Name: 分化软骨细胞与外周血源性人诱导多能干细胞 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 51 s
Description: 学习利用人外周血细胞来源的诱导多能干细胞分化为软骨细胞的无血清、无异种成分培养方案。该方法通过类胚体形成、成纤维细胞扩增及三维微团培养实现高效软骨发生，为软骨修复提供可重复的患者特异性策略。

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作者感谢张小斌提供的质粒。同时感谢高韶荣和王倩菲在实验过程中给予的热心帮助。本研究受到国家自然科学基金（编号：81101346、81271963、81100331）、北京市215高层次人才项目（编号：2014-3-025）、北京朝阳医院基金（编号：CYXX-2017-01）以及中国科学院青年创新促进会（Y.L.）的资助。

从外周血细胞（PBCs）生成人诱导多能干细胞（hiPSCs）的实验方案可参见我们之前的研究5。本研究已获本机构机构审查委员会批准。
1. 胚状体（EB）形成
<ol>
	<li>配制50 mL hiPSC培养基：在Knockout Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）中添加15% Knockout血清替代物（KSR）、5% 胎牛血清（FBS）、1× 非必需氨基酸、55 μM 2-巯基乙醇、2 mM L-谷氨酰胺和8 ng/mL碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）。</li>
	<li>配制50 mL EB形成培养基：DMEM添加15% KSR、5% FBS、1×非必需氨基酸、55 μM 2-巯基乙醇和2 mM L-谷氨酰胺。</li>
	<li>配制50 mL基础培养基：DMEM添加20% FBS、1×非必需氨基酸、55 μM 2-巯基乙醇和2 mM L-谷氨酰胺。</li>
	<li>配制10 mL dispase溶液，浓度为1 mg/mL，溶于无血清DMEM培养基中。</li>
	<li>将hiPSCs接种于含饲养层细胞的60 mm组织培养皿中（即， 一层经照射的小鼠胚胎成纤维细胞。当细胞融合度达到80-90%时，使用dispase消化并解离细胞，每4-5天以1:3比例传代人诱导多能干细胞。将细胞置于37 °C、5% CO₂培养箱中培养。2 培养箱</li>
	<li>当iPSC细胞融合度达到80-90%时，使用火焰拉制的玻璃针将未分化的hiPSC集落切割成较小的片段（直径约50-100 µm）。通常，使用60 mm培养皿中的hiPSC集落来在100 mm培养皿中生成拟胚体（EB）。
	<ol>
		<li>将少于100个微小菌落碎片接种于含10 mL拟胚体形成培养基的100 mm非黏附型培养皿中。将培养皿置于37 °C、5% CO₂的培养箱中培养。2 培养箱</li>
	</ol>
	</li>
	<li>每2天将初始培养基约25%更换为等量的基础培养基。倾斜培养皿使胚胎体（EBs）沉降，小心吸除上层3 mL培养基，加入4 mL新鲜基础培养基，注意勿扰动EBs。 
	注意：在显微镜下，EBs 在形态学上表现为菌落碎片，呈具有光滑边界的圆形外观。</li>
	<li>在非黏附型培养皿中培养10天后，使用前将新的100 mm组织培养皿用4 mL 0.1%明胶在37 °C孵育30 min进行包被。</li>
	<li>将培养基和拟胚体从100 mm非黏附性培养皿转移至15 mL锥形管中。静置4–5分钟使拟胚体沉降。小心吸除上清液，保留少于0.5 mL的含拟胚体培养基。</li>
	<li>将少于100个EBs接种至含10 mL基础培养基的100 mm明胶包被的组织培养皿中。将培养皿置于37 °C、5% CO₂的培养箱中。2 培养箱</li>
</ol>
2. 细胞沉淀形成与软骨细胞分化
<ol>
	<li>配制10 mL 0.25% 胰蛋白酶/乙二胺四乙酸（EDTA）。配制80 mL 基础培养基：DMEM，添加20% FBS、1×非必需氨基酸、55 μM 2-巯基乙醇和2 mM L-谷氨酰胺。</li>
	<li>配制10 mL软骨诱导分化培养基：在DMEM（高糖）中添加10%胰岛素-转铁蛋白-硒溶液（ITS）、0.1 µM地塞米松、1 mM抗坏血酸、1%丙酮酸钠和10 ng/mL转化生长因子-β1（TGF-β1）。</li>
	<li>48小时后用10 mL基础培养基更换培养液，此后每隔三天用10 mL基础培养基更换一次培养液。 
	注意：培养10天后，成纤维样细胞应已从胚体（EBs）中长出并扩展。
	<ol>
