斑马鱼中Myc诱导的T细胞急性淋巴细胞白血病侧群细胞的分离
2017年5月4日
本文介绍一种从myc诱导的T细胞急性淋巴细胞白血病（T-ALL）斑马鱼模型中分离侧群细胞的技术。该侧群细胞检测方法具有高灵敏度，虽针对斑马鱼T-ALL描述，但也可适用于其他良性和恶性斑马鱼细胞类型。
本实验的总体目标是从 myc 诱导的斑马鱼 T 细胞急性淋巴母细胞白血病模型中分离出侧群细胞。侧群细胞检测法已被用于鉴定多种正常组织和癌组织中的干细胞及祖细胞群体，但尚未应用于任何斑马鱼癌症模型。
该技术的主要优势在于，它能够前瞻性地分离出斑马鱼T细胞急性淋巴细胞白血病中可能富集了肿瘤干细胞活性的一群细胞。尽管本文所述方法在斑马鱼白血病研究中具有广泛的应用前景，但也可能适用于其他良性和恶性斑马鱼细胞类型。由于该方法对细微变化较为敏感，初次使用者可能会遇到一定困难。
尽管该方法看似简单，但仍需针对每种测试的细胞类型进行优化。配制20毫升含10%热灭活胎牛血清（FBS）的0.9x PBS溶液。取1毫升FBS/PBS溶液加入含有300单位抗凝剂肝素钠盐的西林瓶中。
然后，使用落射荧光显微镜筛选肿瘤细胞已侵入身体50%的斑马鱼，或表现出进食或游泳困难的个体。通过将斑马鱼转移至含有1至2毫克/毫升三卡因的鱼水中实施安乐死。观察动物的鳃部运动和心跳，以确认安乐死完成。
去除鱼头后，用移液器向其体腔内注入 100 微升肝素溶液，以去除多余的红细胞。吸出所有流出的液体，并用移液器将其转移至 1.5 毫升微量离心管中。随后，使用新的移液器吸头，再清洗体腔两次或直至洗液中不再含有血液为止，并弃去所有清洗液收集的液体。
为收集白血病细胞，将100微升FBS/PBS溶液注入预先冲洗过的体腔。在解剖显微镜下，用移液器吸头轻轻按压鱼体，使肿瘤细胞排出。将流出的液体收集至1.5毫升微量离心管中。
重复分离步骤直至收获大部分肿瘤细胞。将所有细胞收集至同一个1.5毫升微量离心管中，并将获得的细胞悬液置于室温保存。随后，通过轻柔吹打混悬分离的肿瘤细胞，以分散细胞团块。
将细胞悬液通过40微米的滤网过滤，并用100微升FBS/PBS洗涤滤网一至两次。过滤后，将细胞置于室温下保存。
最后，在一个新的离心管中，将两微升细胞悬液与18微升0.04%的无菌台盼蓝溶液混合。取10微升上述混合液加入血细胞计数板，计数有活力的荧光肿瘤细胞。重要的是要获得纯净的T-ALL细胞样本。
此处所用Hoechst 33342的浓度取决于收集的活肿瘤细胞数量。额外的细胞碎片或非肿瘤细胞可能会干扰检测。在细胞染色前，用无核酸酶的水稀释Hoechst染料，以获得1毫克/毫升的工作溶液。
将制备好的溶液用铝箔包裹后，于四摄氏度保存。然后，将 49.1 毫克维拉帕米溶解于一毫升 DMSO 中，得到 100 微摩尔的抑制剂溶液。接下来，通过向离心管中加入 FBS/PBS、2.5 微升 DMSO、15 微升浓度为一毫克每毫升的 Hoechst 染料，以及 10 的六次方个肿瘤细胞，定容至一毫升，制备样品。
制备对照组：加入 FBS/PBS、2.5 微升浓度为 1 亿摩尔的维拉帕米、15 微升浓度为 1 毫克/毫升的 Hoechst 染料，加入 10 的 6 次方肿瘤细胞，最终体积为 1 毫升。将样品和对照组置于 28 摄氏度水浴中避光孵育 120 分钟。孵育结束后，立即将细胞置于冰上，并保持避光状态。
在4 °C条件下，以300 × g离心细胞6分钟。然后，弃去上清液，并用1 mL FBS/PBS洗涤细胞。再次在4 °C条件下，以300 × g离心细胞6分钟。
待细胞离心成团后，吸除上清液，并将细胞重悬于一毫升 FBS/PBS 中。将样品置于四摄氏度保存，直至进行细胞分选。在细胞分选前 15 分钟，每毫升细胞悬液中加入两微升浓度为一毫克每毫升的碘化丙啶储备液。
然后充分涡旋混匀样品。使用荧光激活细胞分选仪分析染色的斑马鱼T细胞急性淋巴细胞白血病（T-ALL）细胞悬液。采用紫外激光激发Hoechst染料，用于分析；采用488纳米激光检测碘化丙啶或绿色荧光蛋白（GFP）阳性的T-ALL细胞。
细胞数量、染料浓度、孵育温度和孵育时间可能需要根据所使用的不同细胞类型进行优化。这些条件中的每一项改变都可能显著影响实验结果。为了鉴定从斑马鱼中分离的T细胞急性淋巴细胞白血病（T-ALL）细胞中的侧群细胞，首先需排除细胞碎片和细胞团块。
然后通过分析单细胞群体中的碘化丙啶摄入和GFP表达来鉴定活肿瘤细胞。为观察侧群细胞，比较Hoechst染料的蓝色和红色发射荧光。侧群表现为从主细胞群左侧向蓝色荧光轴方向延伸的微弱细胞尾部。
本文展示了针对两种不同肿瘤细胞样本进行的侧群分析结果。在两个样本中均鉴定出了侧群细胞。然而，不同肿瘤样本中侧群细胞的数量存在差异。
