Name: 诱导生活青蛙和斑马鱼胚胎缺氧 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 1 s
Description: 学习使用新型缺氧培养箱系统对非洲爪蟾和斑马鱼胚胎进行缺氧诱导，该方法简单、经济且稳定，可维持长达48小时。该技术为发育生物学和细胞生物学研究提供了可靠的体内缺氧模型。

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本工作获得了惠康信托会所颁发的SIA奖100329/Z/12/Z（授予W.A.H.）以及德国研究基金会授予H.K.的DFG奖学金KH 376/1-1的支持。

本方案遵循剑桥大学的动物护理指南。
1. 动物饲养
<ol>
	<li>青蛙胚胎 
	注意：胚胎的培养和维持可根据动物种类和实验室条件进行。此处描述了一种动物维持的示例。
	<ol>
		<li>制备0.1×改良巴特氏溶液（MBS）：0.88 mM NaCl、10 µM KCl、24 µM NaHCO₃3，100 µM HEPES，8.2 µM MgSO₄4，3.3 µM Ca(NO3)2，以及 4.1 µM CaCl2pH&#160;7.6.</li>
		<li>获取 非洲爪蟾 胚胎通过 体外 受精
		<ol>
			<li>诱导成年雌性非洲爪蟾（Xenopus laevis）排卵非洲爪蟾（Xenopus laevis） 在产卵前一周（60 IU）和12小时（500 IU）分别注射孕马血清促性腺激素。</li>
			<li>收集卵母细胞并进行受精 体外 与均质化的雄性睾丸组织。</li>
			<li>在0.1x MBS中于16 - 18 °C培养胚胎。根据正常胚胎发育表对胚胎进行分期。 非洲爪蟾14选择用于实验的胚胎时，应确保其完整且存活。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>斑马鱼胚胎 
	注意：胚胎的培养和维持可根据动物种类和实验室条件进行。此处描述了一种动物维持的示例。
	<ol>
		<li>制备胚胎培养基：5 mM NaCl、0.17 mM KCl、0.33 mM CaCl₂、0.33 mM MgCl₂、0.2 mM MgSO₄、0.1 mM NaHCO₃、5 mM HEPES、100 U/mL 青霉素、100 μg/mL 链霉素，用 ddH₂O 配制，pH 调至 7.42，0.33 mM MgSO₄4，以及0.00001%的亚甲蓝。</li>
		<li>维持和繁殖野生型小鼠&#160;AB品系 斑马鱼 在26.5 °C下。</li>
		<li>在受精当天早晨收集胚胎，在28 °C条件下使用上述方法制备的胚胎培养基中培养至受精后4天（dpf），按前述方法进行筛选和分期15.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 体内缺氧诱导 In Vivo
<ol>
	<li>气体孵育室的构建
	<ol>
		<li>使用繁殖用的水生饲养箱（图1A）通常用于鱼类饲养设施中构建低氧培养箱。该容器应能容纳一个24孔板。</li>
		<li>制备一个带网底的24孔板，如图所示 图1. 移除24孔板的塑料底部图1B), 例如，为此目的使用铣床。</li>
		<li>用环氧树脂填充小室塑料部分与培养板壁之间的空隙。连接任意尼龙滤膜（图1C) 将孔径为0.1–0.2 mm的网状材料置于树脂涂层塑料上，并使平板完全干燥。</li>
		<li>干燥后，钻出三到四个隧道（图1D）长度为10 mm、直径为5 mm的树脂和网状涂层板壁中。安装塑料或聚四氟乙烯（Teflon）棒（图1E) 选择合适直径且长度为30 mm的管子连接至通道，并将培养板放入选定的水箱中。</li>
		<li>将带网底的24孔板放入选定的水族箱中。使用硅胶管（图1F），连接一个气体罐（图1G) 与所需的 O2/无可用源文本/2 混合气体或另一种选定的气体混合物通入分配阀（图1H）使用合适的气体调节器（I）（BOC 200 bar）。此处使用含有5%氧气和95%氮气混合气体的气瓶2 在本研究的缺氧实验中。</li>
		<li>调节腔室培养基中的氧气流速至0.0017–0.0019立方米每秒。在此气体流速下，培养板各孔中的培养基不应出现扰动。
		<ol>
			<li>为此目的使用高纯度两级气体减压阀。在整个实验过程中，将减压阀调节至将气体钢瓶内压（1000 - 2500 PSI）降至10 PSI的输出压力。根据该气体减压阀的技术规格，实验全程实现了0.00189立方米/秒的流速。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>将硅胶管和分配阀连接至陶瓷盘式扩散器（图1J) 内的水生饲养箱中。关闭水生饲养箱并小心密封盖子，用硅脂涂抹盖口图1K）（与……比较） 图1）。若需要特定的非室温条件，将缺氧舱置于所需温度的实验室培养箱中。</li>
		<li>根据实验所用胚胎的类型，向低氧培养箱中加入相应的胚胎培养基，并开始通过陶瓷盘扩散器通入混合气体。平衡10–15分钟。</li>
		<li>在与目标氧气混合物平衡后，使用测氧仪或氧气探头测量水中的氧浓度。此处使用配备光纤溶解氧和温度传感器的测氧仪进行测量。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>胚胎缺氧诱导
	<ol>
		<li>仔细挑选用于实验的胚胎，选择完整且存活的胚胎用于缺氧培养。此处使用发育至38期的青蛙胚胎或4天龄的斑马鱼胚胎。&#160;在本研究所展示的实验中。</li>
		<li>将胚胎培养皿放入培养箱中（图1K) 含有气体孵育室，并让其与培养箱温度平衡。</li>
		<li>小心地将胚胎转移至带网格的24孔板的孔中（图1B使用塑料移液管将气体培养箱中的胚胎转移。在整个实验方案中，始终使用塑料移液管进行胚胎转移。 
		注意：该孔板的每个孔最多可容纳5只38期的青蛙胚胎或7只4天龄的斑马鱼胚胎。若使用不同基因型，需仔细标记各孔。</li>
		<li>在选定的气体混合物持续灌注条件下，将气体孵育室维持5小时或根据实验需求更长时间。使用含5% O₂的混合气体2 和 95% N2 此处。</li>
		<li>将胚胎从气体培养箱中小心转移回与胚胎类型相对应的常氧培养基中，并立即进行步骤3或步骤4。</li>
		<li>如果需要进一步的常氧处理，小心地将胚胎转移回对应胚胎类型的常氧培养基中。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 通过监测 HIF-1α 水平控制缺氧诱导的成功
<ol>
	<li>准备工作
	<ol>
		<li>在0.1x MBS中配制0.4 mg/mL的MS222溶液。</li>
		<li>配制匀浆缓冲液：购买放射免疫沉淀分析缓冲液（RIPA缓冲液）用于组织匀浆，并按实验所需体积加入蛋白酶抑制剂，使其终浓度为1:100（v/v）。</li>
		<li>准备 Western blot 溶液。
		<ol>
			<li>配制4×Laemmli凝胶上样缓冲液：425 mM Tris（pH 8.0），40% v/v 甘油，8% v/v SDS，4% v/v β-巯基乙醇，0.5% w/v 溴酚蓝，总体积10 mL ddH₂O2O.</li>