		<li>在使用前，将100 mm培养皿用4 mL 0.1%明胶于37 °C孵育30分钟进行包被。弃去细胞上清液，用Dulbecco磷酸盐缓冲液（DPBS）洗涤细胞一次。</li>
		<li>用3 mL 0.25%胰蛋白酶/EDTA在37 °C消化细胞5分钟，加入4 mL基础培养基中和。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过移液吹打5-10次并将细胞悬液过70 µm尼龙筛网，使细胞解离为单细胞。将细胞悬液在200 x g离心5分钟。用10 mL基础培养基将细胞重新接种至新的100 mm胶原蛋白包被的组织培养皿中。</li>
	<li>48小时后用10 mL基础培养基更换培养液，此后每隔三天用10 mL基础培养基更换一次培养液。 
	注意：细胞呈现出均一的成纤维细胞样形态。</li>
	<li>当达到约90-100%汇合度时（即， 约5-7天后，加入3 mL 0.25%胰蛋白酶/EDTA，在37 °C消化5分钟收集细胞。加入4 mL基础培养基中和。通过移液吹打5次使细胞充分解离为单细胞。使用血细胞计数板对细胞进行计数。
	<ol>
		<li>放置 3 × 105 将细胞置于15 mL聚丙烯管中，在室温下以200 × g离心5分钟。用1 mL软骨诱导分化培养基重悬细胞。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>以 300 × g 离心 3 分钟，重新沉淀细胞，并保持细胞呈小团状沉淀。将离心管置于 37 °C、5% CO₂ 培养箱中2&#160;孵育21天。不要将瓶盖拧紧，以允许气体交换。</li>
	<li>每隔三天更换四分之三的培养基，加入新鲜的软骨诱导分化培养基。 
	注意：培养21天后，应形成hiPSC软骨细胞团（hiPSC-Chon）。人源间充质干细胞（MSCs）作为阳性对照，同样在软骨分化培养基中培养21天，以形成软骨细胞团（hMSC-Chon）。</li>
</ol>
3. 软骨形成分化分析
<ol>
	<li>配制10 mL 10%中性缓冲福尔马林。</li>
	<li>配制 50 mL 0.1% 阿尔新蓝试剂和 50 mL 1% 甲苯胺蓝试剂。</li>
	<li>配制1 mL一抗溶液：含针对胶原蛋白II的兔多克隆抗体（1:50）或针对胶原蛋白X的小鼠单克隆抗体（1:50）。同时配制抗兔或抗小鼠的二抗。</li>
	<li>配制1 mL木瓜蛋白酶溶液：在PBS中加入10 U/mL木瓜蛋白酶、0.1 M醋酸钠、2.4 mM EDTA和5 mM L-半胱氨酸。</li>
	<li>配制100 mL二甲基亚甲蓝（DMMB）染料溶液：100 µL 16 mg/L 1,9-二甲基亚甲蓝、40 mM 甘氨酸、40 mM NaCl 和 9.5 mM HCl，pH 3.0。</li>
	<li>通过团块切片的阿利新蓝和甲苯胺蓝染色评估软骨形成分化。
	<ol>
		<li>将一个hiPSC-Chon细胞团或hMSC-Chon细胞团置于1 mL 10%中性缓冲福尔马林中固定24小时。</li>
		<li>将沉淀物转移至含有1 mL 70%乙醇的H2O. 用1 mL梯度乙醇系列对沉淀物进行脱水处理（即， 25%、50%、75%、90%、95%、100% 和 100%，每个梯度 3 分钟。</li>
		<li>用1 mL纯二甲苯将沉淀物澄清三次。将沉淀物置于65 °C烘箱中，用石蜡浸润1小时。将沉淀物包埋于7 x 7 x 5 mm的石蜡块中。3 常规组织学步骤，使用底模6.</li>
		<li>用切片机切出厚度约为 4 µm 的相邻切片7将切片贴附于玻璃载片上。</li>
		<li>将载玻片置于60 °C烘箱中干燥2 h。使用100%二甲苯分三次脱蜡（每次3 min）。</li>
		<li>使用梯度递减的酒精系列进行再水化（即， 100, 100, 95, 95, 70, 50 和 25% H₂O2O，每次3分钟）后，再用去离子水最终冲洗5分钟。</li>
		<li>用0.1%阿尔新蓝试剂或1%甲苯胺蓝染色4-5小时，然后用蒸馏水冲洗。</li>
		<li>使用梯度乙醇系列进行脱水（即， 25%、50%、75%、90%、95%、100% 和 100%，每步 3 分钟，随后在 100% 二甲苯中连续透明三步。封片后在显微镜下观察。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>进行免疫组织化学染色。 
	注意：额外的组织沉淀切片将通过免疫组织化学进一步评估。
	<ol>
		<li>脱蜡和复水后，将切片置于1 mM EDTA（pH 8.0，经高压灭菌水配制）中煮沸。在略低于沸点的温度下静置8分钟，随后让切片在室温下冷却。</li>
