Name: Ex 活体人肺肿瘤切片中居民 CD8 T 淋巴细胞的共聚焦显微成像 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 28 s
Description: 学习使用共聚焦显微镜对人肺癌肿瘤切片中驻留的CD8 T淋巴细胞进行实时成像的方法。该技术通过荧光抗体标记，帮助研究人员观察T细胞在肿瘤微环境中的迁移行为，为肿瘤免疫学研究提供重要工具。

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我们感谢巴黎科钦研究所科钦影像平台的Pierre Bourdoncle和Thomas Guilbert在显微镜使用方面提供的建议和帮助。本工作部分得到了法国国家抗癌联盟（Ligue Nationale contre le Cancer）、个性化癌症医学研究中心（CARPEM）、法国基金会以及欧盟“地平线2020”研究与创新项目（资助协议编号667980，CARAT）的资助。

人源肿瘤样本的获取已获得法国伦理委员会以及巴黎公立医院集团（AP-HP）的批准，并符合法国法律第L.1121-1条的规定。患者在纳入研究前均签署了书面知情同意书。
1. 获取人肺肿瘤组织
<ol>
	<li>获取接受过完全性肺肿瘤切除术的 I-III 期非小细胞肺癌患者的肺肿瘤新鲜组织样本4。</li>
	<li>将未经固定的肿瘤组织置于含有冰冻的 RPMI 1640 培养基（Roswell Park Memorial Institute 培养基）的 15 mL 圆锥形试管中运输。置于冰上静置 30 分钟，直至进行步骤 2.7。 
	注意：若肿瘤样本在下午送达，可将其于 4 °C 过夜保存，并于次日进行处理。此种情况下，需在 RPMI-1640 培养基中添加 5% 胎牛血清（FBS）。</li>
</ol>
2. 人类肺癌组织的琼脂糖包埋与振动切片
注意：第 2.10 步之前的所有操作均需在无菌条件下进行。
<ol>
	<li>配制5%琼脂糖包埋液：将1 g低熔点琼脂糖溶解于20 mL无钙镁的无菌磷酸盐缓冲液（PBS）中，微波加热至琼脂糖完全溶解。将溶液置于37 °C培养箱中孵育5分钟，使其冷却至37 °C。</li>
	<li>在组织培养超净台中，配制完全RPMI-1640培养基（不含酚红），其中包含10%胎牛血清（FBS）、4 mM L-谷氨酰胺以及1×青霉素-链霉素。</li>
	<li>向6孔细胞培养板的每孔中加入1.1 mL完全RPMI-1640培养基，并在每孔中放置一个30 mm细胞培养插件。将培养板置于37 °C培养箱中静置30分钟，直至步骤2.12。</li>
	<li>将灭菌的不锈钢平垫圈（内径5 mm，外径10 mm，厚度1 mm）放入盛有完全RPMI培养基的35 mm塑料培养皿中。这些垫圈后续将用于在振动切片机切取的组织切片上集中抗体。</li>
	<li>将肿瘤活检组织置于10 cm塑料培养皿中，用锋利刀片将其切成约5×5 mm大小的立方体小块。</li>
	<li>从培养箱中取出琼脂糖溶液，倒入35 mm塑料培养皿中。</li>
	<li>用镊子小心地将肿瘤组织块转移至吸水纸上，去除多余培养基。将组织块插入琼脂糖中，并使其沉降至塑料培养皿底部。将琼脂糖凝胶置于冰上5分钟，使其凝固。</li>
	<li>琼脂糖完全凝固后，将塑料培养皿倒置，用刮铲小心将整块凝胶取出。</li>
	<li>用锋利刀片修整围绕肿瘤组织块的多余琼脂糖，使组织周围保留3–5 mm厚的凝胶。</li>
	<li>用一滴无毒的氰基丙烯酸丁酯组织胶将每块琼脂糖凝胶固定在振动切片机的样品盘上。在振动切片机的缓冲槽中加入无菌冰冻PBS，并将样品盘安装至槽内。</li>
	<li>将包埋在琼脂糖中的组织切成350 µm厚的切片。将振动切片机的切片速度调至慢速范围（0.2–0.3 mm/s），振动频率调至中等范围（1.5 mm）。</li>
	<li>用精细镊子小心收集切下的肿瘤组织切片，并将其平整地放置于6孔板的细胞培养插件上（见步骤2.3）。每个插件上放置一片切片。操作切片时需格外小心，因其极易受损。</li>
	<li>用精细镊子将不锈钢垫圈放置在每一片组织切片上。确保垫圈准确放置在肿瘤组织周围琼脂糖区域上。</li>
	<li>将培养板置于37 °C、5% CO2的湿润培养箱中孵育10分钟。随后进行免疫染色。</li>
</ol>
3. 组织驻留CD8 T细胞与肿瘤细胞的免疫染色
<ol>
	<li>将抗体（终浓度为 10 µg/mL）和核染料（终浓度为 1 µg/mL）用不含酚红的 RPMI-1640 培养基稀释。 
	注意：使用荧光标记的抗 CD8 抗体（小鼠 IgG，克隆号 SK1）和抗 EpCAM 抗体（上皮细胞黏附分子，小鼠 IgG，克隆号 HEA-125）分别标记 CD8 T 淋巴细胞和肿瘤上皮细胞。使用荧光标记的抗 CD90/Thy1 抗体（小鼠 IgG，克隆号 5E10）标记成纤维细胞和活化的内皮细胞。使用 4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）对细胞膜完整性受损的细胞核进行染色，以评估组织活性。</li>
	<li>从培养箱中取出培养板，使用移液器吸除不锈钢洗涤环内的所有液体。不要移除细胞培养插件下方的 1.1 mL RPMI-1640 培养基（步骤 2.3）。</li>
	<li>在不接触组织切片的前提下，使用移液器枪头将 40 µL 含抗体的溶液加至每一片肿瘤组织切片上。</li>
	<li>将培养板在 37 °C 下孵育 15 分钟，以完成抗体染色。</li>
	<li>使用精细镊子移除洗涤环，取出组织切片，并将其在不含酚红的 RPMI-1640 培养基中浸洗 10 秒。将切片重新放回细胞培养插件上，每片切片上滴加一滴不含酚红的 RPMI-1640 培养基。将培养板在 37 °C 下继续维持 10 分钟，随后进行成像分析。</li>
</ol>
4. 人肺癌组织切片中驻留性CD8 T细胞迁移的成像与分析
注意：本方案中使用的共聚焦显微镜为直立式转盘共聚焦显微镜，配备25倍水浸物镜（25x/0.95 N.A.）。
