利用重组腺相关病毒9型系统性递送微小RNA治疗啮齿类动物神经肌肉疾病

本方法的总体目标是利用重组腺相关病毒载体选择并递送一种微小RNA，随后将其递送至小鼠的骨骼肌和运动神经元，并评估其在改善疾病表型方面的有效性。该方法有助于回答一个重要的科学问题：基于微小RNA的沉默策略是否可用于治疗神经肌肉疾病。

该技术的主要优势在于利用腺相关病毒9型通过全身循环将microRNA递送至小鼠的脊髓和骨骼肌，从而直接沉默目标致病基因。将AAV-microRNA质粒储备液分装为每份100至200微升的等分试样，每毫升含十万亿至一百万亿个病毒基因组。接下来，取一份等分试样加入注射器中，并安装一根27至30号针头。

现在，使用标准的小鼠固定器将小鼠固定，使其尾巴暴露出来。然后用70%酒精清洁尾巴，并在尾巴下方放置温热垫约30秒，以促进血管扩张。接着，在尾巴的远端部位，将针头斜面向上、以约15度的浅角度插入尾静脉。

然后，注射病毒，并在拔出针头前等待数秒钟。拔出针头后，用两根手指施加适度压力以止住出血。随后，将动物放回其饲养笼中。

尾静脉注射过程中，针头接头处出现短暂的血液闪现是常见现象。注射时应无阻力。若尾部开始变白并肿胀，应立即拔出针头，并在先前进针位置的近端重新尝试注射。

进行这些测试时，小鼠应超过四周龄，并确保在处理前收集基线数据。测试房间应保持安静、黑暗，避免干扰。在开始任何测试前，至少提前30分钟将小鼠带入房间。

在此适应期间不要打扰动物。从悬线试验开始。抓住小鼠的尾巴，将其放在金属丝网的中央。

然后，将网格抬高15至20英寸，并缓慢翻转屏幕，使小鼠有时间调整抓握。当网格完全倒置后，启动计时器并记录小鼠掉落所需的时间。允许小鼠悬挂60秒；如果提前掉落，则将其放回网格，并重复该操作步骤。

如果小鼠悬挂满60秒，则记录得分为60秒，并将小鼠放回笼中。每只小鼠可尝试三次以达到60秒的悬挂时间。若无法达到，则记录其最长的悬挂时间作为得分。

处死小鼠后，取出脊髓，然后采集股四头肌骨骼肌。为快速冷冻所采集的组织，将不锈钢碗的一半体积装入2-甲基丁烷，并将碗的底部四分之一浸入液氮中。等待两分钟后继续操作。

数分钟后，将样品转移至2-甲基丁烷中。当样品变为白色时，立即将其转移至嵌入干冰的容器中。随后，将样品在-80摄氏度下保存。

用于生化分析和microRNA定量时，将收获的组织置于冻存管中，并在液氮中速冻，随后于-80摄氏度保存。在5周龄时，向SBMA小鼠注射一万亿个基因组的AAV microR-298。

SBMA 小鼠携带含异常扩增的多聚谷氨酰胺 tract 的人源雄激素受体转基因。通常在十周时，它们会表现出神经肌肉疾病的症状。在治疗后的多个时间点采集腰段脊髓和股四头肌用于分析。

定量RT-PCR结果显示，micro-R298在骨骼肌中的表达于8周时达到峰值，在脊髓中的表达于12周时达到峰值。注射后10周，在两种组织中均检测到GFP。GFP表达与运动神经元标志物胆碱乙酰转移酶共定位。

在后续实验中，小鼠在7周龄时被随机注射病毒或对照溶剂，并从注射后开始每周称重并进行行为学检测，持续至40周龄。注射10周后，接受治疗的小鼠开始增重，并表现出运动功能改善。定量实时PCR结果显示，该治疗可降低病变组织中AR转录本的水平。

观看本视频后，您应充分了解如何通过尾静脉注射，利用重组腺相关病毒载体递送microRNA，以及如何开展行为学检测，以评估递送的microRNA在改善小鼠下肢萎缩和肌无力方面的有效性。该技术的应用前景延伸至基因治疗领域，因为安全有效的基因治疗需要将治疗性转基因靶向特异性地传递至目标组织。

当我们意识到由毒性功能获得机制（如SBMA）引起的疾病可通过过表达天然存在的微小RNA来特异性靶向疾病转录本的3'端修复，从而获得益处时，我们首次提出了这一方法的想法。