			<li>配制5倍电泳缓冲液：15 g Trizma碱，72 g甘氨酸，5 g SDS，加ddH₂O至终体积1 L2O.</li>
			<li>制备转移缓冲液：2.66 g Trizma碱，14.4 g 甘氨酸，200 mL 100%甲醇，加ddH₂O至总体积1 L2O.</li>
			<li>配制10倍浓缩液&#160;TBST：5 mL 1 M Tris（pH 8.0），30 mL 5 M NaCl，2.5 mL Tween 20，加水定容至1 L2O.</li>
			<li>配制封闭液：将4%（w/v）脱脂奶粉溶于1×TBST中。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>组织采集
	<ol>
		<li>将胚胎浸入0.4 mg/mL MS222溶液中以进行麻醉16,17 使用塑料移液器将胚胎转移至装有匀浆缓冲液的塑料反应管中。每个胚胎使用20 µL缓冲液。注意：为检测HIF1α蛋白水平的显著变化，至少需要5只38期的青蛙胚胎或7只4天龄的斑马鱼胚胎。</li>
		<li>使用适当的组织匀浆器或超声波破碎仪对组织进行匀浆。通过离心去除碎片（15 分钟；13,000 × g；4 °C）。
		<ol>
			<li>或者，从麻醉后的蛙胚胎中解剖出视网膜17 并按上述方法匀浆，每10对视网膜使用20 µL匀浆缓冲液。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>用移液器吸取上清液，85 °C 变性 5 分钟，加入 Laemmli 上样缓冲液至终浓度为 1x v/v（例如，向15 µL匀浆液中加入5 µL 4x Laemmli缓冲液。将此上清液用于Western blot检测，或于-20 °C冻存样品。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>蛋白质印迹法
	<ol>
		<li>将按照步骤3.2所述制备的样品加入预制的12%凝胶中，使用1x v/v电泳缓冲液在电泳系统中进行电泳。使用蛋白质ladder确定蛋白质大小。根据制造商说明书，将蛋白质在转移缓冲液中于4 °C冰浴条件下转移至硝酸纤维素膜（0.45 µm膜）上，转移时间为1 h。</li>
		<li>用封闭缓冲液孵育膜60分钟以封闭非特异性结合位点，随后用1×TBST洗涤3次，每次10分钟。</li>
		<li>将膜置于封闭液中，分别加入体积比为1:100的兔抗HIF-1α抗体和体积比为1:5000的鼠抗α-tubulin抗体溶液，孵育2.5小时&#160;室温下用1×TBST洗涤3次，每次10分钟。</li>
		<li>孵育1小时，一抗为辣根过氧化物酶（HRP）标记的山羊抗兔和山羊抗小鼠抗体，用封闭液按1:1000（v/v）稀释。随后用1×TBST缓冲液洗涤3次，每次10分钟，使用商用检测试剂盒及所选显影仪显色检测HRP信号。</li>
		<li>使用数字量化法测定HIF1α蛋白的含量。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 缺氧条件下细胞增殖的监测
<ol>
	<li>准备工作
	<ol>
		<li>在选定的胚胎培养基中配制5 mM EdU溶液。该溶液可立即使用，或分装后于-20 °C保存最多6个月。</li>
		<li>配制磷酸盐缓冲盐水（PBS），或从商业渠道购买PBS。在115 °C下高压灭菌10分钟。</li>
		<li>配制用于检测EdU掺入的溶液。
		<ol>
			<li>配制固定液：将16%甲醛储备液按4% v/v比例加入PBS中。</li>
			<li>配制蔗糖溶液：将蔗糖按30% w/v比例溶于PBS中。</li>
			<li>配制PBST：将Triton X-100按0.1% v/v比例加入PBS中。</li>
			<li>配制封闭液：将热灭活山羊血清（HIGS）按10% v/v比例加入PBST中。</li>
			<li>配制DAPI溶液：将4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）按1:1000 v/v比例加入PBST中。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>胚胎在低氧条件下孵育以实现EdU掺入
	<ol>
		<li>向气体孵育室中加入400–500 mL含1% v/v DMSO的5 mM EdU溶液。实验前15分钟，用实验所用的相同气体混合物对溶液进行预平衡。注意：可通过在网底板上安装较短的支撑杆（图1E）来减少孵育液的体积。</li>
		<li>将气体管路连接至含有5% O2和95% N2混合气体的气瓶。孵育溶液15分钟。</li>
		<li>将胚胎转移至低氧室，均匀分布于各孔中，并孵育2小时。每孔最多可容纳5个阶段为38的蛙胚胎，或7个4天龄的斑马鱼胚胎。</li>
		<li>分析胚胎中的EdU掺入情况。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>胚胎在低氧条件下孵育的时间进程及EdU掺入
	<ol>
		<li>向气体孵育室中加入500 mL选定的胚胎培养基。将气体管路连接至含有5% O2和95% N2混合气体的气瓶，并用该气体混合物平衡培养基15分钟。</li>
		<li>将胚胎转移至低氧室，均匀分布于各孔中，孵育所需时间（最长可达48小时）。在最后1小时，将胚胎培养基替换为含1% v/v DMSO的5 mM EdU溶液。</li>
		<li>将胚胎转移回常氧培养皿中，并分析EdU掺入情况。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>EdU掺入的检测与分析
	<ol>
		<li>将胚胎浸入0.4 mg/mL MS222溶液中进行麻醉。</li>
		<li>将胚胎转移至适当的玻璃小瓶中，并在室温下用固定液固定2小时，或在4 °C过夜。随后用PBS洗涤3次，每次10分钟。小心地将胚胎转移至蔗糖溶液中以进行组织冷冻保护。孵育4小时，或直至胚胎沉入玻璃小瓶底部。</li>
		<li>将胚胎包埋于包埋介质（最佳切割温度化合物）中。立即进行冷冻切片，或于-80 °C保存最多14天&#160;。</li>
		<li>使用冷冻切片机对含有胚胎的组织块进行切片。将厚度为12 µm（斑马鱼胚胎）或16 µm（蛙胚胎）的切片收集到载玻片上，并使其干燥。可立即处理冷冻切片，或于-20 °C保存最多3个月。</li>
		<li>使用商业化的化学试剂盒通过免疫荧光染色检测EdU掺入。根据制造商说明，配制实验所需数量的EdU反应混合液。
		<ol>
			<li>对于500 µL EdU反应混合液，使用430 µL 1X EdU反应缓冲液、20 µL CuSO4、1.2 µL Alexa Fluor叠氮化物和50 µL 1X EdU缓冲液添加剂。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>用PBS洗涤切片一次以去除包埋介质，再用PBST洗涤3次，每次5分钟，以通透组织。将切片在封闭液中孵育30分钟。</li>
		<li>将切片与EdU反应混合液在室温下孵育1小时，随后用PBST洗涤3次，每次10分钟。再用DAPI溶液共染15分钟，接着用PBST洗涤3次，每次10分钟。将染色后的切片用封片剂封片，加盖盖玻片，干燥后在荧光显微镜下观察，或于4 °C保存最多1年。</li>