<ol>
	<li>准备显微镜装置
	<ol>
		<li>在开始成像实验前数小时，将显微镜加热腔的温度设定为 37 °C。</li>
		<li>建立一个持续灌注系统，用含氧（5% CO2，95% O2）且不含酚红的 RPMI 培养基对肿瘤切片进行灌注（图 1）。使用蠕动泵将灌注液泵入成像腔，并将废液抽吸至废液收集瓶中。</li>
		<li>启动蠕动泵，使含氧溶液流经灌注管路。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用精细镊子从 6 孔板中取出切片，转移至盛有不含酚红的 RPMI 培养基的 35 mm 塑料培养皿中。使用直径为 19.7 mm、线间距为 2 mm 的切片固定锚固定切片。将培养皿放置在显微镜的成像载物台上。连接灌注系统的进液端和出液端。开启灌注系统，并将培养基流速设定为 0.8 mL/min。</li>
	<li>将水浸物镜下降至切片位置。&#160;使用明场照明对切片表面进行聚焦。根据适当的荧光光源，选择一个包含 CD8 T 细胞、肿瘤细胞岛（EpCAM 阳性）和基质区域（CD90 阳性）的兴趣区域。通过检测切面及组织深层的 DAPI 染色情况，评估切片内细胞的存活状态。 
	注意：健康的切片在距离切面数微米范围内仅有少数 DAPI 阳性细胞。</li>
	<li>设置成像实验参数，执行以下操作。
	<ol>
		<li>根据三种荧光染料的荧光信号强度，将曝光时间设定在 50 至 800 ms 之间，激光强度设定在 20% 至 40% 之间。</li>
		<li>选择在肿瘤切片内成像的 z 轴堆栈厚度。 
		注意：此处采集了共 10–12 个光学层面，z 轴总深度为 60–70 µm。</li>
		<li>将起始位置设定在首个标记的 CD8 T 细胞下方约 10 µm 处。</li>
		<li>设定每帧 z 轴堆栈图像之间的时间间隔为 10 至 30 秒，总记录时间为 10 至 30 分钟。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>按照参考文献4所述方法分析驻留型 CD8 T 细胞的迁移行为。
	<ol>
		<li>将数据导入轨迹追踪软件后，为视野中每个 CD8 T 细胞创建定位点。根据所成像的荧光细胞调整细胞直径和检测阈值。</li>
		<li>检查所有轨迹，删除无关轨迹。通过连接或断开不同轨迹及同一轨迹在不同时间点的部分，对轨迹进行校正。将数据（轨迹速度、轨迹位移长度）导出至电子表格软件。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Asperti-Boursin, F., Real, E., Bismuth, G., Trautmann, A., Donnadieu, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CCR7+ligands+control+basal+T+cell+motility+within+lymph+node+slices+in+a+phosphoinositide+3-kinase-+independent+manner%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">CCR7 ligands control basal T cell motility within lymph node slices in a phosphoinositide 3-kinase- independent manner.</a> J Exp Med. 204 (5), 1167-1179 (2007).</li>
<li>Salmon, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vivo+imaging+of+T+cells+in+murine+lymph+node+slices+with+widefield+and+confocal+microscopes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Ex vivo imaging of T cells in murine lymph node slices with widefield and confocal microscopes.</a> J Vis Exp. (53), e3054(2011).</li>
<li>Salmon, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+architecture+defines+the+preferential+localization+and+migration+of+T+cells+into+the+stroma+of+human+lung+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Matrix architecture defines the preferential localization and migration of T cells into the stroma of human lung tumors.</a> J Clin Invest. 122 (3), 899-910 (2012).</li>
<li>Bougherara, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-Time+Imaging+of+Resident+T+Cells+in+Human+Lung+and+Ovarian+Carcinomas+Reveals+How+Different+Tumor+Microenvironments+Control+T+Lymphocyte+Migration%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Real-Time Imaging of Resident T Cells in Human Lung and Ovarian Carcinomas Reveals How Different Tumor Microenvironments Control T Lymphocyte Migration.</a> Front Immunol. 6, 500(2015).</li>