		<li>用去离子水冲洗载玻片3次。将切片置于3% H2O2 在室温下用甲醇溶液孵育15分钟，以阻断内源性过氧化物酶活性。</li>
		<li>用去离子水冲洗载玻片，并将其浸入DPBS中5分钟。在载玻片的切片上加入50–100 µL适当稀释（1:50）的一抗溶液，然后于室温下在湿盒中孵育1小时。</li>
		<li>用DPBS洗涤载玻片3次，每次5分钟。将样品与相应的二抗孵育（即， 室温下孵育15分钟（使用抗兔或抗鼠二抗）。</li>
		<li>用DPBS洗涤载玻片3次，每次5分钟。在显微镜下进行DAB检测。</li>
		<li>用DPBS洗涤载玻片3次（每次2分钟）。将载玻片浸入苏木精溶液中1-2分钟，对细胞核进行复染。随后用梯度乙醇脱水（25%、50%、75%、90%、95%、100%和100%；每步3分钟），接着用二甲苯连续透明3次。最后封片，并在显微镜下观察。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>检测sGAG含量。
	<ol>
		<li>在60 °C的木瓜蛋白酶溶液中消化软骨生成小球2小时。</li>
		<li>使用dsDNA检测试剂盒和荧光计系统测定DNA含量。通过将sGAG与DMMB染料溶液混合，在525 nm波长下测定吸光度以测量sGAG含量。8.</li>
		<li>根据鲨鱼软骨素硫酸标准曲线计算sGAG的浓度。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>对hiPSC-Chon细胞球体进行软骨形成分化标志物的实时PCR分析。
	<ol>
		<li>加入500 µL预冷的裂解试剂至一个离心管中，收集3-4个相同的软骨生成微球。充分涡旋混匀。室温孵育样品5分钟。</li>
		<li>加入0.1 mL氯仿。将样品涡旋振荡15秒，室温孵育3分钟。在4 °C、12,000 x g条件下离心15分钟。将上层水相（约250 µL）转移至新的1.5 mL微量离心管中。</li>
		<li>向样品中加入25 µL乙酸钠和1 µL糖原。加入250 µL异丙醇以沉淀RNA，充分混匀。室温孵育10分钟。</li>
		<li>在 12,000 × g 和 4 °C 条件下离心 10 分钟。完全移除上清液。用 500 µL 75% 乙醇将 RNA 沉淀洗涤两次。</li>
		<li>在 7,500 × g 和 4 °C 条件下离心 5 分钟。彻底去除残留乙醇，将 RNA 沉淀在空气中干燥 5–10 分钟。用 10 µL 无核酸酶水溶解 RNA。</li>
		<li>使用逆转录系统将RNA转化为cDNA。利用qPCR试剂盒预混液（2×）和实时PCR系统对cDNA样品进行实时PCR扩增。9. 
		注意：引物序列如下： 
		h聚集蛋白聚糖-F:TCGAGGACAGCGAGGCC 
		hAGGRECAN-R：TCGAGGGTGTAGCGTGTAGAGA； 
		hβ-肌动蛋白-F：TTTGAATGATGAGCCTTCGTCCCC 
		hβ-肌动蛋白-R：GGTCTCAAGTCAGTGTACAGGTAAGC； 
		hCOL2-F：TGGACGATCAGGCGAAACC； 
		hCOL2-R：GCTGCGGATGCTCTCAATCT； 
		hSOX9-F：AGCGAACGCACATCAAGAC； 
		hSOX9-R：CTGTAGGCGATCTGTTGGGG； 
		hCOL10-F：ATGCTGCCACAAATACCCTTT； 
		hCOL10-R：GGTAGTGGGCCTTTTATGCCT</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本文提供了一种通过诱导性多能干细胞（iPSCs）从外周血细胞（PBCs）生成软骨细胞的实验方案。由于PBCs在临床领域更为常见且应用广泛，因此可作为重编程的一种潜在替代来源。在本研究中，采用游离型载体（EV）将PBCs重编程为iPSCs，该方法基于Zhang et al.11建立的技术。这种无整合方法避免了病毒介导的基因毒性整合问题，被认为在临床领域具有广泛的应用前景12,13。本研究中从血细胞获得无整合iPSCs的重编程效率令人满意，仅需2 mL外周血即可产生超过30个iPSC克隆。因此，PBCs有望成为用于软骨组织工程及其他临床应用的iPSCs种子细胞来源。
从人诱导多能干细胞（hiPSCs）进行软骨分化的主要步骤包括：拟胚体（EB）形成、EB细胞迁移生长、单层培养以及三维团块培养。未分化的hiPSC克隆使用火焰拉制的玻璃针切割成较小的片段。尽管机械法技术要求较高，但相较于酶消化法（如dispas...

