Name: 新生儿鼠耳蜗外科手术技术体外听力研究筛选工具 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-08T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 30 s
Description: 学习新生小鼠耳蜗外植体的制备、培养、处理及免疫染色技术，用于听力研究的体外筛选工具。该方法可同时研究耳蜗毛细胞、突触和神经元，加速候选治疗化合物的筛选进程。

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本工作获得了耳聋与其他沟通障碍国家研究所基金R01DC015824（K.M.S.）和T32DC00038（资助S.D.）、美国国防部基金W81XWH-15-1-0472（K.M.S.）、Bertarelli基金会（K.M.S.）、Nancy Sayles Day基金会（K.M.S.）以及Lauer耳鸣研究中心（K.M.S.）的支持。我们感谢Jessica E. Sagers，文学士对稿件提出的深刻意见。

本研究方案经马萨诸塞州眼耳医院机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准。实验按照世界医学协会《赫尔辛基宣言》的伦理准则进行。
1. 解剖前准备
<ol>
	<li>准备手术台
	<ol>
		<li>使用70%乙醇对手术台进行消毒。</li>
		<li>在显微镜旁放置两块非无菌的准备垫。</li>
		<li>准备器械托盘，包括热灭菌的手术剪、刀柄、微型刀片以及镊子（#4 镊子各两把） &amp;#38; #55)。将器械托盘和一个50 mm透明壁玻璃底培养皿放置在一块非无菌垫上。</li>
		<li>获取无菌的#15手术刀片；一个可密封的塑料袋或容器（用于按照机构指南处理尸体）；装有冰块的桶；以及冰冷的无菌Hank's平衡盐溶液（HBSS）。将这些物品放置于另一块非无菌垫上。</li>
		<li>将HBSS转移至一个50 mL塑料实验管中，并置于冰上。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>准备培养物
	<ol>
		<li>在超净工作台中准备所有材料。每处理四个样本，将四个经高压灭菌的10 mm圆形玻璃盖玻片放入35 mm四孔培养皿的四个凹槽中。</li>
		<li>每处理 4 个样本，在微量离心管中混合总体积为 300 µL 的下列成分：10 µL 组织粘合剂，285 µL NaHCO₃3，以及 5 µL NaOH。</li>
		<li>将45 µL上述溶液滴加至每张盖玻片上，室温下静置至少20分钟；该溶液可在盖玻片上放置数小时，但不可过夜。</li>
		<li>将一个或两个35 mm 4孔培养皿放入10 cm培养皿中，以形成两层防污染屏障。</li>
		<li>配制含有98% DMEM（Dulbecco改良Eagle培养基）、1% N-2和1%氨苄青霉素的培养基（每孔65 µL，置于（微）离心管中）。使用前将溶液预热至25 °C。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 小鼠耳蜗外植体解剖
<ol>
	<li>新生小鼠断头术
	<ol>
		<li>取一个60 mm的塑料培养皿，将70%乙醇喷洒在其皿盖内表面，使其充分润湿。</li>
		<li>将冰冷的HBSS从塑料实验管中倒入60 mm塑料培养皿的底部以及50 mm透明壁玻璃底培养皿的底部。当组织未进行解剖时，将塑料实验管和两个培养皿均置于冰上，以保持组织低温。</li>
		<li>放置一个 P3 -&#160;将出生5天的小鼠置于乳胶手套剪下的指套中并放在冰上，等待低温诱导其失去意识（约1-3分钟）。</li>
		<li>用手术剪迅速将小鼠断头，并将尸体放入可密封的塑料袋中处理。将分离的新生小鼠头部置于60 mm塑料培养皿盖内的70%乙醇中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>颞骨的大体解剖
	<ol>
		<li>使用手术刀片从颅骨前端至后端（正对矢状缝上方）做一表层切口，以去除颅骨表面的皮肤。</li>
		<li>用手术刀片切断双侧外耳道，将皮肤向前折叠，以暴露整个颅骨。 
		&#8203;注意：尽管此步骤通常不需要解剖显微镜，但可使用以获得更好的观察效果。</li>
		<li>使用#15手术刀刀片沿矢状缝切开颅骨。确保从前向后轻轻上下移动刀片以切割颅骨，避免压迫耳蜗。 
		&#8203;注意：此年龄段的颅骨应尚未骨化，应易于切割。</li>
		<li>使用#15手术刀片在眼眶后方垂直切割，移除并丢弃吻部。 
		&#8203;注意：颅骨后部应仍保留脑组织和耳蜗。</li>
		<li>使用#4镊子通过钝性解剖去除前脑、小脑和脑干。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>耳蜗的显微提取