<li>Mandal, R., Chan, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Personalized+Oncology+Meets+Immunology%3A+The+Path+toward+Precision+Immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Discov%22%5BJournal%5D)">Personalized Oncology Meets Immunology: The Path toward Precision Immunotherapy.</a> Cancer Discov. 6 (7), 703-713 (2016).</li>
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<li>Rashidian, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noninvasive+imaging+of+immune+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Noninvasive imaging of immune responses.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (19), 6146-6151 (2015).</li>
<li>Wolf, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collagen-based+cell+migration+models+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Collagen-based cell migration models in vitro and in vivo.</a> Semin Cell Dev Biol. 20 (8), 931-941 (2009).</li>
<li>Germain, R. N., Robey, E. A., Cahalan, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+decade+of+imaging+cellular+motility+and+interaction+dynamics+in+the+immune+system%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A decade of imaging cellular motility and interaction dynamics in the immune system.</a> Science. 336 (6089), 1676-1681 (2012).</li>
<li>Joyce, J. A., Fearon, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cell+exclusion%2C+immune+privilege%2C+and+the+tumor+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">T cell exclusion, immune privilege, and the tumor microenvironment.</a> Science. 348 (6230), 74-80 (2015).</li>
<li>Gerlach, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Slice+cultures+from+head+and+neck+squamous+cell+carcinoma%3A+a+novel+test+system+for+drug+susceptibility+and+mechanisms+of+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Cancer%22%5BJournal%5D)">Slice cultures from head and neck squamous cell carcinoma: a novel test system for drug susceptibility and mechanisms of resistance.</a> Br J Cancer. 110 (2), 479-488 (2014).</li>
<li>Holliday, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+practicalities+of+using+tissue+slices+as+preclinical+organotypic+breast+cancer+models%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Pathol%22%5BJournal%5D)">The practicalities of using tissue slices as preclinical organotypic breast cancer models.</a> J Clin Pathol. 66 (3), 253-255 (2013).</li>
</ol>