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/video/55722/differentiating-chondrocytes-from-peripheral-blood-derived-human">Differentiating Chondrocytes from Peripheral Blood-derived Human Induced Pluripotent Stem Cells</a>.
The corresponding author was updated from:
Yueying Li 
yueyinglee2010@hotmail.com 
Key Laboratory of Genomic and Precision Medicine, Beijing Institute of Genomics, Chinese Academy of Sciences
The corresponding author is now listed as:
Tie Liu 
waterkins@163.com 
Department of Orthopedics, Beijing Chao-Yang Hospital, Capital Medical University

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/video/55722/differentiating-chondrocytes-from-peripheral-blood-derived-human">Differentiating Chondrocytes from Peripheral Blood-derived Human Induced Pluripotent Stem Cells</a>.

Erratum: Differentiating Chondrocytes from Peripheral Blood-derived Human Induced Pluripotent Stem Cells

软骨组织的自我修复和再生能力非常有限。目前用于恢复软骨和关节功能的各种外科干预和生物治疗方法，效果均不理想。近年来干细胞技术的发展有望彻底改变整个软骨修复领域1。多种干细胞已被研究作为种子细胞，其中人诱导多能干细胞（hiPSCs）似乎是前景最为广阔的选择，因其能够提供多种患者特异性细胞，且不会引发排斥反应2。此外，它们能够克服成体细胞增殖能力有限的问题，持续保持自我更新和多向分化潜能。同时，还可通过基因靶向技术改变其基因型，从而获得特定类型的软骨细胞。
成纤维细胞已被广泛用于诱导多能干细胞（iPSCs）的生成，因为其重编程潜能已得到深入研究。然而，仍存在一些需要克服的局限性，例如患者取材时的疼痛性活检以及对 体外 成纤维细胞的扩增，可能导致基因突变3最近发现，PBCs 在重编程方面具有优势4此外，它们常被广泛使用且储量丰富。这些材料有可能将研究重点从皮肤转移。然而，据我们所知，关于PBC重编程后分化为软骨细胞的报道尚十分有限。
在本研究中，我们利用外周血细胞（PBCs）作为替代来源，将其重编程为诱导多能干细胞（iPSCs），然后通过团块培养系统将iPSCs向软骨细胞谱系分化，以模拟软骨细胞的形成过程。

<table><tbody><tr><td>Knockout DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>10829018</td><td>用于 hiPSC 培养和拟胚体（EB）形成培养基的基础培养基</td></tr><tr><td>Knockout 血清替代物（KSR）</td><td>Invitrogen</td><td>10828028</td><td>一种成分更明确、不含胎牛血清（FBS）的培养基添加剂，用于 hiPSC 培养和拟胚体（EB）形成培养基</td></tr><tr><td>胎牛血清（FBS）</td><td>Hyclone</td><td>sh30070.03</td><td>用于 hiPSC 培养和拟胚体（EB）形成培养基，为细胞培养提供优良性能</td></tr><tr><td>非必需氨基酸</td><td>Chemicon</td><td>TMS-001-C</td><td>作为所有细胞培养基中的生长添加剂，用于促进细胞生长和提高细胞活力</td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺</td><td>Invitrogen</td><td>TMS-002-C</td><td>细胞培养所需的一种氨基酸</td></tr><tr><td>碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）</td><td>Peprotech</td><td>100-18B</td><td>一种用于维持 