	<ol>
		<li>调节显微镜（6.5X）&#160;放大倍数）并调整光源：将镊子置于显微镜下，优化照明和焦距。</li>
		<li>将颅骨的两个半部分放入盛有冷HBSS的60 mm塑料培养皿中。</li>
		<li>完全暴露耳蜗，其位置可识别为邻近镫骨动脉（位于颞骨内的弯曲动脉），使用#4镊子将该器官与颞骨进行钝性分离。</li>
		<li>将耳蜗转移至50 mm透明壁玻璃底培养皿中，并将培养皿置于显微镜下。</li>
		<li>将装有颅骨另一半的60 mm塑料培养皿置于冰上。</li>
		<li>从前庭系统中取出耳蜗，并使用#4镊子仔细解剖耳蜗的骨迷路（此年龄段通常为软骨状）。后续所有步骤均使用#55镊子。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>组织处理的最后步骤
	<ol>
		<li>使用微型刀片或两把镊子，小心地将与耳蜗柯蒂氏器粘连的螺旋韧带从耳蜗其余部分及蜗轴中分离出来，继续进行内耳组织的处理。
		<ol>
			<li>在螺旋韧带与毛细胞区域之间的缝隙处，切入颜色较深的半透明区域，然后从最基部抓住螺旋韧带，一边向顶部移动，一边轻轻将其旋开，进而将其完整移除。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>将标本放置以获得耳蜗的纵断矢状面视图，使用微型刀将耳蜗切成两至三段，将其分为顶回、（中回、）&#160;以及基底回。去除毛细胞和神经突实际层上下方的组织，以获得能够水平放置于培养皿中的耳蜗外植体组织块。 
		&#8203;注意：耳蜗组织在培养皿中稳定贴壁的合适尺寸约为半个耳蜗回转。</li>
		<li>用镊子轻轻剥离位于柯蒂氏器正上方的一层极薄且半透明的前庭膜。</li>
		<li>用镊子从两侧接触位于螺旋神经节神经元（SGNs）正上方的Reissner膜，轻轻剥离并移除。 
		注意：&#160;用微型刀切除侧方受损的毛细胞区域。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 将标本转移至培养皿
<ol>
	<li>从四个盖玻片上移除 45 µL 组织粘合剂溶液。用 50 µL 无菌 H2O 清洗每个盖玻片，然后吸去水分。</li>
	<li>取 1 mL 移液器，用约 120 µL DMEM 润洗移液器吸头，以防止样本黏附在吸头内壁。</li>
	<li>使用 1 mL 移液器逐个转移样本。从盛有 HBSS 的小尺寸透明壁玻璃底培养皿中吸取最多 70 µL 液体，并将样本连同液体一起转移至 4 孔培养皿中的一个嵌入片（已放置盖玻片）上。</li>
	<li>在显微镜下（50 倍放大）检查样本是否处于正确方向。确保去除前庭膜后暴露的毛细胞区域朝上，基底膜连同修剪后的耳蜗轴底部朝下，并紧贴盖玻片。
	<ol>
		<li>若检查发现样本方向颠倒，请将移液器吸头中残留的 HBSS 滴入嵌入片中，并重新调整样本位置直至方向正确。 
		注意：此举可防止毛细胞在培养基中漂浮而缺乏盖玻片的结构支撑，从而避免发生退变。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用 1 mL 移液器吸除多余的 HBSS，静置 15 秒。</li>
	<li>将 60 µL 预热的培养基（98% DMEM、1% N-2 和 1% 氨苄青霉素）直接滴加到样本上。注意勿使移液器接触样本。盖好内、外培养皿盖，于 37 °C 孵育过夜。</li>
	<li>将所有储备溶液归位，妥善处理动物残体和剩余废弃物，根据机构规定对手术台进行去污染处理（例如，使用乙醇或次氯酸盐），清洁并高压灭菌器械，并将锐器丢弃至专用容器中。</li>
</ol>
4. 添加终末培养基和目标物质
注意：耳蜗外植体将在 10–16 小时后准备就绪，可供使用。
<ol>
	<li>配制混合液：97% DMEM、1% 胎牛血清（FBS）、1% N-2 和 1% 氨苄青霉素（每孔 65 µL，加入微量离心管中；使用前将溶液预热至 25 °C）。</li>
	<li>为各处理组的溶液添加其他感兴趣的物质。如果添加荧光物质（例如， 绿色荧光蛋白（GFP）表达病毒；在最近的一项研究中，使用了10的浓度10 腺相关病毒（AAVs）的GC在50 µL体系中使用了48小时18，避光保存。</li>
	<li>将含有耳蜗外植体的培养皿从培养箱中取出，置于超净工作台内。</li>
	<li>用移液器从嵌板中吸除旧的培养基（不含FBS）。</li>
	<li>每孔加入 60 µL 预热的培养（处理）液（97% DMEM、1% FBS、1% N-2、1% 氨苄青霉素及目标物质）。</li>
	<li>将培养皿放回培养箱（37 °C）。</li>
	<li>在显微镜下定期观察，以识别污染、细胞迁移或耳蜗外植体脱落的迹象，并在培养不超过7天后进行染色。</li>
</ol>
5. 免疫荧光——第1天
<ol>