无利益冲突声明。

本文介绍了一种简单、快速且可靠的制备人肺癌组织切片的方法，并利用共聚焦显微镜在保持肿瘤微环境完整性的基础上，评估其中驻留的CD8 T细胞的动态行为。本实验方案是对先前JoVE文章中所述方法的优化改进，原方法用于监测T细胞在小鼠淋巴结切片上的培养行为2。
必须考虑荧光染料的光漂白问题，尤其是异硫氰酸荧光素和藻红蛋白等第一代染料。我们发现，在双光子显微镜下，直接偶联抗体发生了明显的光漂白现象。相反，在共聚焦显微镜下观察到的光漂白程度极低，特别是使用近年来开发的高亮度荧光染料时更为显著。
抗体是相对较大的分子，因此其渗透到组织内部可能较为困难。延长孵育时间可改善这一过程。此外，使用较小的染色试剂，例如直接偶联的抗体Fab片段，也是一种有效的替代方案。
本方案中描述的所有抗体均已通过先前验证，已知可产生明亮的染色信号4。因此，无需使用同型对照。然而，如果希望对该方法进行修改并使用其他抗体，则强烈建议使用同型对照抗体。
该实验系统存在一些局限性。切割过程会损伤组织，可能影响CD8 T细胞的行为，尤其是在切面附近。此外，许多在调控T细胞迁移中起关键作用的可溶性因子（例如趋化因子）可能会丢失。克服这些问题的一种方法是监测位于组织较健康区域、距表面数十微米深处的T细胞。已发表的实验表明，位于组织深部的T细胞比靠近切面的T细胞具有更活跃的迁移能力4。我们的研究使用了共聚焦显微镜，但双光子显微镜有望提高深层成像的空间分辨率。
该方法依赖于使用带有荧光标记的抗体，而这些抗体并非中性分子。完整的抗体可能通过多种方式影响T细胞的正常功能。首先，抗CD8抗体可通过触发能够影响淋巴细胞细胞骨架的胞内信号级联反应，从而改变T细胞的迁移行为。其次，抗CD8抗体可调节CD8与MHC I类分子之间的相互作用，而这一过程在抗原识别中至关重要。第三，完整的抗体可与肿瘤内广泛分布的多种髓系细胞表面表达的Fc受体结合，因而可能导致非特异性信号增强。目前我们没有证据表明此类问题影响了我们的实验数据，这可能是因为组织驻留髓系细胞的Fc受体与体外培养细胞不同，已处于被肿瘤微环境中存在的免疫球蛋白饱和的状态。事实上，在标记过程中添加血清（已知可封闭游离Fc受体的操作）并未改变免疫染色结果。尽管如此，不含Fc区的抗体Fab片段、Fc区发生突变的抗体，以及来源于骆驼科动物的抗体片段8，均为利用荧光示踪剂追踪组织驻留细胞的其他可选策略。
在过去的几十年中，已开发并使用了多种模型系统用于T淋巴细胞的实时成像。这些系统包括 体外 先前经抗原提呈细胞纯化并共培养的T细胞制备物，已为阐明抗原识别及应答机制带来了显著进展。然而，这类制备物缺乏组织微环境的复杂性。为更贴近天然组织结构，已建立其他制备方法，例如将纯化的T细胞包埋于三维胶原凝胶基质中，或对重组聚集的组织碎片进行培养，结合荧光成像技术用于监测T淋巴细胞的动态行为。9这些系统具有接近天然组织的结构优势，但缺乏其他重要的细胞和可溶性因子。在小鼠中，双光子活体显微技术已被用于在完整器官的真实生理环境中追踪T细胞10然而，该方法在技术上难以建立。此外，小鼠模型与人类生理学存在显著差异。
本方案中描述的技术代表了一种复杂的多细胞肿瘤环境，在共培养研究与动物模型之间发挥着重要的桥梁作用。
本文所述方案也可用于追踪已制备抗体的其他细胞（而非仅限于CD8 T淋巴细胞）的运动性。此外，该技术可适用于其他人类及小鼠肿瘤和组织。例如，我们已能够在新鲜的人类扁桃体中实时成像用抗CD19抗体标记的B细胞的动力学行为。
本方案中描述的技术可用于筛选调控T细胞在组织中迁移能力的治疗分子。该培养系统具有良好的可及性，便于施加某些药理学试剂，并检测其对T细胞迁移的影响。目前公认，在不断生长的肿瘤中，CD8 T细胞表现出迁移能力低下，并且与肿瘤细胞的接触减少11。重要的是，T细胞在肿瘤细胞区域中数量稀少与不良预后相关，被认为是T细胞介导的癌症免疫治疗产生耐药性的机制之一。已有多种阻碍T细胞在肿瘤内迁移的因素被识别出来，其中包括致密的细胞外基质。因此，鉴定能够恢复T细胞运动能力及其与恶性细胞相互作用的分子，是癌症免疫治疗中的重要一步。在之前的一项研究中，我们发现，在人肺组织切片中急性施加胶原酶对胶原蛋白进行部分降解，可改善T细胞与肿瘤细胞之间的接触。
最后，将人类肿瘤组织切片在体外培养中维持数天的可能性7,12,13，为T细胞及免疫治疗研究提供了诸多有前景的应用。然而，该模型系统在长期培养过程中的稳定性是一个需要全面评估的重要参数。
获取新鲜且健康的组织是制备高质量切片并实现CD8细胞、肿瘤细胞及间质成分良好免疫染色的关键因素。在处理前将肿瘤活检样本保持在4 °C至关重要。
使用精细镊子处理切片是本方案中的另一个关键步骤。操作时需格外小心，因为琼脂糖容易受损。一旦琼脂糖被划伤，将破坏不锈钢垫圈所形成的密封，导致含抗体溶液泄漏。