hiPSC 多能性和自我更新能力的细胞因子</td></tr><tr><td>分散酶（Dispase）</td><td>Invitrogen</td><td>17105041</td><td>用于 hiPSC 传代培养时的细胞解离</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>C11960</td><td>用于间充质干细胞（MSC）培养基的基础培养基</td></tr><tr><td>0.1% 明胶</td><td>Millipore</td><td>ES-006-B</td><td>用于促进细胞在培养皿表面的贴附</td></tr><tr><td>0.25% 胰蛋白酶/EDTA</td><td>Gibco</td><td>25200072</td><td>用于细胞解离</td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Gibco</td><td>14190250</td><td>一种平衡盐溶液，用于细胞洗涤或试剂配制</td></tr><tr><td>2-巯基乙醇</td><td>invitrogen</td><td>21985023</td><td>作为所有细胞培养基中的生长添加剂</td></tr><tr><td>ITS</td><td>invitrogen</td><td>41400045</td><td>胰岛素、转铁蛋白、硒溶液，用于软骨向分化</td></tr><tr><td>抗坏血酸</td><td>Sigma</td><td>4403</td><td>又称维生素 C，有助于细胞活跃生长，并具有抗氧化特性</td></tr><tr><td>丙酮酸钠</td><td>Gibco</td><td>11360070</td><td>添加至细胞培养基中，作为葡萄糖之外的能量来源</td></tr><tr><td>转化生长因子-β1</td><td>Peprotech</td><td>AF-100-21C</td><td>一种调控细胞增殖、生长及软骨向分化的细胞因子</td></tr><tr><td>兔多克隆抗 II 型胶原抗体</td><td>Abcam</td><td>ab34712</td><td>该抗体可与 II 型胶原反应，而 II 型胶原为软骨组织特异性表达</td></tr><tr><td>小鼠单克隆抗 X 型胶原抗体</td><td>Abcam</td><td>ab49945</td><td>该抗体可与 X 型胶原反应，X 型胶原为肥大软骨细胞的产物</td></tr><tr><td>Permount</td><td>Fisher Scientific</td><td>SP15-100</td><td>用于载玻片的封片及长期保存</td></tr><tr><td>甲苯胺蓝</td><td>Sigma</td><td>89640</td><td>用于检测蛋白聚糖</td></tr><tr><td>阿利新蓝</td><td>Amresco</td><td>#0298</td><td>用于检测氨基葡萄糖聚糖</td></tr><tr><td>木瓜蛋白酶</td><td>Sigma</td><td>P4762-25MG</td><td>用于消化软骨向分化形成的细胞团块</td></tr><tr><td>二甲基亚甲基蓝</td><td>Sigma</td><td>341088-1G</td><td>用于定量糖胺聚糖</td></tr><tr><td>鲨鱼软骨来源的硫酸软骨素钠盐</td><td>Sigma</td><td>C4384-250MG</td><td>用于绘制标准曲线以测定 sGAG 含量</td></tr><tr><td>Qubit dsDNA HS 检测试剂盒</td><td>Invitrogen</td><td>Q32851 (100)</td><td>用于测定 DNA 含量</td></tr><tr><td>TRIzol</td><td>Invitrogen</td><td>15596018</td><td>用于从细胞中提取 RNA</td></tr><tr><td>逆转录系统</td><td>Promega</td><td>A3500</td><td>用于将 RNA 转化为 cDNA</td></tr><tr><td>SYBR FAST qPCR 试剂盒预混液</td><td>Kapa</td><td>KK4601</td><td>用于实时 PCR</td></tr></tbody></table>