	<li>配制封闭液（94% 磷酸盐缓冲液 (PBS)、5% 正常山羊或马血清&#160;(NGS/NHS，根据二抗选择) 和 1% 非离子型表面活性剂（见材料表））以及储备抗体溶液（98.6% PBS、1% NHS、0.4% 非离子型表面活性剂，并加入相应的抗体）。 
	注意：抗体包括 Myo7A 兔抗（浓度为 1:400+，肌球蛋白 7A，用于标记内毛细胞和外毛细胞）、TuJ1 小鼠抗（浓度为 1:200+，β-微管蛋白，用于标记螺旋神经节神经元 SGNs），或 CtBP2 小鼠(IgG1) 抗体（浓度为 1:200+，C末端结合蛋白，用于标记突触前）、PSD95 小鼠(IgG2a) 抗体（浓度为 1:50+，突触后密度蛋白，用于标记突触后）以及 NF-H 鸡抗（浓度为 1:1000+，神经丝蛋白，用于标记 SGNs 和神经纤维）。&#34;+&#34; 表示 &#34;或更高稀释倍数。&#34;</li>
	<li>使用移液器吸除培养基。操作时注意不要触碰样本。</li>
	<li>在超净工作台内，用无菌 PBS 漂洗耳蜗外植体两次，每次漂洗后将样本置于摇床上振荡 5 分钟。</li>
	<li>在摇床上（于通风罩内）用 4% 多聚甲醛 (PFA - 注意：有危险性) 固定组织 20 分钟，随后吸除 PFA 溶液。</li>
	<li>向耳蜗外植体中加入 60 µL PBS，将培养皿置于摇床上振荡 5 分钟，然后吸除 PBS。重复此步骤 3 次。</li>
	<li>将耳蜗外植体放入预先配制的封闭液（94% PBS、5% NHS 和 1% 非离子型表面活性剂）中，在摇床上封闭 30 分钟。</li>
	<li>将耳蜗外植体放入含有相应一抗（使用前涡旋混匀）的预配储备抗体溶液（98.6% PBS、1% NHS 和 0.4% 非离子型表面活性剂）中，在室温下静置过夜（O/N）。 
	注意：&#160;将培养皿用湿润的纸巾包裹后再包上塑料膜（若所加溶液含有荧光物质，如表达 GFP 的病毒，则使用铝箔包裹），以保持湿度并防止抗体溶液在过夜过程中蒸发。</li>
</ol>
6. 免疫荧光 - 第2天
<ol>
	<li>配制4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）染色液（300 nM），并使用抗体原液配制与第5.1步中一抗相匹配的合适二抗混合液。例如山羊抗兔488 1:200+ 和山羊抗小鼠568 1:200+，或山羊抗小鼠（IgG1）568 1:1000+、山羊抗小鼠（IgG2a）488 1:500+ 和山羊抗鸡647 1:200+，或鬼笔环肽568 1:200+（用于内毛细胞和外毛细胞）。</li>
	<li>吸出一抗溶液。</li>
	<li>向耳蜗外植体中加入60 µL PBS，将培养皿置于摇床上振荡5分钟。吸除PBS。重复此步骤3次。</li>
	<li>将耳蜗外植体置于预先配制的抗体储存液（98.6% PBS、1% NHS 和 0.4% 非离子型表面活性剂）中，加入相应的二抗（使用前涡旋混匀），室温孵育 1.5 小时，避光。</li>
	<li>吸弃二抗溶液，用DAPI染色液冲洗耳蜗外植体（置于摇床上1分钟，然后吸弃）。</li>
	<li>向耳蜗外植体中加入60 µL PBS，将培养皿置于摇床上振荡5分钟。吸除PBS。重复操作3次。</li>
	<li>使用镊子从4孔板中取出带有样本的盖玻片，将其浸入盛有蒸馏水的容器中2O，并将盖玻片垂直接触纸巾以晾干。</li>
	<li>在载玻片上滴加一滴抗荧光淬灭封片剂，将盖玻片反转，使朝下的组织浸入封片剂中。</li>
	<li>用透明指甲油沿盖玻片边缘环形封固（注意避免压碎盖玻片下的样本）。将载玻片平放在避光处静置15–20分钟，待其完全干燥后，放入盒中保存或直接在共聚焦显微镜下观察。 
	注意：荧光染色的最佳保存条件是将载玻片置于 4 或 -20 °C 保存。</li>
</ol>
7. 共聚焦成像
<ol>
	<li>获取耳蜗柯蒂氏器区域的概览图像及放大图像，包括神经突和螺旋神经节神经元（SGNs）。 
	注意：成像过程的标准设置如下：图像分辨率为1,024 × 1,024像素，扫描速度为400 Hz，帧平均数为3，激光总强度为20%，通常使用20X和63X&#160;油浸物镜（可结合2倍数字放大）。DAPI、Myo7A和TuJ1染色方案的通道设置如上所述：405 nm通道，5% DAPI，&#34;Smart Gain&#34; 766.8 V，&#34;Smart Offset&#34; 0.0%；488 nm通道，15%异硫氰酸荧光素（FITC），&#34;Smart Gain&#34; 622.2 V，&#34;Smart Offset&#34; 0.0%；561 nm通道，13%四甲基罗丹明异硫氰酸酯（TRITC），&#34;Smart Gain&#34; 562.4 V，&#34;Smart Offset&#34; 0.0%。</li>
	<li>使用软件将z轴层扫图像合并，生成z轴投影图像。</li>
</ol>