CD8 T细胞在对抗癌症的过程中发挥着关键作用。然而，多种抑制性机制会阻碍T淋巴细胞杀伤恶性细胞。近年来，已开发出多种可解除T细胞抑制的有前景策略，并已在临床中得到应用5目前仍受到广泛关注的两种方法是靶向免疫检查点的抗体（如抗PD-1抗体）和过继性T细胞治疗。然而，尽管近期取得了一些成功，仅有部分患者能从这些疗法中获益。6一个主要挑战是确定癌症免疫治疗耐药性的机制，以开发更有效的治疗方法。另一个挑战是建立可用于表征和测试新疗法效力与安全性的模型系统。迄今为止，大多数此类检测均基于 体外 不能很好模拟肿瘤组织复杂性的细胞培养系统。
ex vivo 组织切片是一种前景广阔的技术，因为它能够保留原始组织的微环境7。多年来，我们已建立该方法，用于追踪T淋巴细胞在不同组织中的动态行为。我们的结果表明，添加到小鼠淋巴结切片表面的荧光标记T细胞能够迁移进入组织，并对相应的微环境信号作出响应1,2。类似地，覆盖在人肺癌组织切片上的T淋巴细胞可被迅速招募至肿瘤间质中3。利用该技术，我们已鉴定出细胞外基质是调控T细胞在人肿瘤内分布与迁移的重要因素3,4。由于ex vivo 分离并接种的T细胞的行为未必能反映肿瘤内驻留T淋巴细胞的真实行为，我们近期对该方法进行了优化4。
本文介绍了一种用于追踪新鲜人肺癌组织切片中驻留性T淋巴细胞的实验方案。该方案包括以下步骤：人肺癌组织切片的制备（含琼脂糖包埋及振动切片机对包埋组织进行切片）、利用荧光抗体对新鲜肿瘤切片中的内源性T细胞进行染色，以及通过共聚焦显微镜对这些细胞进行监测。

<table><tbody><tr><td>直立式共聚焦显微镜</td><td>Leica</td><td></td><td>推荐使用转盘式共聚焦显微镜</td></tr><tr><td>Imaris 软件</td><td>Bitplane</td><td></td><td>该软件用于图像可视化及T细胞迁移轨迹追踪</td></tr><tr><td>振动切片机</td><td>Leica</td><td>VT1200S</td><td></td></tr><tr><td>精细镊子</td><td>World Precision Instruments</td><td>14142</td><td></td></tr><tr><td>30 mm 培养插件</td><td>Millipore</td><td>PICM0RG50</td><td></td></tr><tr><td>罗斯威尔公园纪念研究所（RPMI）培养基，含GlutaMAX补充剂</td><td>ThermoFisher</td><td>61870010</td><td>完全RPMI培养基的配制方法为添加10%热灭活胎牛血清及青霉素/链霉素</td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液（PBS）</td><td>ThermoFisher</td><td>20012019</td><td></td></tr><tr><td>Hanks&amp;rsquo;平衡盐溶液（HBSS）</td><td>Invitrogen</td><td>14170088</td><td></td></tr><tr><td>低凝胶温度琼脂糖，VII-A型</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A0701</td><td></td></tr><tr><td>无毒丁基氰基丙烯酸酯胶，Vetbond</td><td>3M</td><td>1469</td><td></td></tr><tr><td>切片固定锚，直径19.7，螺纹间距2 mm</td><td>Warner Instruments</td><td>64-1415</td><td></td></tr><tr><td>不锈钢垫圈，内径5 mm</td><td>Amazon</td><td>B004K1FDGQ</td><td></td></tr><tr><td>BV605标记的抗CD8抗体（克隆SK1）</td><td>BD Biosciences</td><td>565289</td><td></td></tr><tr><td>FITC标记的抗EpCAM抗体（克隆HEA-125）</td><td>Miltenyi Biotex</td><td>130-098-113</td><td></td></tr><tr><td>BV510标记的抗CD90抗体（克隆5E10）</td><td>Biolegend</td><td>328125</td><td></td></tr><tr><td>4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）</td><td>ThermoFisher</td><td>D1306</td><td></td></tr></tbody></table>