从外周血来源的人诱导性多能干细胞分化软骨细胞

Differentiating Chondrocytes from Peripheral Blood-derived Human Induced Pluripotent Stem Cells

本研究中，我们采用外周血细胞（PBCs）作为种子细胞，通过无整合方法经由诱导性多能干细胞（iPSCs）生成软骨细胞。在形成拟胚体（EB）并扩增成纤维样细胞后，iPSCs在无血清且无异源成分的条件下诱导软骨向分化21天。软骨细胞诱导完成后，通过形态学、免疫组织化学、生物化学分析以及软骨向分化标志物的实时定量PCR检测对细胞表型进行评估。软骨化细胞团呈阿利新蓝和甲苯胺蓝阳性染色。II型胶原和X型胶原的免疫组织化学染色亦为阳性。与hiPSCs和成纤维样细胞相比，软骨化细胞团中硫酸化糖胺聚糖（sGAG）含量以及软骨向分化标志物COLLAGEN 2 （COL2）、COLLAGEN 10（COL10）、SOX9和AGGRECAN均显著上调。这些结果表明，PBCs可作为种子细胞用于生成个体化且成本效益高的iPSCs，以实现软骨修复。

hiPSCs 的软骨分化：
使用拟胚体形成培养基和基础培养基将人诱导多能干细胞（hiPSCs）向间充质谱系进行分化。采用多步培养方法（图1）。首先，hiPSCs通过拟胚体（EB）形成进行自发分化，持续10天（D10；图2A）。其次，细胞从拟胚体中迁移并继续培养10天（D10+10）。在这两个阶段中，iPSCs逐渐失去其原始形态，转变为纺锤形形态（图2B），传代后进一步变为成纤维细胞样形态。第三，细胞在传代后以单层形式扩增（图2C），此过程中排除残留的未分化细胞。随后，在单层培养5-7天后，细胞进一步扩增并定向分化为成纤维细胞样细胞（D10+10+7）。第四，当hiPSC来源的成纤维细胞样细胞（hiPSC-F）融合度达到约9...