		<li>使用倒置共聚焦扫描显微镜观察抗EdU染色的冷冻切片，并通过数字定量方法确定EdU阳性细胞的数量。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Grocott, M., Montgomery, H., Vercueil, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-altitude+physiology+and+pathophysiology%3A+implications+and+relevance+for+intensive+care+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Crit+Care%22%5BJournal%5D)">High-altitude physiology and pathophysiology: implications and relevance for intensive care medicine.</a> Crit Care. 11 (1), 203(2007).</li>
<li>Grant, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sea+level+and+acute+responses+to+hypoxia%3A+do+they+predict+physiological+responses+and+acute+mountain+sickness+at+altitude%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Brit+J+Sport+Med%22%5BJournal%5D)">Sea level and acute responses to hypoxia: do they predict physiological responses and acute mountain sickness at altitude?</a> Brit J Sport Med. 36 (2), 141-146 (2002).</li>
<li>Kajimura, S., Aida, K., Duan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insulin-like+growth+factor-binding+protein-1+%28IGFBP-1%29+mediates+hypoxia-induced+embryonic+growth+and+developmental+retardation%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Insulin-like growth factor-binding protein-1 (IGFBP-1) mediates hypoxia-induced embryonic growth and developmental retardation.</a> PNAS. 102 (4), 1240-1245 (2005).</li>
<li>Ong, K. K., Dunger, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perinatal+growth+failure%3A+the+road+to+obesity%2C+insulin+resistance+and+cardiovascular+disease+in+adults%5BTitle%5D)+AND+%22Best+Pact+Res+Clin+Endocrinol+Metab%22%5BJournal%5D)">Perinatal growth failure: the road to obesity, insulin resistance and cardiovascular disease in adults.</a> Best Pact Res Clin Endocrinol Metab. 16, 191-207 (2002).</li>
<li>Maxwell, P., Salnikow, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIF-1%3A+an+oxygen+and+metal+responsive+transcription+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Bio+Ther%22%5BJournal%5D)">HIF-1: an oxygen and metal responsive transcription factor.</a> Cancer Bio Ther. 3 (1), 29-35 (2004).</li>
<li>Semenza, G. L., Roth, P. H., Fang, H. M., Wang, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+regulation+of+genes+encoding+glycolytic+enzymes+by+hypoxia-inducible+factor+1%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Transcriptional regulation of genes encoding glycolytic enzymes by hypoxia-inducible factor 1.</a> J Biol Chem. 269 (38), 23757-23763 (1994).</li>
<li>Yuan, Y., Hilliard, G., Ferguson, T., Millhorn, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cobalt+inhibits+the+interaction+between+hypoxia-inducible+factor-alpha+and+von+Hippel-Lindau+protein+by+direct+binding+to+hypoxia-inducible+factor-alpha%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Cobalt inhibits the interaction between hypoxia-inducible factor-alpha and von Hippel-Lindau protein by direct binding to hypoxia-inducible factor-alpha.</a> J Biol Chem. 278 (18), 15911-15916 (2003).</li>