体外 利用共聚焦显微镜成像人肺癌组织切片中的驻留性cd8 t淋巴细胞

Ex Vivo Imaging of Resident CD8 T Lymphocytes in Human Lung Tumor Slices Using Confocal Microscopy

CD8 T细胞在抗肿瘤免疫反应中发挥关键作用。为了杀伤肿瘤细胞，CD8 T细胞必须进入肿瘤组织，在肿瘤微环境中迁移，并对肿瘤抗原产生适当的应答。近年来，随着成像技术的进步（如双光子显微镜）以及高效小鼠肿瘤模型的应用，研究人员已揭示了调控抗肿瘤T细胞活性的部分机制。尽管这些系统提供了宝贵的见解，但其结果并不总能预测人体内的实际反应。在人类研究中，该领域的知识主要来源于对患者固定肿瘤样本的描述，以及 体外 研究。然而， 体外 模型缺乏复杂的三维肿瘤微环境，因此对肿瘤的模拟并不完整 体内 T细胞活性。从移植组织制备的新鲜切片代表了一种复杂的多细胞肿瘤微环境，可在共培养研究与动物模型之间发挥重要的桥梁作用。该模型最初建立于小鼠淋巴结1 此前已在 JoVE 文章中描述过2，该方法现已应用于人类肿瘤，以研究贴壁培养中两者的动态变化3&#160;以及常驻的&#160;T细胞4.
本文描述了一种制备人肺肿瘤组织切片、对组织驻留的CD8 T细胞和肿瘤细胞进行免疫染色，并利用共聚焦显微镜追踪肿瘤微环境中CD8 T淋巴细胞的实验方案。该系统可独特地用于筛选促进T细胞在肿瘤内迁移的新型免疫治疗药物。