我们介绍一种通过无整合方法利用人外周血（PB）来源的诱导性多能干细胞（iPSCs）生成软骨细胞系的方案，该方法包括拟胚体（EB）形成、成纤维细胞扩增以及软骨诱导。

在本研究中，我们采用外周血细胞（PBCs）作为种子细胞，通过诱导性多能干细胞（iPSCs）生成软骨细胞，以实现……

本实验的总体目标是从人外周血来源的诱导性多能干细胞（iPS细胞）生成软骨细胞系细胞。该方法有助于解答软骨再生领域中的关键问题，即利用患者来源的外周血细胞作为C细胞生成iPS细胞，用于软骨修复。该技术的主要优势在于其实验可重复性高，且软骨细胞分化过程在无血清、无异源成分的条件下进行。首先，将人诱导多能干细胞（iPS细胞）接种于含有经辐照的小鼠胚胎成纤维细胞饲养层的60毫米组织培养皿中，加入4毫升人iPSC培养基。在37摄氏度、5%二氧化碳条件下培养细胞。当干细胞融合度达到80%至90%时，使用Dispase溶液消化细胞，进行传代培养。经过两到三代培养后，使用火焰拉制的玻璃针将80%至90%融合的未分化iPSC集落机械分割为较小的片段，并将不超过100个细胞培养块转移至新的非黏附性100毫米培养皿中，培养皿内含10毫升拟胚体形成培养基。机械解离优于自动消化，因其可减少细胞损伤，将细胞分割成较小片段后转移至新的培养容器，并可避免饲养层细胞残留，后者会抑制人iPSC的分化。将人iPSC放回细胞培养孵箱中继续培养。两天后，倾斜培养皿使拟胚体沉降，并小心地将三毫升拟胚体形成培养基替换为四毫升新鲜的基础培养基。10天后，拟胚体将形成。用四毫升0.1%明胶在37摄氏度下孵育30分钟，对一个新的100毫米培养皿进行包被处理。将类胚体连同上清液转移至15毫升锥形管中，静置4到5分钟使类胚体沉降。吸除除最后0.5毫升以外的全部培养基，并将类胚体重悬于10毫升新鲜基础培养基中。待明胶凝固后，弃去明胶。然后将细胞接种到明胶包被的培养皿中，并将培养皿放入细胞培养箱中。培养10天后，类胚体将分化为成纤维细胞样细胞的外生长物。为诱导软骨细胞分化，用DPBS洗涤培养物，并在37摄氏度下用3毫升0.25%的胰蛋白酶EDTA消化5分钟以解离细胞。当细胞从培养板底部脱落时，加入四毫升新鲜基础培养基以中和反应，并轻轻吹打培养物5至10次。用70微米尼龙滤网过滤细胞悬液，通过离心收集细胞。然后将细胞接种至新的明胶包被的100毫米培养皿中，加入10毫升新鲜基础培养基。当细胞培养至90%至100%融合时，用3毫升0.25%胰蛋白酶EDTA消化收集细胞，操作方法如前所述用于计数。将3 × 10⁵个细胞分装至15毫升聚丙烯离心管中进行离心，然后将细胞沉淀重悬于1毫升软骨诱导分化培养基中。然后，再次离心细胞，并将离心管放入细胞培养孵育箱中培养21天，期间不要扰动细胞沉淀。在高密度培养条件下，软骨诱导细胞可能在体外自发聚集，产生特征性的细胞外基质。培养21天后，人诱导多能干细胞（iPS细胞）将形成软骨诱导细胞团。 培养21天后，人iPSC软骨细胞经阿利新蓝和甲苯胺蓝染色呈阳性，表明人iPSC细胞团成功实现了软骨向分化。II型胶原和X型胶原的免疫组织化学分析进一步证实了其软骨细胞样表型。硫酸化糖胺聚糖分析显示，与人iPSC成纤维细胞样细胞、类胚体及未分化的人iPSC细胞相比，人iPSC软骨细胞团中的硫酸化糖胺聚糖含量显著上调。此外，人iPSC软骨细胞表现出软骨祖细胞谱系以及完全分化软骨细胞标志物的高基因表达水平，表明已成功实现软骨向分化。该方法采用多步培养法将人iPSC分化为软骨细胞，包括通过拟胚体（EB）形成进行自发分化、EB细胞迁移生长、细胞贴壁培养后的单层细胞培养，以及三维球体培养。通过组织学分析、生物化学分析和软骨细胞基因表达对软骨细胞表型进行评估。观看本视频后，您应能充分理解如何采用多步培养法诱导人诱导多能干细胞分化为软骨细胞。该技术可能更具患者特异性，且成本效益更高。

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Research

科研

JoVE Journal

Developmental Biology

发育生物学

分化软骨细胞与外周血源性人诱导多能干细胞

本文详细描述了通过选择性调控Wnt信号通路，将人多能干细胞高效分化为心肌细胞的方法，并随后通过流式细胞术分析参考标志物，以评估细胞群体的均一性和身份特征。...

