从外周血来源的人诱导性多能干细胞分化软骨细胞

本实验的总体目标是利用人外周血来源的诱导性多能干细胞（iPS 细胞）生成软骨细胞系细胞。该方法有助于解答软骨再生领域中的关键问题，即利用患者来源的外周血细胞作为 C 细胞生成 iPS 细胞，用于软骨修复。该技术的主要优势在于其实验可重复性高，且软骨细胞分化过程在无血清、无异源成分的条件下进行。

首先，将人iPS细胞接种于含有经照射的小鼠胚胎成纤维饲养细胞单层的60毫米组织培养皿中，加入4毫升人iPSC培养基。在37摄氏度、5%二氧化碳条件下培养细胞。当干细胞融合度达到80%至90%时，使用Dispase溶液消化细胞，进行传代培养。

经过两到三代培养后，使用火焰拉制的玻璃针将80%至90%融合的未分化iPSC集落机械分割成较小的片段，并将不超过100个细胞培养块转移至一个新的非黏附性100毫米培养皿中，该培养皿内含有10毫升拟胚体形成培养基。机械解离优于自动消化，因其可减少细胞损伤，将细胞分割成较小片段后转移至新的培养容器中，同时可避免饲养层细胞对人iPS细胞分化的抑制作用。将人iPS细胞放回细胞培养孵育箱中继续培养。

两天后，倾斜培养皿使拟胚体沉降，并小心地将3毫升拟胚体形成培养基更换为4毫升新鲜的基础培养基。10天后，拟胚体将形成。用4毫升0.1%明胶在37摄氏度下孵育30分钟，对一个新的100毫米培养皿进行包被处理。

将类胚体连同上清液转移至15毫升锥形管中，静置4到5分钟使类胚体沉降。吸除除最后0.5毫升外的全部培养基，并将类胚体重悬于10毫升新鲜基础培养基中。当明胶凝固后，弃去明胶。

然后将细胞接种到明胶包被的培养皿中，并将培养皿放入细胞培养箱中。培养10天后，类胚体将分化为成纤维细胞样细胞的外延生长。为诱导软骨细胞分化，用DPBS洗涤培养物，并在37摄氏度下用3毫升0.25%的胰蛋白酶EDTA消化5分钟以解离细胞。

当细胞从培养皿底部脱落时，加入4毫升新鲜的基础培养基以中和反应，并轻轻吹打培养液5至10次。用70微米的尼龙滤网过滤细胞悬液，通过离心收集细胞。然后将细胞接种至新的明胶包被的100毫米培养皿中，加入10毫升新鲜的基础培养基。

当细胞培养至90%至100%融合时，用3毫升0.25%胰蛋白酶EDTA消化收集细胞，操作方法如前所述用于计数。将3 × 10⁵个细胞分装至15毫升聚丙烯离心管中进行离心。然后将沉淀重悬于1毫升软骨诱导分化培养基中。

然后再次离心细胞，并将离心管放入细胞培养孵育箱中培养21天，期间不要扰动细胞沉淀。在高密度培养条件下，软骨诱导细胞可能在体外自发聚集，形成特征性的细胞外基质。培养21天后，人诱导多能干细胞（iPS细胞）将形成软骨诱导细胞团。

培养21天后，人iPSC软骨细胞经阿利新蓝和甲苯胺蓝染色呈阳性，表明人iPSC细胞团成功实现了软骨向分化。II型胶原和X型胶原的免疫组织化学分析进一步证实了其软骨细胞样表型。硫酸化糖胺聚糖分析显示，与人iPSC成纤维细胞样细胞、类胚体及未分化人iPSC细胞相比，人iPSC软骨细胞团中的硫酸化糖胺聚糖含量显著上调。

此外，人iPSC软骨细胞表现出软骨祖细胞谱系以及完全分化软骨细胞标志物的高基因表达水平，表明已成功实现软骨向分化。该方法采用多步培养法将人iPSC分化为软骨细胞，包括通过拟胚体（EB）形成进行自发分化、EB细胞迁移生长、细胞贴壁培养后的单层细胞培养，以及三维团块培养。通过组织学分析、生物化学分析和软骨向基因表达对软骨细胞表型进行评估。

观看本视频后，您应能充分理解如何使用多步培养法诱导人iPS细胞向软骨细胞分化。该技术可能更具患者特异性，且成本效益更高。