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作者无任何利益冲突需要披露。

在进行涉及耳蜗组织外植体的实验之前，研究人员必须熟练掌握解剖技术。在学习曲线的初期阶段进行解剖时，毛细胞常常会受到损伤，其中对细胞完整性尤为不利的一个环节是撕除前庭膜，该步骤需要稳定的手法、合适的工具以及丰富的经验。为了节约时间和资源，应在解剖显微镜下进行视觉检查，并记录可能受损的区域。在初步实验中，相较于昂贵的一抗和二抗，使用鬼笔环肽等成本较低的试剂更为合适。轻微受损的外植体在某些实验中仍可作为对照使用（例如分析未受影响的切片区域），或用于测试新的抗体组合。
标本的转移也尤为重要，因为必须确保标本不会被上下颠倒放置&#34;漂浮&#34; 无包被盖玻片引导时，毛细胞常发生退化。将细胞置于盖玻片中央位置有利于后续所有移液操作。
在涉及新型化合物的阴性对照实验中（这些化合物显然必须可溶于培养基），重要的是应对外植体使用适当的溶剂对照，而不仅仅关注未经处理的外植体。例如，如果一种市售药物除活性成分外还含有柠檬酸钠，则应将柠檬酸钠添加到阴性对照组的耳蜗外植体中，因为柠檬酸钠本身可能产生影响。
<p class="jove_c...

感音神经性听力损失（SNHL）反映了内耳或上行听觉通路的损伤。尽管听力损失是人类最常见的感觉功能障碍1，但目前尚无治愈性疗法2。虽然人工耳蜗或听觉脑干植入装置能够为中重度至极重度SNHL患者恢复一定程度的听力，但这些设备所提供的听力体验仍与&#34;自然&#34;听力存在显著差异，尤其在噪声环境中理解言语或聆听音乐时更为明显。
虽然毛细胞变性长期以来一直被认为是创伤性听觉事件（例如暴露于强噪声）的主要后果，但越来越多的证据表明，将信息从毛细胞传递到听觉神经的突触对声创伤的易损性至少与毛细胞相当3,4,5,6。由于目前评估听力功能的金标准——人类听阈测定结果——无法预测内耳中特定的细胞损伤，因此需要更精细的工具以尽早发现细胞变性，并及时启动适当的治疗7。
有前景的听力损失药物治疗通常在同质细胞培养物上进行测试 体外，但此类系统无法准确模拟耳蜗的微环境。已知耳蜗细胞会分泌影响耳蜗内其他细胞类型的神经营养因子8,9，一个至关重要的 体内 耳蜗柯蒂氏器功能丧失时消失的过程10,11 或螺旋神经节神经元（SGNs）12 在单独培养或分析分子标志物时13然而， 体内 可能需要用于验证的研究 体外 数据以建立新的个性化听力损失治疗方法，致力于 &#34;精准医学&#34; 需要耗费大量资源和时间。这一点在考虑完成中耳或圆窗膜注射、听力测试以及随后的耳蜗铺片解剖所需付出的巨大努力时尤为突出。在耳蜗类器官培养中对有前景的化合物进行高效筛选 离体 被称为耳蜗外植体的培养方法提供了一种经济且可靠的替代方案14,15,16,17.
本文详细介绍了一种用于制备、维持和评估经处理的耳蜗组织外植体的实验方案。重点强调了该模型的具体应用，包括用于筛选潜在治疗化合物以及比较评价基因治疗中病毒载体的效果。 离体 外植体方法可使研究人员观察特定处理对不同细胞群体的影响 原位，有助于识别细胞类型特异性的机制，并进一步优化靶向治疗策略。
总体而言，该技术为研究耳蜗提供了一个模型 离体 同时保持耳蜗内共存的多种不同类型细胞之间至关重要的相互作用。

