Whole-cell Patch-clamp Recordings of Isolated Primary Epithelial Cells from the Epididymis

该程序的总体目标是从大鼠附睾中分离上皮细胞，并使用全细胞膜片钳方法测量这些主要解离细胞的电特性。这种方法可以帮助回答生殖生物学领域的关键问题，例如附睾的功能，这对精子成熟和父系性状的遗传很重要。该技术允许用户烧灼分离的附睾上皮细胞的电特性，以便可以说明这些细胞的未知生理功能。

演示该程序的是我实验室的研究生 Bao Li Zhang。要开始该程序，请通过将解剖工具浸入 70% 乙醇中来消毒。然后，让它们风干。

接下来，准备完整的 IMDM。然后，在无菌条件下制备 50 ml 等分试样，用 Parafilm 密封，并在 4 摄氏度下储存。然后，通过将 I 型胶原酶和 II 型胶原酶溶解在 RPMI 中来制备胶原酶消化液，从而在溶液中产生每毫升 1 毫克的每种胶原酶。

通过 0.22 微米膜过滤溶液。然后，将其标记为胶原酶溶液，并将溶液保存在室温下直至使用。接下来，根据酶的重量调整酶溶液的体积。

来自一只大鼠的两个附睾尾部所需的最小体积为 2 毫升。为了解剖大鼠附睾尾部，通过IP注射使用戊巴比妥钠或使用异氟醚室来处死动物，直到动物对尾部捏刺激没有反应，然后是颈椎脱位。之后，用 70% 乙醇擦拭下腹部消毒。

轻轻地将两个睾丸向下推至下腹部，然后打开靠近阴囊的下腹部。随后，去除附睾脂肪并解剖出所有生殖器官。然后，用 RPMI 将它们转移到培养皿中。

在清洁、气流受控的工作站中，从结缔组织和脂肪组织以及附阴囊中解剖出附睾尾部。将一个附睾和 0.2 毫升胶原酶溶液放入 1.5 毫升试管中。为了从附睾尾部解离单个细胞，用细剪刀在胶原酶溶液中剪下附睾，直到组织变成糊状液体。

然后，用试管中剩余的酶溶液轻轻冲洗剪刀。之后，将试管放在金属热混合器上，在 37 摄氏度下以 1， 000 rpm 的摇动速度放置 30 分钟。然后，在室温下离心酶组织混合物 3 分钟。

之后，倒出主要含有精子的粘性上清液。接下来，将沉淀重悬于 1 毫升全 IMDM 中，以淬灭所有酶活性。随后，将细胞悬液转移至含有 49 mLL RPMI 的 50 mL试管中。

离心细胞混合物并倒出上清液。将沉淀重悬于 1 毫升全 IMDM 中，轻轻研磨至少 5 分钟，以将单个细胞从酶处理的附睾组织混合物中解离。在无菌条件下将上皮细胞与其他细胞分离，并将细胞悬液在含有完全 IMDM 的 10 厘米培养皿上培养至少 8 小时或在 32 摄氏度的培养箱中过夜。

第二天早上，将 100% 酒精浸入中，准备无菌盖玻片。风干，然后浸入少量培养基中。然后，将盖玻片放入 6 厘米培养皿或 24 孔板的单孔中。

现在，通过轻轻地从主要由上皮细胞组成的培养皿中收集细胞悬液来收获解离的上皮细胞。将细胞悬液在室温下以 30 倍 G 离心 5 分钟，然后倒出上清液。之后，将细胞沉淀重悬于 2 毫升全 IMDM 中。

将 0.2 毫升收获的细胞悬液接种到每个无菌盖玻片的中心。让细胞悬液在液滴中沉淀至少 10 分钟，以使细胞松散地粘附在玻璃盖玻片上。然后，在 6 厘米培养皿的边缘小心地加入 1 毫升全 IMDM，或向 24 孔板的每个孔中加入 0.3 毫升全 IMDM，而不会干扰细胞。

将分离的单细胞保存在 32 摄氏度的培养箱中的盖玻片上，直到膜片钳实验。在膜片钳实验当天，在冰上解冻一份细胞内溶液，并在膜片钳实验期间保持冷却以防止降解。接下来，将玻璃盖玻片上的培养上皮细胞转移到室温下填充有标准 PSS 的记录室中。

在进行任何膜片钳实验之前，使用移液器小心地更换沐浴 PSS 至少两次。为了建立全细胞配置，以显微纵器的最高速度将移液器浸入浴液中。在连接到数码相机的屏幕上找到移液器吸头。

然后，将显微作器的速度减慢到中高模式。使用数据采集接口命令通过应用计算机控制放大器生成的电压步长来快速检查微量移液器电阻。如果阻力明显超出此范围，请更换新的微量移液器。

并使用软件 commander 界面中的 pipette offset 命令将移液器和浴溶液之间的液接电位设置为零。通过膜试验监测电阻。如果电阻大于 500 兆欧姆，但小于 1 千兆欧姆，则施加负电位以帮助形成千兆密封。

同时，补偿微量移液器的瞬态电容电流。此时，从零毫伏的保持电位开始施加 10 毫伏的超极化步骤来确定密封电阻。在成功实现全电池配置后，立即从负 60 毫伏的保持电位应用 10 毫伏的超极化步骤。

将电压模式切换到零电流模式并执行 10 秒的无间隙记录，以测量电池的静息膜电位。然后，快速切换回并保持在电压模式中。根据计划的实验应用电压协议并测量电流响应。

以下是在膜片钳实验之前在培养皿上重新收获过夜培养物之前和之后从大鼠附睾尾部分离的上皮细胞的实例。该图显示了使用脉冲诱导方案从单个附睾上皮细胞记录的典型全细胞电流。虚线表示零电流电平。

以下是在指定时间点测得的电流响应的电流电压关系。这些是用移液管溶液（含 ATP 或不含 ATP）透析的主要细胞的静息膜电位的代表性示踪。该条形图显示正 ATP 和负 ATP 的初始静息膜电位之间没有显着差异。

条形内括号中的数字表示来自至少三只动物的测试细胞数。以下是所有电池的密封电阻和输入电阻的相关性分析，或者仅主电池与全电池建立后不久在零电流钳下测得的静息电位，以及在超极化步骤中测得的电流幅度到保持电位的负 100 毫伏。一旦掌握，如果执行得当，这项技术可以在 9 小时内完成。

在尝试此程序时，请务必记住在细胞分离步骤中立即停止酶消化。否则，可能会发生过度消化，这可能导致难以形成千兆级密封和膜片钳实验失败。为了保持培养物的健康，重要的是以 30 G 的低速离心酶解离的细胞混合物 2 到 3 分钟，然后倒出主要包含精子细胞的粘性上清液。

遵循这些程序后，可以执行其他方法，例如活细胞成像和单细胞培养技术，以回答其他问题，例如幼稚上皮细胞中的静息膜电位可能在受控条件下调节细胞外行为。这项技术为生殖生物学领域的研究人员探索附睾上皮细胞的电生理特性以调节精子成熟和父系获得性状遗传铺平了道路。观看本视频后，您应该对如何从大鼠附睾中分离上皮细胞以及如何使用全细胞膜片钳方法测量这些细胞的电特性有很好的了解。