高效率诱导人多能干细胞分化为心肌细胞及通过流式细胞术进行表征

机械应力可诱导干细胞的软骨向分化，为受损软骨的修复提供了一种潜在的治疗策略。本文介绍了一种利用离心重力（CG）诱导脂肪来源干细胞（ASCs）向软骨细胞分化的实验方案。由离心重力诱导的SOX9表达上调可促进软骨向表型的形成。...

通过离心重力诱导脂肪源性干细胞的软骨分化

本文介绍了人类多能干细胞（hPSC）的培养方案，用于将hPSC分化为CD34+造血祖细胞。该方法通过阶段特异性调控经典WNT信号通路，使细胞特异性地定向分化为确定型或原始型造血程序。...

从人多能干细胞定向分化原始和确定型造血祖细胞

本文提出了一种从脐带血单个核细胞来源的人诱导性多能干细胞进行软骨细胞分化的方法。...

由脐带血来源的诱导多能干细胞形成软骨细胞样细胞团

我们提出了一种实验方案，用于诱导多能干细胞来源的角质形成细胞和成纤维细胞的分化，并利用这些角质形成细胞和成纤维细胞构建三维皮肤类器官。该方案包含建立人源化小鼠模型的额外步骤。本文所介绍的技术将有助于推动皮肤科领域的研究进展。...

由脐带血来源的诱导多能干细胞生成三维皮肤类器官

本实验方案的目的是检测来源于人血管周围脂肪组织的前体细胞向多个细胞谱系分化的能力。将这种分化能力与来源于人骨髓的间充质干细胞进行比较，后者已知可分化为脂肪细胞、成骨细胞和软骨细胞谱系。...

人主动脉周围血管脂肪前体细胞的分化潜能

本文介绍了一种在约1周内将人多能干细胞定向分化为生血性内皮细胞的简单方案。...

人多能干细胞向造血内皮细胞的定向分化

本方案描述并比较了两种将人诱导多能干细胞（hiPSCs）分化为间充质基质细胞（MSCs）的代表性方法。单层培养法具有成本较低、操作简便以及更易实现成骨分化的优点；拟胚体（EBs）法的特点是耗时较短。...

人诱导性多能干细胞向间充质基质细胞分化的两种代表性方法的比较

本方案介绍了从诱导性多能干细胞（iPSCs）分化生成人破骨细胞的方法，并描述了破骨细胞及其前体细胞的表征技术。...

由人诱导性多能干细胞分化与鉴定破骨细胞

本方案详细描述了从人关节软骨中分离软骨细胞、纤维连接蛋白黏附实验衍生的软骨祖细胞（FAA-CPs）以及迁移性软骨祖细胞（MCPs）的方法。内容涵盖用于分离和鉴定这些细胞的酶消化、纤维连接蛋白黏附以及基于迁移的实验方法。...

利用纤连蛋白黏附与迁移实验分离软骨细胞和软骨祖细胞

本研究描述了一种通过在低黏附条件下利用重力使细胞聚集形成软骨细胞球体，随后将所得球体在微型生物反应器中进行培养的方法。...

利用重力条件和自制微型生物反应器在低黏附环境下由不同软骨细胞生成球状体

学习利用人外周血细胞来源的诱导多能干细胞分化为软骨细胞的无血清、无异种成分培养方案。该方法通过类胚体形成、成纤维细胞扩增及三维微团培养实现高效软骨发生，为软骨修复提供可重复的患者特异性策略。

从外周血来源的人诱导性多能干细胞分化软骨细胞

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