<li>Elks, P., Renshaw, S. A., Meijer, A. H., Walmsley, S. R., van Eeden, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+the+HIFs%2C+buts+and+maybes+of+hypoxia+signalling+in+disease%3A+lessons+from+zebrafish+models%5BTitle%5D)+AND+%22Disease+Models+%26+Mechanisms%22%5BJournal%5D)">Exploring the HIFs, buts and maybes of hypoxia signalling in disease: lessons from zebrafish models.</a> Disease Models & Mechanisms. 8, 1349-1360 (2015).</li>
<li>Guo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia-mimetic+agents+desferrioxamine+and+cobalt+chloride+induce+leukemic+cell+apoptosis+through+different+hypoxia-inducible+factor-1alpha+independent+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Apoptosis%22%5BJournal%5D)">Hypoxia-mimetic agents desferrioxamine and cobalt chloride induce leukemic cell apoptosis through different hypoxia-inducible factor-1alpha independent mechanisms.</a> Apoptosis. 11 (1), 67-77 (2006).</li>
<li>Woods, I. G., Imam, F. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptome+analysis+of+severe+hypoxic+stress+during+development+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Genom+Data%22%5BJournal%5D)">Transcriptome analysis of severe hypoxic stress during development in zebrafish.</a> Genom Data. 6, 83-88 (2015).</li>
<li>Rouhi, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia-induced+metastasis+model+in+embryonic+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Hypoxia-induced metastasis model in embryonic zebrafish.</a> Nat Protoc. 5 (12), 1911-1918 (2010).</li>
<li>Stevenson, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia+disruption+of+vertebrate+CAN+pathfinding+through+EphrinB2+is+rescued+by+magnesium%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Hypoxia disruption of vertebrate CAN pathfinding through EphrinB2 is rescued by magnesium.</a> PLoS Genet. 8 (4), e1002638(2012).</li>
<li>Khaliullina, H., Love, N. K., Harris, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nutrient-Deprived+Retinal+Progenitors+Proliferate+in+Response+to+Hypoxia%3A+Interaction+of+the+HIF-1+and+mTOR+Pathway%5BTitle%5D)+AND+%22J+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Nutrient-Deprived Retinal Progenitors Proliferate in Response to Hypoxia: Interaction of the HIF-1 and mTOR Pathway.</a> J Dev Biol. 4 (2), (2016).</li>
<li>Nieuwkoop, P. D., Faber, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNieuwkoop%2C+PD+%22Normal+Table+of+Xenopus+laevis+%28Daudin%29%22">Normal Table of Xenopus laevis (Daudin)</a>. Nieuwkoop, D. P., Faber, J. , Garland Publishing, Inc. New York and London. (1994).</li>
<li>Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/8589427">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Dev Dyn. 203 (3), 253-310 (1995).</li>
<li>Kohn, D. F., Wixson, S. K., White, W. J., Benson, G. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKohn%2C+DF+%22Anesthesia+and+Analgesia+in+Laboratory+Animals%22">Anesthesia and Analgesia in Laboratory Animals</a>. , (1997).</li>
<li>McDonough, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissection%2C+Culture%2C+and+Analysis+of+Xenopus+laevis+Embryonic+Retinal+Tissue%5BTitle%5D)+AND+%22JoVE%22%5BJournal%5D)">Dissection, Culture, and Analysis of Xenopus laevis Embryonic Retinal Tissue.</a> JoVE. (70), (2012).</li>
</ol>