人类肺癌组织通常有大量CD8 T细胞浸润，且这些细胞优先分布于间质中3,4。按照本实验方案操作，应可在人类肺癌组织切片中观察到大量经免疫染色标记的CD8 T细胞。通过使用抗-EpCAM和抗-CD90抗体进行共标记，可清晰区分肿瘤小叶和间质区域。富含于肿瘤间质中的纤维状胶原无需外源性染色，即可利用双光子显微镜的二次谐波信号进行观察3,4。需注意，部分人类肺癌组织中肿瘤小叶与间质之间无明显界限，此类样本以及因抗体非特异性结合和DAPI染色所显示的大范围细胞坏死区域的样本均应予以剔除。与已发表的人类肺癌和卵巢癌研究结果一致，定居的CD8 T细胞在间质中的密度高于肿瘤小叶4。CD8 T细胞相对于肿瘤细胞和CD90分布的一个代表性示例如图2所示。
切片实验可用于分析不同肿瘤区域中驻留性T细胞的运动能力。比较不同区域CD8 T细胞运动能力的有用标准包括平均速度（路径长度除以采样时间）和位移长度（轨迹起点与终点之间的矢量距离）。尽管在肿瘤小叶中数量稀少，CD8 T细胞在此区域的迁移活性仍高于间质区域（图3）。通常情况下，单个CD8 T细胞在肿瘤间质中的平均速度应接近4 µm/min，但存在较高的瘤内和瘤间变异性4。在肿瘤间质中，驻留性T细胞的运动能力受到细胞外基质纤维密度和取向的显著影响3,4。成功的实验结果应显示，在基质致密区域的T细胞数量少于基质疏松区域，这与已发表的研究结果一致3,4。
请注意，某些人类肺癌组织表现出极强的自发荧光，从而妨碍对组织驻留T细胞的成像。该特征在成像过程开始时即可迅速观察到。具有自发荧光的肿瘤应予以弃用。图4展示了在自发荧光肿瘤中组织驻留CD8 T细胞的一个代表性示例。
<img alt="带有RPMI培养基、蠕动泵和显微镜分析装置的细胞培养灌流系统。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55709/55709fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图1"> 
图1：灌流系统的照片。 A) 酚红-free RPMI溶液经5% CO2、95% O2气体饱和。B) 溶液由蠕动泵进行灌流。C) RPMI溶液通过入口进入培养皿，在出口处，泵将溶液从培养腔抽吸至废液容器中。注意抽吸管尖端的位置应设定为可控制液面高度。 <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55709/55709fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="显示组织样本中CD8、EpCAM、Thy1表达的免疫荧光显微镜图像，比例尺为100 µm。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55709/55709fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图2"> 
图2：人肺癌组织中驻留CD8 T细胞的分布。 人肺癌切片的代表性图像，经CD8（绿色）、EpCAM（蓝色）和CD90（红色）染色。 <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55709/55709fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="免疫荧光显微镜图像，CD8，EpCAM，SHG，细胞分析，荧光强度分布。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55709/55709fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图3"> 
图3：人肺肿瘤中驻留型CD8 T细胞的运动性。 在人肺腺癌组织切片的间质区（红色）和肿瘤细胞区（蓝色）内，单个驻留型CD8 T细胞的运动轨迹。该组织切片经指定抗体染色后，使用共聚焦显微镜连续成像20分钟。纤维状胶原在实验末期通过双光子显微镜的二次谐波生成（SHG）技术进行检测。轨迹根据CD8 T细胞的位移长度进行颜色编码。本图像改编自4。<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55709/55709fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="多色显微镜图像显示 CD8、EpCAM、SHG；组织免疫荧光，细胞相互作用。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55709/55709fig4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 4"> 
图 4：自体荧光人肺癌肿瘤的代表性图像。 肿瘤切片经 CD8（绿色）和 EpCAM（蓝色）染色。SHG 信号以红色显示。<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55709/55709fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