<table><tbody><tr><td>氨苄青霉素钠盐</td><td>Invitrogen</td><td>11593-027</td><td></td></tr><tr><td>抗CtBP2抗体，小鼠（IgG1）</td><td>BD 转导实验室</td><td>612044</td><td></td></tr><tr><td>兔抗 Myo7A 抗体</td><td>Proteus Biosciences</td><td>25-6790</td><td></td></tr><tr><td>抗NF-H抗体，鸡源</td><td>EMD Millipore</td><td>AB5539</td><td></td></tr><tr><td>抗PSD95抗体，小鼠（IgG2a）</td><td>Antibodies Inc.</td><td>75-028</td><td></td></tr><tr><td>抗TuJ1抗体，小鼠</td><td>BioLegend</td><td>801202</td><td></td></tr><tr><td>Cell-Tak 细胞和组织粘附剂，5 mg</td><td>康宁</td><td>354241</td><td></td></tr><tr><td>CELLSTAR 15 mL 离心管，锥形底，带刻度，无菌</td><td>Greiner Bio-One</td><td>188161</td><td></td></tr><tr><td>CELLSTAR 细胞培养皿，100 × 20 mm</td><td>Greiner Bio-One</td><td>664160</td><td></td></tr><tr><td>CELLSTAR 细胞培养皿，35 × 10 mm，带4个内环</td><td>Greiner Bio-One</td><td>627170</td><td></td></tr><tr><td>CELLSTAR 细胞培养皿，60 × 15 mm</td><td>Greiner Bio-One</td><td>628160</td><td></td></tr><tr><td>CELLSTAR 50 mL 离心管，锥形底，带刻度，无菌</td><td>Greiner Bio-One</td><td>227261</td><td></td></tr><tr><td>透明指甲油</td><td>电子显微镜科学公司</td><td>72180</td><td></td></tr><tr><td>透明壁玻璃底培养皿（玻璃直径 40 mm），PELCO&amp;reg;，套管/20，50 x 7 毫米</td><td>Ted Pella 公司</td><td>14027-20</td><td></td></tr><tr><td>盖玻片，圆形，玻璃，直径10 mm，厚度#1，0.13 - 0.16 mm</td><td>Ted Pella 公司</td><td>260368</td><td></td></tr><tr><td>DAPI（4',6-二脒基-2-苯基吲哚，盐酸盐）</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>蒸馏水，500 mL</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>15230-162&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>高糖型 Dulbecco 改良 Eagle 培养基（DMEM），含丙酮酸钠，不含谷氨酰胺，500 mL</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>10313-039</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #4 镊子</td><td>Fine Science Tools</td><td>11241-30</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #55 镊子（Dumostar）</td><td>Fine Science Tools</td><td>11295-51</td><td></td></tr><tr><td>乙醇（EtOH），纯品，200 proof，无水 &amp;ge;99.5%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>459836-1L</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清（FBS），经鉴定，符合美国农业部批准地区标准，500 mL</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>10437-028&amp;nbsp;</td><td>分装至50 mL离心管中，于-20℃保存&amp;deg;C 冷冻室</td></tr><tr><td>山羊抗鸡-647 二抗</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>A-21469</td><td></td></tr><tr><td>山羊抗小鼠(IgG)-568 二抗</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>A-11004</td><td></td></tr><tr><td>山羊抗小鼠（IgG1）-568 二抗</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>A-21124</td><td></td></tr><tr><td>山羊抗小鼠（IgG2a）-488 二抗</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>A-21131</td><td></td></tr><tr><td>山羊抗兔-488 二抗</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>R37116</td><td></td></tr><tr><td>H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O，无菌，EmbryoMax 超纯水，500 mL</td><td>EMD Millipore</td><td>TMS-006-B</td><td></td></tr><tr><td>Hank's 平衡盐溶液（HBSS），含钙、含镁，无酚红，500 mL</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>14025-092</td><td></td></tr><tr><td>带盖不锈钢器械托盘</td><td>Mountainside Medical</td><td>TechMed4255</td><td></td></tr><tr><td>显微（解剖）刀 &amp;ndash; 30度角&amp;deg;</td><td>精细科学工具</td><td>10056-12</td><td></td></tr><tr><td>显微镜载玻片，VistaVision，彩色编码，75 x 25 mm（3 x 1）&quot;），1 毫米厚，白色，72 片装</td><td>VWR</td><td>16004-382</td><td></td></tr><tr><td>N-2 补充剂（100 倍浓缩液），5 mL</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO₃&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;7.5% 碳酸氢钠溶液，100 mL</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>25080-094</td><td></td></tr><tr><td>NaOH，氢氧化钠溶液，1 L</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>SS266-1</td><td></td></tr><tr><td>正常马血清（NHS）</td><td>Invitrogen</td><td>16050130</td><td></td></tr><tr><td>手术剪的使用</td><td>Roboz外科器械公司</td><td>RS-6806</td><td></td></tr><tr><td>多聚甲醛（PFA），试剂级，结晶状</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td>使用前：根据在线可获取的方案建立标准操作规程</td></tr><tr><td>PBS，pH 7.4，500 mL</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>10010-023&amp;nbsp;</td><td>使用前需高压灭菌</td></tr><tr><td>鬼笔环肽，Alexa Fluor 568&amp;nbsp;</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>A12380</td><td></td></tr><tr><td>非无菌制备垫&amp;nbsp;</td><td>Medline</td><td>05136CS</td><td></td></tr><tr><td>安全锁微型离心管，聚丙烯材质，0.5 mL</td><td>Eppendorf</td><td>022363719</td><td>使用前高压灭菌</td></tr><tr><td>安全锁微型离心管，聚丙烯材质，1.5 mL</td><td>Eppendorf</td><td>022363204</td><td>使用前高压灭菌</td></tr><tr><td>手术刀片 - #15</td><td>精细科学工具</td><td>10015-00</td><td></td></tr><tr><td>手术刀柄 - #4</td><td>Fine Science Tools</td><td>10004-13</td><td></td></tr><tr><td>Stemi 2000-C 体视显微镜</td><td>Zeiss&amp;nbsp;</td><td>000000-1106-133</td><td></td></tr><tr><td>TCS SP5 共聚焦显微镜</td><td>Leica</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X（非离子型表面活性剂）</td><td>Integra</td><td>T756.30.30</td><td></td></tr><tr><td>荧光防淬灭封片剂 VectaShield</td><td>Vector Laboratories, Inc.</td><td>H-1000</td><td></td></tr><tr><td>拉链袋，可重复封口，4 x 6英寸 - 厚度2 mm</td><td>Zipline</td><td>0609132541599</td><td></td></tr></tbody></table>