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

在此，我们介绍了一种简便且稳健的新型缺氧诱导方法，该方法已针对蛙类和斑马鱼胚胎的应用进行了优化，但也适用于其他水生生物。该方法的主要优势在于其操作简单且成本低廉。尽管如此，该方法所获得的结果非常可靠。我们已证明，无论是整体胚胎还是特定组织（此处为视网膜），均可在缺氧室中有效诱导缺氧。为评估缺氧诱导的效果，我们检测了整体胚胎及视网膜裂解液中HIF-1α蛋白的水平。根据我们的结果，若在缺氧室中处理1小时后，HIF-1α水平较常氧对照组升高，并经总蛋白水平归一化后仍可观察到该变化，则可认为缺氧诱导成功。 例如，以α-tubulin水平作为对照。我们通过EdU掺入法检测视网膜中干细胞的增殖情况，验证了组织中缺氧的活性，并证实了与我们先前发表结果一致的现象13，使用本实验方案中所述装置诱导的缺氧会导致青蛙和斑马鱼胚胎中视网膜干细胞增殖减少。
该方案的关键步骤之一是确保缺氧室密封良好。可通过在罐盖上使用适当的密封材料实现，本实验中采用的是硅脂。此外，将缺氧室置于培养箱内，可提供额外的屏障，有助于防止大气中的氧气渗入室内。使用合适...

缺氧研究具有广泛的应用，包括探究以缺氧为特征的医学疾病的发病机制以及开发相应的治疗方法1 急性高原病2缺氧应激会导致所有需氧生物发生显著的代谢改变。缺氧应激还影响胎儿的生长发育以及多种人类疾病的发病机制，包括宫内生长受限3缺氧应激不仅可导致出生体重降低、胎儿及新生儿死亡率升高，还可能引发成年期多种并发症，如心血管疾病、2型糖尿病、肥胖和高血压。4缺氧应激在实体瘤发展过程中也常被观察到，此时肿瘤组织的生长速度超过了其血液供应能力。因此，能够研究缺氧的影响至关重要 体内 并在胚胎发育期间直接进行。
在研究发育过程中缺氧影响的众多方法中，最广为人知的方法包括在生长培养基中使用氯化钴，或将生物体置于低氧培养箱中孵育。氯化钴可在正常氧浓度条件下人工诱导缺氧反应，其机制在于通过阻止缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）的蛋白酶体降解，从而稳定该蛋白5,6,7。然而，尽管该方法操作简便8，使用氯化钴及其他类似的化学性缺氧模拟剂可能对细胞和组织产生非特异性的有害效应，例如，诱导细胞凋亡9。因此，在生物体正常发育过程中，使用低氧培养箱是诱导&#34;生理性缺氧&#34;的更优方法。
我们致力于开发一种用于诱导水生动物胚胎缺氧的系统。目前，青蛙和斑马鱼已成为研究多种生物学过程以及各类人类疾病的有用脊椎动物模型生物。青蛙和斑马鱼的胚胎在体外发育，避免了母体代偿带来的复杂性。此外，其快速的发育过程使得研究人员能够调控环境因素，并实时观察器官形成过程中的表型变化。同时，这些模型生物中主要信号转导通路的许多组分在进化上高度保守，并已有大量文献对其进行了详细表征。利用青蛙和斑马鱼胚胎研究缺氧对脊椎动物发育影响的主要优势在于，由于氧气能够迅速渗透进入胚胎，所有发育过程均可被直接监测。因此，与小鼠胚胎等其他模型生物不同，在青蛙和斑马鱼中可直接研究特定氧浓度对目标组织的影响，而无需考虑功能性脉管系统是否存在。
目前市面上大多数用于缺氧培养的设备存在体积较大、运行成本较高的缺点。除了高昂的初始投入和气体消耗外，常见的缺氧舱由于体积较大和/或生物体呼吸作用，舱内会自然形成气体梯度，因此需要持续维持稳定的缺氧环境。这通常需要使用气体风扇和冷却系统，从而增加了所需附加设备的数量，限制了研究人员的操作灵活性，并整体降低了实验操作的简便性。相比之下，本文所介绍的装置虽然结构稳固，但成本低廉、体积小巧、易于建立，且能够实现快速的气体平衡、维持稳定的缺氧环境，并可在舱内简便地更换材料和溶液。本系统可适用于任何感兴趣的水生模式生物。
我们构建了一个体积小巧的缺氧室，可方便地置于普通实验室培养箱内，从而能够在任意特定温度下轻松进行实验操作。该系统在方便地控制培养基温度和氧气浓度方面具有优势，与 commercially available 的缺氧培养箱相比，其优势在于体积小且成本低廉。因此，我们的装置可利用大多数研究实验室普遍配备的常规实验器材搭建，无需任何昂贵材料。此外，与 commercially available 的缺氧培养箱不同，本装置在运行过程中不会产生热量，因此可在置于培养箱时于室温以下的温度条件下使用。这一点对于变温动物（如青蛙和鱼类）的研究尤为重要，因为这些生物的发育速率和代谢速率对温度高度依赖。
我们的气体培养室成本低廉且易于构建，却具有高度的多功能性，可建立多种低氧或高氧环境，并能快速、便捷地为大量实验条件施加不同的培养基和溶液。此外，本系统采用24孔板而非常用的培养皿或实验用培养皿10,11,12，可同时观察和处理多种突变条件。
为了确保缺氧诱导正确，我们通过蛋白质印迹法检测了HIF-1α蛋白的水平。此外，还可通过检测细胞在缺氧培养箱中孵育前后增殖细胞的数量，来判断组织中是否成功诱导了缺氧。该方法基于我们先前发表的研究结果13，即胚胎视网膜干细胞微环境中的细胞增殖在缺氧诱导后会减少。因此，我们通过向胚胎培养基中添加5-乙炔基-2′-脱氧尿苷（EdU），并检测其掺入新增殖细胞DNA中的情况，来监测视网膜干细胞的增殖水平。

