异性地标记不同的细胞群体。这种标记方式在 离体, 体内，以及 原位 制备物本身具有异质性。GEpHIs 还可用于量化 pHi 在完整组织中长时间成像，无需反复染色或使组织外露。当前基因编码型质子指示剂（GEPHIs）的主要缺点是，在组织损伤或探针过表达情况下，易在细胞质包涵体中聚集。本实验方案通过评估基底侧质子（H⁺）流动，展示了GEPHIs的这些局限性、相应的解决方案及其固有优势。+在提取的果蝇马氏管的功能不同的主细胞和星状细胞中进行转运研究。所述技术和分析方法可轻松适用于多种脊椎动物和无脊椎动物样本，该检测方法的复杂程度可根据需求调整，既可用于教学实验，也可用于通过特定转运体进行离子流的精细测定。

健康组织以及正确识别前段输尿管小管（MTs）对于本实验方案的成功至关重要。在解剖过程中，应注意避免直接接触MTs，仅可通过输尿管进行操作，因为直接夹持MTs会导致其断裂（图4A–B）。当将MTs展平于载玻片上时，应尽量减少对小管的触碰，避免过度移动，以免损伤单层上皮细胞层（图4C）。正确解剖的前段MTs应表现为上皮细胞胞质中红色与绿色荧光均匀分布，并具有形态学上可区分的小管节段。因灌注不当或操作失误而受损的小管会表现出红色荧光聚集，且无对应的绿色荧光聚集；而误判为后段的MTs则会从近端盲端至远端输尿管呈现一致的形态（图4D）。
必须通过生理学评估和形态学来确认 pHerry 的正常功能。验证 pH 传感功能是否正常的最便捷方法是施加 NH<s...

细胞离子转运通常可通过监测细胞内pH值(pHi)来评估。基因编码的pH指示剂(GEpHIs)&#160;可对完整细胞中的细胞内pH值进行光学定量。本实验方案详细描述了利用一种伪比率型基因编码pH指示剂pHerry，对黑腹果蝇Drosophila melanogaster马尔皮基氏小管进行细胞ex vivo活体成像，从而实现细胞内pH值的定量分析。

利用荧光基因编码pH探针对黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）马氏管上皮细胞内pH进行光学定量