新生小鼠耳蜗外植体技术作为一种 体外 听力研究中的筛查工具

Neonatal Murine Cochlear Explant Technique as an In Vitro Screening Tool in Hearing Research

尽管在过去几十年中听觉研究取得了显著进展，但感音神经性听力损失（SNHL）至今仍无治愈方法。该疾病通常涉及内耳精细的机械感受结构的损伤或丧失。复杂的 体外 和 离体 近年来，各种检测方法不断涌现，能够在最大限度减少资源消耗的同时，筛选出越来越多具有潜在治疗作用的化合物，从而加快针对感音神经性听力损失（SNHL）的治疗方法的开发进程。尽管特定细胞类型的均质培养在当前研究中仍发挥着重要作用，但许多科学家现已转向依赖更为复杂的鼠类内耳器官型培养，也称为耳蜗组织块培养。内耳中有序细胞结构的保留有助于 原位 对耳蜗结构的各个组成部分进行评估，包括内毛细胞和外毛细胞、螺旋神经节神经元、神经突以及支持细胞。本文介绍了新生小鼠耳蜗组织块的制备、培养、处理及免疫染色方法。这些组织块的精细制备有助于识别导致感音神经性听力损失（SNHL）的机制，为听力研究领域提供了一种重要的研究工具。

尽管许多实验方案聚焦于耳蜗柯蒂氏器的外植培养，本技术旨在保留整个耳蜗回旋的解剖结构，包括螺旋神经节神经元（SGNs）。这使得研究人员能够分析特定处理对SGNs的神经突起和胞体所产生的影响，而不仅限于柯蒂氏器。如本文所述，保留部分蜗轴的显微解剖操作相较于单独分离柯蒂氏器更具技术挑战性。然而，神经突及SGN区域至关重要，因为在最近两项采用相同方法的研究中发现，施加前庭神经鞘瘤分泌物（图1）和细胞外囊泡后，该区域出现了显著的病理改变19,20。此类变化若仅使用分离的柯蒂氏器外植体则无法被揭示。
可通过手动计数或自动方法（例如 ImageJ 插件 NeuronJ 中内置的方法）对内毛细胞和外毛细胞、支持细胞以及螺旋神经节神经元（SGN）中受损或表达 GFP 的细胞进行定量分析。在确认其与总细胞数具有相关性后，可...