<table><tbody><tr><td>氯化钠</td><td>Sigma</td><td>S7653</td><td>NaCl/0.1x MBS, 胚胎培养基, 10x TBST</td></tr><tr><td>氯化钾</td><td>Sigma</td><td>P9333</td><td>KCl/0.1x MBS, 胚胎培养基,</td></tr><tr><td>碳酸氢钠</td><td>Sigma</td><td>S5761</td><td>NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;/0.1x MBS</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td>0.1x MBS</td></tr><tr><td>硫酸镁</td><td>Sigma</td><td>M7506</td><td>MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;/0.1x MBS, 胚胎培养基</td></tr><tr><td>硝酸钙</td><td>Sigma</td><td>202967</td><td>Ca(NO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;)&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;/0.1x MBS</td></tr><tr><td>氯化钙</td><td>Sigma</td><td>C1016</td><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;/0.1x MBS, 胚胎培养基</td></tr><tr><td>亚甲蓝</td><td>Sigma</td><td>M9140</td><td>胚胎培养基</td></tr><tr><td>孕马血清促性腺激素（PMSG）</td><td>Sigma</td><td>CG10</td><td>蛙类受精</td></tr><tr><td>斑马鱼繁殖缸</td><td>Carolina</td><td>161937</td><td>气体室构建</td></tr><tr><td>24孔板</td><td>Thermo Scientific</td><td>142475</td><td>Nunclon Delta 表面，用于气体室构建</td></tr><tr><td>环氧树脂</td><td>RS Components UK</td><td>Kit 199-1468</td><td></td></tr><tr><td>气体分配阀</td><td>WPI Luer Valves</td><td>Kit 14011</td><td>水生动物缸连接（示意图1，&lt;strong&gt;H&lt;/strong&gt;）</td></tr><tr><td>高精度气体阀</td><td>BOC&amp;nbsp;</td><td>200 bar HiQ C106X/2B</td><td>气罐连接（示意图1，&lt;strong&gt;I&lt;/strong&gt;）</td></tr><tr><td>5% 氧气和95% N&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 气体罐</td><td>BOC</td><td>226686-L</td><td>缺氧气体混合物</td></tr><tr><td>陶瓷盘式扩散器</td><td>CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; Art&amp;nbsp;</td><td>玻璃CO2纳米水族馆扩散器，DG005DG005</td><td>示意图1，&lt;strong&gt;J&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>硅脂</td><td>Scientific Laboratory Supplies</td><td>VAC1100</td><td>示意图1，&lt;strong&gt;K&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>氧合仪</td><td>Oxford Optronix&amp;nbsp;</td><td>Oxylite, CP/022/001</td><td>缺氧室设置</td></tr><tr><td>光纤溶解氧传感器</td><td>Oxford Optronix</td><td>HL_BF/OT/E</td><td>缺氧室设置</td></tr><tr><td>塑料巴斯德移液管</td><td>Sterilin</td><td>STS3855604D</td><td>用于胚胎转移</td></tr><tr><td>MS222&amp;nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E10521-50G</td><td>胚胎麻醉剂</td></tr><tr><td>RIPA缓冲液&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>R0278-50ML</td><td>组织匀浆</td></tr><tr><td>蛋白酶抑制剂</td><td>Sigma</td><td>P8340</td><td>组织匀浆</td></tr><tr><td>Tris</td><td>Sigma</td><td>77-86-1</td><td>4x Laemmli上样缓冲液, 10x TBST</td></tr><tr><td>甘油</td><td>Sigma</td><td>G5516</td><td>4x Laemmli上样缓冲液</td></tr><tr><td>十二烷基硫酸钠（SDS）</td><td>Sigma</td><td>L3771</td><td>4x Laemmli上样缓冲液, 5x 电泳缓冲液</td></tr><tr><td>β-巯基乙醇&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>M6250</td><td>4x Laemmli上样缓冲液</td></tr><tr><td>溴酚蓝</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B0126</td><td>4x Laemmli上样缓冲液</td></tr><tr><td>Trizma碱&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>77-86-1</td><td>5x 电泳缓冲液, 转膜缓冲液</td></tr><tr><td>甘氨酸</td><td>Sigma</td><td>G8898</td><td>5x 电泳缓冲液, 转膜缓冲液</td></tr><tr><td>甲醇</td><td>Sigma</td><td>34860</td><td>转膜缓冲液</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma</td><td>P2287-500ML</td><td>10x TBST</td></tr><tr><td>脱脂奶粉</td><td>Sigma</td><td>70166</td><td>封闭溶液</td></tr><tr><td>Eppendorf 微量离心管</td><td>Sigma</td><td>T9661</td><td></td></tr><tr><td>组织匀浆器</td><td>Pellet Pestle Motor Kontes</td><td>Z359971</td><td>组织匀浆</td></tr><tr><td>研磨杵</td><td>Sigma</td><td>Z359947-100EA</td><td>组织匀浆</td></tr><tr><td>预制12%凝胶</td><td>Biorad</td><td>Mini-ProteinTGX, 456-1043</td><td>Western Blot</td></tr><tr><td>蛋白分子量标准</td><td>Amersham</td><td>全范围彩虹标记物, RPN800E</td><td>Western Blot</td></tr><tr><td>硝酸纤维素膜（0.45 &amp;micro;m）</td><td>Biorad</td><td>162-0115</td><td>Western Blot</td></tr><tr><td>抗HIF-1&amp;alpha; 抗体</td><td>Abcam</td><td>ab2185</td><td>Western Blot</td></tr><tr><td>抗&amp;alpha;-微管蛋白抗体</td><td>Sigma</td><td>T6074</td><td>Western Blot</td></tr><tr><td>山羊抗兔抗体</td><td>Abcam</td><td>ab6789</td><td>Western Blot</td></tr><tr><td>山羊抗小鼠抗体</td><td>Abcam</td><td>ab97080</td><td>Western Blot</td></tr><tr><td>Pierce ECL 2 试剂&amp;nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>80196</td><td>Western Blot</td></tr><tr><td>ECL 胶片 Hyperfilm</td><td>GE Healthcare Amersham</td><td>28906837</td><td>Western Blot</td></tr><tr><td>5-乙炔基-2&amp;prime;-脱氧尿苷 &amp;nbsp;</td><td>santa cruz</td><td>CAS&amp;nbsp;61135-33-9</td><td>EdU, EdU 掺入</td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲盐水（PBS）</td><td>Oxoid</td><td>BR0014G</td><td>1x</td></tr><tr><td>甲醛</td><td>Thermo Scientific</td><td>28908</td><td>固定液</td></tr><tr><td>蔗糖</td><td>Fluka</td><td>S/8600/60</td><td>溶液</td></tr><tr><td>吐温 X-100</td><td>Sigma</td><td>T9284-500ML</td><td>PBST</td></tr><tr><td>热灭活山羊血清（HiGS）</td><td>Sigma</td><td>G6767-100ml</td><td>封闭液（EdU 掺入）</td></tr><tr><td>4',6-二脒基-2-苯基吲哚&amp;nbsp;</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>D1306</td><td>DAPI, EdU 掺入</td></tr><tr><td>二甲基亚砜（DMSO）</td><td>Molecular Probes</td><td>C10338</td><td>EdU 掺入</td></tr><tr><td>玻璃小瓶</td><td>VWR</td><td>98178853</td><td>EdU 掺入分析</td></tr><tr><td>组织冷冻包埋剂（OCT 化合物）&amp;nbsp;</td><td>Scigen</td><td>4563</td><td>包埋介质，EdU 掺入分析</td></tr><tr><td>冷冻切片机 Jung Fridgocut 2800E</td><td>Leica&amp;nbsp;</td><td>CM3035S</td><td>EdU 掺入分析</td></tr><tr><td>Super-Frost plus Menzel 玻片</td><td>Thermo Scientific</td><td>J1800AMNZ</td><td>EdU 掺入分析</td></tr><tr><td>EdU Click-iT 化学试剂盒</td><td>Molecular Probes</td><td>C10338</td><td>EdU 掺入分析</td></tr><tr><td>FluorSave</td><td>Calbiochem</td><td>D00170200</td><td>封片剂，EdU 掺入分析</td></tr><tr><td>盖玻片</td><td>VWR</td><td>ECN631-1575</td><td>EdU 掺入分析</td></tr><tr><td>荧光显微镜</td><td>Nikon</td><td>Eclipse 80i</td><td>EdU 掺入分析</td></tr><tr><td>共聚焦扫描显微镜</td><td>Olympus</td><td>Fluoview FV1000</td><td>EdU 掺入分析</td></tr><tr><td>Volocity 软件</td><td>PerkinElmer</td><td>Volocity 6.3</td><td>EdU 掺入分析</td></tr></tbody></table>