无论分析何种肿瘤样本，使用维拉帕米作为外排抑制剂处理样本后，先前鉴定出的细胞信号均会消失，从而进一步证实了侧群细胞表型的存在。只要掌握要领，若操作得当并按照本文所述方法进行，斑马鱼T细胞急性淋巴细胞白血病（T-ALL）的侧群细胞检测技术可在四小时内完成。在实施该实验流程时，需特别注意已针对斑马鱼T-ALL优化的关键步骤，包括孵育温度与时间、染料浓度以及外排抑制剂的使用。
这些参数可能需要根据不同实验系统进行调整。完成该操作后，可对分选出的侧群细胞进行其他方法，如RNA提取或体内移植实验，以探究侧群细胞的功能及其基因调控机制。观看本视频后，您应能够充分掌握如何从斑马鱼T细胞急性淋巴母细胞白血病中分离侧群细胞。
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概述
本文介绍了一种从 myc 诱导的 T 细胞急性淋巴细胞白血病（T-ALL）斑马鱼模型中分离侧群细胞的技术。侧群细胞检测法具有高灵敏度，可能适用于多种斑马鱼细胞类型。
关键研究要素
科学领域
- 神经科学
- 细胞生物学
- 肿瘤学
背景
- 侧群细胞检测法可鉴定干细胞和祖细胞群体。
- 该技术此前尚未应用于斑马鱼癌症模型。
- 对于理解T细胞急性淋巴细胞白血病（T-ALL）中癌症干细胞的活性至关重要。
- 该方法对细微变化敏感，可能为初学者带来挑战。
研究目的
- 从斑马鱼T细胞急性淋巴细胞白血病中分离侧群细胞。
- 富集分离细胞群体中的肿瘤干细胞活性。
- 探索在斑马鱼白血病研究中的更广泛应用。
使用的方法
- 从斑马鱼中分离侧群细胞。
- 侧群细胞检测方法的应用。
- 对细胞群进行癌症干细胞特征的评估。
- 方法灵敏度及操作者面临挑战的评价。
主要结果
- 成功从斑马鱼T细胞急性淋巴细胞白血病中分离出侧群细胞。
- 鉴定出潜在的肿瘤干细胞群体。
- 在斑马鱼模型中验证了该检测方法的灵敏性。
- 该方法可能适用于其他类型的斑马鱼细胞。
结论
- 侧群细胞检测是斑马鱼癌症研究中的重要工具。
- 该方法能够前瞻性地分离具有癌症干细胞活性的细胞。
- 进一步的研究探索可能加深对多种斑马鱼细胞类型的理解。
常见问题
行业重要性概述
在斑马鱼T-ALL模型中分离侧群细胞，可前瞻性地鉴定具有潜在干细胞样或前体细胞特性的细胞亚群，从而支持早期肿瘤学发现中的机制性风险降低。该能力通过阐明疾病相关系统中的细胞异质性，提高靶点验证的预测可信度，并为项目组合的筛选提供依据。该方法确立了斑马鱼作为可扩展的临床前模型，用于对癌细胞层级结构进行功能解析。
生物制药研发中的策略性应用
早期发现与靶点验证
- 可实现对候选癌症干细胞群体的功能性分离，用于基于假设的研究。
- 通过区分T-ALL模型中具有外排能力的亚群，支持机制层面的风险评估。
- 有助于阐明信号通路，并在血液系统恶性肿瘤研究中进行靶点优先排序。
筛选与检测方法开发
- 提供经过验证的工作流程，用于制备均一的细胞群体，以用于下游检测。
- 通过实现对非活细胞或污染细胞的定量设门与排除，提高检测的可重复性。
- 建立可扩展的筛选平台，用于在明确定义的细胞亚群中分析其功能特性或药物反应。
转化与临床前研究
- 通过利用斑马鱼T-ALL模型进行体内功能研究，与疾病相关建模相一致。
- 通过移植实验和单细胞转录组学，实现从发现到临床前验证的连续性。
- 通过阐明细胞异质性的功能意义，支持基于风险调整的推进策略。
流程与工作流整合
该方法整合了早期发现与临床前研究的接口，通过斑马鱼T-ALL模型，连接靶点验证、机制研究以及功能筛选。
- Discovery Biology：支持对癌症干细胞活性和外排机制的假设验证。
- Screening：提供可重复的定量输出，用于细胞群体分析及下游检测的准备。
- Analytics：实现不同条件下侧群细胞频率及其功能特性的统计学比较。
- Translational Research：促进体内移植和转录组学分析，以实现生物标志物的匹配。
- Enterprise Reuse：提供可重复使用的实验流程，可适配于其他斑马鱼恶性肿瘤或前体细胞研究。
运营与企业影响
- 科学价值：提高靶点验证的预测可信度，降低肿瘤学模型中的机制模糊性。
- 操作价值：标准化细胞分离和流式细胞术操作流程，确保可重复性和可扩展性。
- 战略价值：通过明确细胞异质性和功能相关性，为推进或终止决策提供依据。
- 项目组合影响：实现基于风险调整的靶点和模型优先级排序，推动后续开发。
实施注意事项
- 需要具备流式细胞术、斑马鱼操作和细胞分选方面的专业知识。
- 需要配备紫外光功能的流式细胞仪以及优化的染色方案。
- 需要跨团队统一门控策略、染料浓度和孵育参数。
- 由于检测方法的敏感性，可能需要针对不同细胞类型或疾病模型进行调整。
- 实验变量的优化对于确保结果可重复性和数据完整性至关重要。