本实验方案旨在演示新生小鼠耳蜗组织块的制备、培养、处理及免疫染色。该技术可作为 体外 听力研究中的筛查工具

尽管在过去几十年中，听力研究取得了显著进展，但感音神经性听力损失（SNHL）至今仍无治愈方法，一种……

本实验的总体目标是制备、培养、处理并进行免疫染色新生小鼠耳蜗外植体，以作为听力研究中的一种体外筛选工具。该方法有助于回答听力研究领域中的关键问题，例如能够在离体模型中同时研究耳蜗毛细胞、突触、神经突和神经元，并揭示新进入耳蜗的分子的作用机制，包括在人类分泌物中发现的因子。该技术的主要优势在于，可在候选治疗化合物进行体内测试之前，加速其筛选过程。取一个新鲜采集的新生儿头部，置于培养皿盖内含70%乙醇的溶液中。使用手术刀片从颅骨前端至后端在皮肤上做一浅表切口。然后切断两侧外耳道，并将皮肤向前翻折，以暴露整个颅骨。接下来，沿矢状缝轻轻前后移动手术刀刀片，切开颅骨，注意避免压迫耳蜗。在眼眶正后方做一垂直切口，移除并丢弃吻部。颅骨的后部应仍保留脑组织和耳蜗。然后使用4号镊子钝性分离并去除前脑、小脑和脑干。将颅骨的两半放入盛有冷HBSS的60毫米塑料培养皿中。再用4号镊子完全暴露毗邻周围镫骨动脉的耳蜗，并钝性分离耳蜗与颞骨。将耳蜗转移至含有HBSS的50毫米透明玻璃底培养皿中，并将培养皿置于显微镜下。将装有颅骨另一半的60毫米塑料培养皿放置于冰上。接着，使用4把镊子小心解剖耳蜗的耳囊。现在，使用显微刀或两把55号镊子，小心地将与柯蒂氏器相连的螺旋韧带从耳蜗其余部分及内侧部分离。操作时可捏住螺旋韧带最基底部，一边向顶部方向移动，一边轻柔地将其旋开。移除螺旋韧带后，调整标本位置，以获得耳蜗的纵向矢状切面视图。然后使用微型刀片将耳蜗切成两到三段，并将这些片段分类为顶回和底回。对于更靠近顶端的片段，去除其上方组织；对于更靠近底端的片段，去除其下方组织，直至暴露毛细胞和神经突的实际层，以便耳蜗外植体能够水平贴附于培养皿中。接下来，用镊子轻轻夹住并剥离位于柯蒂器官上方的一层极薄且半透明的盖膜。技术上最具挑战性的步骤可能是移除薄而半透明的盖膜，因为操作时很容易损伤其下方的毛细胞。通过从组织边缘开始剥离，除剥离起始处的最边缘区域外，可沿外植体全长保留毛细胞。最后，用镊子从两侧轻触位于螺旋神经节神经元正上方的前庭膜，并将其剥离去除。耳蜗样本在去除边缘受损区域后，现已准备好进行培养。开始培养操作时，先用约120微升DMEM润湿1毫升移液枪头的尖端，以防止外植体黏附在枪头内部。然后使用预先润湿的枪头从玻璃底培养皿中吸取最多70微升液体，并将样本连同液体一起转移至四孔培养皿四个内插片中的任意一个上。在显微镜下检查组织块的方向是否正确。确保毛细胞区域（其上的盖膜已被去除）朝上，而基底膜连同修剪过的内侧基底部朝下，并贴附于盖玻片嵌片上。如果观察发现标本方向颠倒（如此处所示），则从移液器尖端加入HBSS，并重新调整组织位置，直至其方向正确。当组织块正确放置后，吸除多余的HBSS，静置15秒。随后，用移液器将60 µL预热的培养基直接滴加到标本上，注意移液时不要接触标本。盖上内、外层培养皿盖，于37°C孵育过夜。第二天，将含有耳蜗外植体的培养皿从培养箱转移到超净台中。吸除嵌体中不含FBS的旧培养基。每孔加入60 µL已预热的处理培养基。将培养皿放回培养箱中，培养至多七天，直至染色完成。如本共聚焦图像所示，该技术可完整保存包括螺旋神经节神经元（SGNs）在内的整个耳蜗回的解剖结构，从而可对SGNs的神经突和胞体以及柯蒂氏器进行治疗效应分析。如图所示，这些耳蜗组织块经免疫荧光染色后，可同时用于比较治疗对耳蜗顶转和底转的影响。毛细胞呈绿色，神经结构呈红色。通过将突触前蛋白（红色）和突触后蛋白（绿色）共同标记，并结合神经结构的蓝色染色，可评估完整突触。该图显示了耳蜗顶端和底端外植体在体外培养七天后的代表性图像，左侧为含3%FBS的培养条件，右侧为含1%FBS的培养条件。在3%FBS中孵育的细胞从第4天到第5天开始迁移，图中浅灰色箭头指示毛细胞，红色箭头指示神经突。在1%FBS中的组织块可维持组织结构完整性直至第7天。在进行该操作时，需注意在添加最终培养基和目标物质前，应通过肉眼观察确保耳蜗组织的结构完整性和正确方向。通过此操作，可进行三维重建，以确认表达GFP的细胞在中缝核内特定细胞类型的定位。