活体青蛙和斑马鱼胚胎中缺氧的诱导

Induction of Hypoxia in Living Frog and Zebrafish Embryos

在此，我们介绍一种用于诱导缺氧的新系统，该系统由我们开发，旨在研究缺氧对水生生物（如青蛙和斑马鱼胚胎）的影响。本系统包含一个实验腔室，其结构简单，但性能稳定，可在任意选定的实验溶液中诱导并维持特定的氧气浓度和温度。所介绍的系统成本低廉但功能强大，可实现缺氧的诱导与持续维持，适用于直接开展实验。 体内 以及在不同时间段培养至48小时。
为了监测和研究缺氧的影响，我们采用了两种方法：检测整体胚胎或特定组织中缺氧诱导因子1α（HIF-1α）的水平，以及通过5-乙炔基-2′-脱氧尿苷（EdU）掺入DNA来测定视网膜干细胞的增殖情况。HIF-1α水平可作为整体胚胎或特定组织（此处为胚胎视网膜）中缺氧的通用标志物。EdU掺入胚胎视网膜增殖细胞是缺氧诱导的一个特异性指标。因此，我们已证明，在5%氧气条件下孵育1小时后，青蛙和斑马鱼胚胎的缺氧视网膜前体细胞增殖减少。
一旦掌握，该装置可应用于小型水生模式生物，用于直接 体内 实验可在任意时间段内进行，且在正常氧浓度、低氧或高氧浓度条件下，或在任何其他指定的气体混合条件下进行。