本方案描述了一种对人肺肿瘤组织切片中经荧光标记抗体标记的驻留性肿瘤浸润CD8 T细胞进行成像的方法。该技术可利用共聚焦显微镜对CD8 T细胞的迁移进行实时分析。

体外 利用共聚焦显微镜成像人肺癌组织切片中的驻留性CD8 T淋巴细胞

CD8 T细胞在抗肿瘤免疫中发挥关键作用。为了杀伤肿瘤细胞，CD8 T细胞需要进入肿瘤组织，并在肿瘤微环境中迁移……

本实验的总体目标是利用共聚焦显微镜对经荧光标记抗体标记的人肺肿瘤切片中驻留的肿瘤浸润性CD8 T细胞进行成像。该方法有助于回答肿瘤免疫学中的关键问题，例如调控T细胞在人肿瘤内迁移的正负性因素的性质。该技术的主要优势在于，能够在保持人肿瘤微环境完整性的前提下，持续监测驻留CD8 T细胞的每日行为。我们最初在建立用于追踪T细胞并将其种植到切片上的小鼠淋巴结方法时萌生了这一想法，该方案最初于2011年在JoVE上发表。首先，在容器中加入1克低熔点琼脂糖，然后加入20毫升无钙无镁的无菌PBS。将溶液放入微波炉中加热，直至琼脂糖完全溶解。将此5%琼脂糖溶液在37摄氏度的培养箱中冷却5分钟。在组织培养超净台中，向六孔亚培养板的每个孔中加入1.1毫升完全RPMI-1640培养基。然后，使用无菌镊子将无菌的30毫米细胞培养小室放入每个孔中。将培养板在37摄氏度孵育30分钟，以备后续使用。接下来，将肿瘤活检组织置于一个10厘米的塑料培养皿中，使用锋利且无菌的刀片将肿瘤切割成大约5×5毫米的立方体小块。现在，从孵育箱中取出已准备好的琼脂糖溶液。使用无菌镊子将肿瘤组织碎片小心转移至拭纸上，以去除多余的培养基，然后将琼脂糖倒入35毫米的塑料培养皿中，并将肿瘤组织碎片插入其中，使其位于塑料培养皿底部。将琼脂糖凝胶置于冰上5分钟，使其凝固。待琼脂糖完全凝固后，将塑料培养皿倒置。 使用解剖刀将整块凝胶取出。用锋利的刀片修去肿瘤碎片周围多余的琼脂糖，保留组织周围3至5毫米的凝胶。取一滴无毒组织胶，将琼脂糖块固定在振动切片机的样品盘上。用无菌的冰上预冷 PBS 填充振动切片机的缓冲液槽，并将含有琼脂糖块的样品盘安装到槽中。将振动切片机的切片速度和振动频率调节至所需数值。待振动切片机准备就绪后，从培养箱中取出六孔板。现在开始使用振动切片机将包埋好的组织块切成350微米厚的切片。用精细镊子小心收集切割过程中产生的肿瘤切片，并将其平整地放置在六孔板中的细胞培养插件上。每个插件上放置一片切片。接下来，使用精细镊子将预先灭菌并预先润湿的不锈钢垫圈放置在每个切片上。确保垫圈准确置于肿瘤组织周围的琼脂糖上。在进行免疫染色前，将培养板置于加湿的、含5%二氧化碳的培养箱中，37摄氏度孵育10分钟。将所需荧光标记的抗体和荧光核染料 DAPI 用不含酚红的 RPMI 培养基稀释至所需的工作浓度。接着，从培养箱中取出培养板，使用细尖吸头吸除不锈钢洗涤器内的液体。然后，在不接触组织切片的前提下，向每份肿瘤切片上各加入 40 µL 稀释后的抗体溶液。为便于染色，将培养板在37摄氏度下孵育15分钟。染色步骤完成后，使用精细镊子移除洗涤垫。然后，轻轻取出切片，并将其浸入不含酚红的RMPI-1640培养基中10秒钟。将切片放回细胞培养插件上，并在每个切片上滴加一滴不含酚红的RMPI-1640培养基。将培养板置于37摄氏度孵育10分钟，随后进行成像。在开始实验前数小时，将显微镜加热腔的温度设定为37摄氏度，然后设置显微镜系统，通过蠕动泵持续向肿瘤切片灌注含氧的不含酚红的RMPI培养基，并将溶质抽吸至废液收集瓶中。借助精细镊子将染色的切片从六孔板中取出，转移至盛有不含酚红的RMPI培养基的35毫米塑料培养皿中，然后将切片固定器置于切片上方以支撑切片。接着，将该培养皿放置于显微镜的成像载物台上。连接灌流系统的进液端和出液端后，启动蠕动泵，使含氧培养基流经灌流管路。将浸水物镜降至切片位置，使用明场光或适当的波长对准切片表面进行聚焦。然后，使用合适的滤光片观察并选择一个包含所有荧光标记的目标细胞的感兴趣区域，即 CD8 T 细胞、肿瘤小孔以及 CD90 阳性基质细胞。根据所观察到的荧光信号亮度，设置合适的激光强度和曝光时间，建立成像程序。然后设置Z轴层厚以对肿瘤切片内进行成像。接着选择Z轴层扫描的时间间隔和总记录时间，以在特定时间间隔内捕获图像。在采集并导出荧光图像后，按照文本方案中所述分析CD8 T细胞迁移。图中显示的是染色的人肺肿瘤切片的代表性图像。请注意绿色 CD8 阳性 T 细胞、蓝色上皮细胞黏附分子染色的肿瘤细胞以及红色 CD90 或 Thy1 阳性基质细胞的分布情况。特别需要注意的是，与肿瘤细胞巢相比，CD8 T 细胞在基质中更为丰富。此处显示的是经绿色标记的驻留型CD8 T细胞的运动轨迹，以及人肺癌组织切片中红色的间质区和蓝色的肿瘤细胞区。通过二次谐波生成技术检测到的胶原呈红色，用于标识间质区。尽管CD8 T细胞在肿瘤区域的数量少于间质区，但其在肿瘤区的迁移活性高于间质区。一旦掌握，该技术若操作得当，通常可在四到五小时内完成。通过本视频，您将充分了解如何对免疫染色的肿瘤样本进行处理，以便利用共聚焦显微镜监测组织驻留的 CD8 T 细胞。

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科研

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Cancer Research

癌症研究

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体外利用共聚焦显微镜成像人肺癌组织切片中的驻留性CD8 T淋巴细胞

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