neonatal-murine-cochlear-explant-technique-as-an-vitro-screening-tool

Research

科研

JoVE Journal

Medicine

医学

新生儿鼠耳蜗外科手术技术<em&gt;体外</em&gt;听力研究筛选工具

本实验方案描述了一种分离和培养小鼠耳蜗柯蒂器官（可选择性保留或去除螺旋缘和螺旋神经节神经元）的方法。我们还展示了通过电穿孔技术在柯蒂器官外植体中表达外源报告基因的方法。...

小鼠耳蜗柯蒂氏器的原代培养与质粒电穿孔转染

小鼠内耳是一种由外胚层生发层（placode）衍生而来的感觉器官，其发育程序在胚胎发育期间逐步展开。我们定义了一种 在子宫内 基因转移技术，包括三个步骤：小鼠腹部剖腹术、经子宫显微注射和 体内...

将基因转移至发育中的小鼠内耳 在体 内 电穿孔

活体成像哺乳动物胚胎耳蜗具有挑战性，因为相关发育过程在十天内呈现时间梯度变化。本文介绍一种方法，用于培养并连续五天对来自荧光报告小鼠的胚胎耳蜗外植体组织进行成像。...

小鼠耳蜗组织外植体的长期延时成像

我们介绍一种从胚胎小鼠内耳分离和培养耳蜗外植体的方法。同时，我们还演示了通过方波电穿孔法将基因转入耳蜗外植体的技术。体外外植体培养结合基因转移技术，使研究人员能够研究在发育过程中改变基因表达所产生的影响。...

小鼠胚胎耳蜗外植体培养及电穿孔介导的基因转导

存在多种将耳毒性物质导入动物模型耳蜗的方法。本文介绍了一种通过圆窗龛递送耳毒性物质的手术方案。该方法具有良好的可靠性，可产生靶向的耳蜗内损伤，同时避免对微细结构造成机械性损伤。此外，可进一步用于研究耳蜗的自我修复与再生能力。...

小鼠圆窗给药法用于耳毒性药物递送：一种诱导耳蜗细胞退变的快速可靠技术

本研究中，我们描述了通过后半规管途径作为向新生小鼠内耳递送基因的可靠方法。我们证明，通过后半规管进行基因递送能够灌注整个内耳。...

新生小鼠内耳基因递送的后半规管入路

耳蜗植入物的动物模型有助于增进对利用电刺激治疗永久性感音神经性听力损失的技术基础的认识。本研究介绍了一种在小鼠中进行急性致聋和耳蜗植入电极阵列的手术方案，以及通过听觉脑干反应进行功能评估的方法。...

C57BL/6小鼠的耳蜗植入手术及电诱发听觉脑干反应记录

鸡是一种经济、易得且广泛可用的模式生物，适用于多种研究。本文详细描述了一系列实验方案，旨在揭示禽类内耳发育与再生的分子机制。...

In Ovo 与 Ex Ovo 研究禽类内耳发育的方法

小型猪（迷你猪）是研究人工耳蜗植入的理想大型动物模型。在小型猪中进行人工耳蜗植入手术，可用于在与人类相似的活体系统中，初步验证新型电极阵列和手术方法的安全性及潜在性能。...

小型猪：一种用于人工耳蜗植入研究的大型动物模型

本方案更新了以往的实验方法，纳入了相对简便的高质 Cochlear...

新生小鼠耳蜗全组织外植体作为 体外 模型

本文介绍了一种从小鼠中分离和培养原代耳蜗毛细胞的详细方案。首先，在显微镜下从新生小鼠（3-5日龄）耳蜗中分离出柯蒂氏器。随后，通过酶消化法将组织解离为单细胞悬液，并在培养数天后通过免疫荧光鉴定细胞。...

新生小鼠耳蜗毛细胞的分离与原代培养

学习新生小鼠耳蜗外植体的制备、培养、处理及免疫染色技术，用于听力研究的体外筛选工具。该方法可同时研究耳蜗毛细胞、突触和神经元，加速候选治疗化合物的筛选进程。

新生小鼠耳蜗外植体技术作为一种体外听力研究中的筛查工具

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