新生小鼠耳蜗外植体技术作为一种 体外 听力研究中的筛查工具

本实验的总体目标是制备、培养、处理并进行免疫染色新生小鼠耳蜗外植体，以作为听力研究中的一种体外筛选工具。该方法有助于回答听力研究领域中的关键问题，例如能够在离体模型中同时研究耳蜗毛细胞、突触、神经突和神经元，并揭示新进入耳蜗的分子的作用机制，包括在人类分泌物中发现的因子。该技术的主要优势在于，可在候选治疗化合物进行体内测试之前，加速其筛选过程。

取一个新鲜采集的新生儿头部，置于培养皿盖内含70%乙醇的溶液中。使用手术刀片从颅骨前端至后端在皮肤上做一浅表切口。然后切断两侧外耳道，并将皮肤向前翻折，以暴露整个颅骨。

接下来，沿矢状缝轻轻前后移动手术刀刀片，切开颅骨，注意避免压迫耳蜗。在眼眶正后方做一垂直切口，移除并丢弃吻部。颅骨的后部应仍保留脑组织和耳蜗。

然后使用4号镊子钝性分离并去除前脑、小脑和脑干。将颅骨的两半放入盛有冷HBSS的60毫米塑料培养皿中。再用4号镊子完全暴露毗邻周围镫骨动脉的耳蜗，并钝性分离耳蜗与颞骨。

将耳蜗转移至含有HBSS的50毫米透明玻璃底培养皿中，并将培养皿置于显微镜下。将装有颅骨另一半的60毫米塑料培养皿放置于冰上。接着，使用4把镊子小心解剖耳蜗的耳囊。

现在，使用显微刀或两把55号镊子，小心地将与柯蒂氏器相连的螺旋韧带从耳蜗其余部分及内侧部分离。操作时可捏住螺旋韧带最基底部，一边向顶部方向移动，一边轻柔地将其旋开。移除螺旋韧带后，调整标本位置，以获得耳蜗的纵向矢状切面视图。

然后使用微型刀片将耳蜗切成两到三段，并将这些片段分类为顶回和底回。对于更靠近顶端的片段，去除其上方组织；对于更靠近底端的片段，去除其下方组织，直至暴露毛细胞和神经突的实际层，以便耳蜗外植体能够水平贴附于培养皿中。接下来，用镊子轻轻夹住并剥离位于柯蒂器官上方的一层极薄且半透明的盖膜。

技术上最具挑战性的步骤可能是移除薄而半透明的盖膜，因为操作时很容易损伤其下方的毛细胞。通过从组织边缘开始剥离，除剥离起始处的最边缘区域外，可沿外植体全长保留毛细胞。最后，用镊子从两侧轻触位于螺旋神经节神经元正上方的前庭膜，并将其剥离去除。

耳蜗样本在去除边缘受损区域后，现已准备好进行培养。开始培养操作时，先用约120微升DMEM润湿1毫升移液枪头的尖端，以防止外植体黏附在枪头内部。然后使用预先润湿的枪头从玻璃底培养皿中吸取最多70微升液体，并将样本连同液体一起转移至四孔培养皿四个内插片中的任意一个上。

在显微镜下检查组织块的方向是否正确。确保毛细胞区域（其上的盖膜已被去除）朝上，而基底膜连同修剪过的内侧基底部朝下，并贴附于盖玻片嵌片上。如果观察发现标本方向颠倒（如此处所示），则从移液器尖端加入HBSS，并重新调整组织位置，直至其方向正确。

当组织块正确放置后，吸除多余的HBSS，静置15秒。随后，用移液器将60 µL预热的培养基直接滴加到标本上，注意移液时不要接触标本。盖上内、外层培养皿盖，于37°C孵育过夜。

第二天，将含有耳蜗外植体的培养皿从培养箱转移到超净台中。吸除嵌体中不含FBS的旧培养基。每孔加入60 µL已预热的处理培养基。

将培养皿放回培养箱中，培养至多七天，直至染色完成。如本共聚焦图像所示，该技术可完整保存包括螺旋神经节神经元（SGNs）在内的整个耳蜗回的解剖结构，从而可对SGNs的神经突和胞体以及柯蒂氏器进行治疗效应分析。如图所示，这些耳蜗组织块经免疫荧光染色后，可同时用于比较治疗对耳蜗顶转和底转的影响。

毛细胞呈绿色，神经结构呈红色。通过将突触前蛋白（红色）和突触后蛋白（绿色）共同标记，并结合神经结构的蓝色染色，可评估完整突触。该图显示了耳蜗顶端和底端外植体在体外培养七天后的代表性图像，左侧为含3%FBS的培养条件，右侧为含1%FBS的培养条件。

在3%FBS中孵育的细胞从第4天到第5天开始迁移，图中浅灰色箭头指示毛细胞，红色箭头指示神经突。在1%FBS中的组织块可维持组织结构完整性直至第7天。在进行该操作时，需注意在添加最终培养基和目标物质前，应通过肉眼观察确保耳蜗组织的结构完整性和正确方向。

通过此操作，可进行三维重建，以确认表达GFP的细胞在中缝核内特定细胞类型的定位。