采用我们在此介绍的低氧舱系统，可对完整活体动物进行单独且在体的缺氧效应研究。通过将完整的青蛙或斑马鱼胚胎置于低氧舱内（图1），可在不同组合条件下诱导缺氧。我们已完成的气体舱装置图像见图2。实验过程中，我们在不同时间点使用光纤氧传感器（2.1.9）监测了培养介质中的氧浓度。这些数据表明，在整个实验过程中我们成功诱导并维持了稳定的低氧环境（溶解氧浓度为6–6.5%）（表1）。
首先，我们评估了在常氧条件以及在低氧培养箱诱导的低氧条件下，HIF-1α 在整体胚胎及视网膜中的表达水平。HIF-1α 是一种在低氧浓度下能够被稳定的蛋白。我们检测了在正常氧浓度或5%低氧条件下培养的完整蛙胚裂解液及其分离视网膜裂解液中的 HIF-1α 水平。如图3</st...

我们介绍一种用于水生生物（如青蛙和斑马鱼胚胎）的新型低氧培养系统。该系统结构简单、性能稳定、成本低廉，可有效诱导并维持低氧环境 体内 以及长达48小时。我们提供了两种可重复的方法来监测缺氧的有效性。

在此，我们介绍一种用于诱导缺氧的新系统，该系统由我们开发，旨在研究缺氧对水生生物（如青蛙及其他……）的影响。

本发明的总体目标是研究缺氧或高氧对任何目标水生生物胚胎组织的影响。该方法有助于回答发育生物学和细胞生物学领域的一些关键问题，例如胚胎生长受限、胎儿缺氧、高原适应、肥胖以及实体瘤的发生发展。该技术的主要优势在于操作简便、成本低廉且结果可靠。它能够在体内长时间地诱导并维持低氧状态。在收集并培育非洲爪蟾和斑马鱼胚胎后，根据文本方案准备一个带网状底部的24孔板。将塑料棒固定在网状底部的24孔板上，并将其放入选定的水生饲养箱中，然后使用硅胶管将装有所需氧氮混合气体（或其他选定气体混合物）的气瓶，通过合适的气体调节器连接至分配阀。接下来，将硅胶管和分配阀连接至水箱内的陶瓷盘式扩散器。根据实验所用胚胎的类型，向低氧室水箱中加入适当的胚胎培养基，然后关闭水箱，并用硅胶润滑脂涂抹盖子后小心密封。开始通过陶瓷盘式扩散器扩散混合气体。让系统平衡10到15分钟。将腔室培养基中的氧气流速调节至每秒0.0017至0.0019立方米。在此气体流速下，培养板的孔中不应观察到培养基的扰动。氧气流速取决于气罐的内部压力和气体减压阀的出口压力。这两个参数应根据气体减压阀上的监测装置进行调节。平衡后，使用溶氧仪或氧气探头测量水中的氧浓度。若需要特定的非室温条件，请将缺氧室放入所需温度的实验室培养箱中。使用完整且存活的胚胎，仔细挑选实验所需的胚胎用于缺氧培养。将胚胎培养皿放入含有气体培养室的培养箱中，使其与培养箱温度达到平衡。然后使用塑料移液管将胚胎小心转移至气体培养室的带网格24孔板的孔中。用不同基因型对各孔进行仔细标记。在将胚胎放入孔中时，应尽量减少培养室的再氧合。迅速转移样品，并快速重新密封 chamber。将气体培养 chamber 置于选定的气体混合物持续灌注条件下孵育 5 小时，或根据实验需求延长孵育时间。此处使用的气体混合物为 5% 氧气和 95% 氮气。将胚胎从气体培养箱中小心转移回与胚胎类型相对应的常氧培养基中。在配制好缓冲液和培养基并根据文本方案对胚胎进行麻醉后，使用组织匀浆器或超声波破碎仪对胚胎组织进行匀浆，随后离心匀浆液以去除碎片。收集上清液，将样品在85摄氏度下变性5分钟，然后按体积加入一倍体积的Laemmli上样缓冲液。取上清液用于Western印迹分析，或在负20摄氏度下冷冻保存样品。为了将EdU掺入胚胎中，向气体培养室中加入400至500毫升含1%（体积比）DMSO的5毫摩尔EdU溶液。将气体管路连接至装有5%氧气和95%氮气混合气体的气瓶。将溶液孵育15分钟。在实验开始前，用实验所用的相同气体混合物对溶液预平衡15分钟。将胚胎转移至低氧培养箱中，均匀分配到各孔内，并孵育两小时。最后，根据文本方案检测胚胎中的EdU掺入情况。如本表所示，在整个实验过程中，通过光纤氧传感器监测，孵育培养基中所需的氧浓度在不同时间点得到成功诱导。在本实验中，检测了在低氧浓度下稳定的 HIF

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科研

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Developmental Biology

发育生物学

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