上皮细胞离子转运对于全身离子稳态以及维持重要的细胞电化学梯度至关重要。细胞内pH……

本成像方案的总体目标是描述利用基因编码的pH指示剂对细胞内pH进行定量，并展示该方法如何用于评估昆虫肾结构模型——马尔皮基管——中的基底侧质子转运。该方法有助于回答细胞转运领域中的关键科学问题，例如特定转运蛋白如何参与上皮细胞内pH调节过程中的质子跨膜运动。该技术的主要优势在于，可在完整上皮组织多个功能不同的区域中，快速、简便地评估细胞转运功能。尽管该方法可用于研究 pH 调节和昆虫上皮，也可应用于其他系统，例如哺乳动物肾单位和培养的上皮细胞。开始此操作时，将两组焊台辅助手夹具置于成像显微镜载物台上，两侧各放一个。接着，分别插入弯头玻璃毛细管、进液管以及连接真空的出液管。然后，将它们固定在辅助固定装置中，并与显微镜的成像载物台对齐。将真空脂涂抹在封口膜上，将粘性灌流小室分隔器压紧在膜上，使底部均匀涂覆真空脂。揭下粘性灌流小室分隔器，将其涂有真空脂的一面朝下，放置在聚-L-赖氨酸包被的载玻片上。随后，移除灌注孔隔板，使各个特定孔洞以疏水性油脂圈出。接着，在涂有聚-L-赖氨酸的载玻片上，于油脂圈出的孔内加入200微升室温IPBS或昆虫磷酸盐缓冲液。然后将载玻片置于体视显微镜下，将冰冷的Schneider's培养基倒入解剖皿中，并将一只麻醉的雌性果蝇转移至其中。用一把镊子夹住果蝇的胸部，另一把镊子轻轻夹住腹部后端。以短而 deliberate 的动作拉开果蝇后部。当看到后端肛上板（hind guard）后，夹住其远端，通过反复短促牵拉，将肛上板从身体上分离，同时释放与之相连的肠道和气管组织。然后，用精细镊子夹住输尿管的前段游离端，待第二组游离端完全从腹腔中分离后，用玻璃棒的末端挑起前段游离端，将玻璃棒从输尿管下方滑入，使小管向两侧自然垂落。随后，将游离端垂直向上提起，脱离溶液，接着转动玻璃棒，使游离端和输尿管贴附在玻璃棒的下表面。将输尿管垂直向下放置在载玻片上，然后通过进一步按压使其固定，并密封 ante 的远端。用玻璃棒的细端轻轻在载玻片表面扫过每根小管。轻触玻璃棒与载玻片表面，避免压碎小管，将玻璃棒从管状结构的顶部由远端向近端滑动，使每根小管全长牢固附着于聚-L-赖氨酸包被的载玻片表面。该技术的成功完全取决于对前部马氏管的准确识别和小心操作。受损的马氏管将导致结果不一致。接下来，将粘附性灌注小室分隔器重新放回载玻片上，以在固定好的马氏管上方形成一个充满液体的小室。随后，将样本放置在显微镜载物台上。将流入和流出毛细管分别置于灌注腔室的入口和出口处。在此步骤中，打开显微镜、光源和成像系统，然后启动成像软件。通过目镜观察，手动调节焦距，直至在透射光下清晰可见 antes 的管腔。然后，点击采集选项卡，在采集加载部分的衰减下拉菜单中选择 2×2。将一块 5% 中性密度滤光片插入光路，以降低照明光强度，减少光漂白。在通道菜单中点击 GFP 通道，然后点击“实时”以通过相机观察荧光信号。随后，调节时间滑块以设置曝光时间，使强度直方图中最亮像素值约为最大值的 40%。然后点击“停止”，以结束照明。重复RFP通道中的操作步骤，确认前动脉起始段扩张的存在，以及不存在细胞质mCherry聚集体，后者提示组织损伤或过表达。随后，通过勾选时间序列复选框，启动延时成像程序。在时间序列部分的下拉菜单中将持续时间调整为10分钟，并将时间间隔滑块调至零，以在最大图像采集速率下设置总采集时间。然后，在通道部分勾选 GFP 和 RFP 两个选项。通过启动相应的阀门控制器打开灌注系统的 IPBS 管路，并点击“开始实验”以启动成像程序。一分钟后，打开相应的阀门并关闭 IPBS 管路，切换至氯化铵后处理溶液，持续 20 秒。然后，关闭氯化铵管路并重新打开IPBS阀门，返回IPBS。为进行两点校准，将井间分隔条从下方载玻片上剥离移除，并将成像井中的灌注毛细管从夹具中取出。随后，向pH 7.4的校准IPBS缓冲液中加入200微升。然后，从成像孔中移除溶液，并替换为另外 200 µL 的校准溶液。重复此过程四次，以确保溶液完全更换。接着，在成像前将样品与校准溶液孵育 30 分钟。使用先前确定的相同参数重复成像方案，仅将图像采集时间修改为一分钟。然后加入 200 微升用于校准的 IPBS 缓冲液至 pH 9。移除成像孔中的溶液，并替换为另外 200 微升的校准溶液。随后，将样品在第二种校准溶液中孵育10分钟，然后进行成像，并重复成像程序。之后，在图像分析软件中查看采集的图像序列，通过点击MeanROI并滑动帧滑块浏览图像序列，确认任一通道中均无像素信号饱和，且强度直方图中报告的数值未达到可检测的最大值。接下来，通过绘制荧光强度和荧光比值随时间变化的曲线来分析图像序列；在此，我们观察到指示剂在pH敏感通道和pH不敏感通道中对氯化铵脉冲刺激所表现出的预期荧光响应。这些信号的比值揭示了细胞内 pH 值的瞬时变化。要执行此分析，首先点击 meanROI，然后选择自由绘制工具。按住鼠标左键，描绘一条 50 微米的微管，再点击鼠标右键以完成 ROI 的绘制。然后，在MT附近的相邻区域重复该操作，以定义背景ROI。接下来，点击“测量”下的“平均荧光强度”，通过点击“导出”、“数据表”、“创建”来生成强度值表格。点击配置齿轮图标，取消选择所有参数，仅保留时间和平均荧光强度。右键单击新创建的数据表标签，选择“另存为”，并将数据导出为 csv 文件。此处显示的是一张宽视野图像，展示了前部前段主细胞和前部前段星形细胞中的超椭圆荧光素荧光。请注意，星形细胞在初始段呈杆状，在过渡段形态多变，在主段则表现出明显的细胞突起。该图显示了在感兴趣区域中，细胞内 pH 值对持续 20 秒、浓度为 40 毫摩尔的氯化铵脉冲刺激所作出的校准后响应变化。虚线表示对氯化铵撤除后酸性恢复阶段拟合的单指数衰减曲线，据此可得出衰减常数的数值。该图显示了酸排出速率随细胞内 pH 值变化的曲线，此图则显示了根据前一张图的指数拟合结果得出的酸通量随细胞内 pH 值变化的曲线。若操作得当，掌握该技术后可在 10 分钟内完成马氏小管的提取。在进行该操作时，需牢记实验成功完全取决于解剖质量和 pH 指示剂的准确校准。该制备方法可与其他基因编码的生物传感器结合使用，例如荧光钙离子和卤素离子指示剂，以研究上皮细胞中的溶质转运和细胞内信号传导。观看本视频后，您应能够充分掌握如何制备健康的果蝇马尔皮基氏小管、对基因编码的pH指示剂进行成像，并定量分析上皮细胞中的质子转运。请注意，使用硝基异丙嗪（nitroizene）可能存在危害，并可能损坏样本；因此，在操作过程中应采取预防措施，确保该试剂不会污染任何需要重复使用的设备。

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