Name: 微创肌肉植入 (MIME)--一种促进供体细胞介导的肌的新实验技术 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 17 s
Description: 学习微创肌肉植入（MIME）技术，通过将供体肌肉组织嵌入宿主肌肉促进供体细胞介导的肌生成。该方法使用小鼠模型，为肌肉萎缩症治疗提供新途径，具有微创、保留宿主肌肉结构的优势。

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本研究工作得益于再生康复研究与培训联盟（AR3T）提供的试点资助项目以及韦恩州立大学向 JAR 提供的教师启动经费包。AR3T 得到美国国立卫生研究院下属的尤妮斯·肯尼迪·施莱佛国立儿童健康与人类发育研究所（NICHD）、国立神经疾病与卒中研究所（NINDS）和国立生物医学影像与生物工程研究所（NIBIB）的支持，资助编号为 P2CHD086843。本内容仅由作者负责，不代表美国国立卫生研究院的官方观点。

所有涉及活体动物的研究均经美国密歇根州底特律市韦恩州立大学机构动物照护与使用委员会（IACUC）批准，并遵循国家科学院出版社（美国华盛顿特区西北第五大道500号，邮箱285，邮编20055）出版的《实验动物照护与使用指南》（第8版，2011年）。根据批准的IACUC方案，涉及疼痛和/或痛苦的操作均在全身麻醉下进行，麻醉通过吸入异氟烷（1.5 - 5%，根据效果调整）诱导并维持。麻醉深度通过脚趾夹捏无回缩反应，以及无眼睑或触须反应来确认（根据需要增加异氟烷浓度以维持麻醉效果）。由于实验方案具有最小侵入性，因此采用&#34;无菌尖端&#34;技术。动物处于麻醉状态时，向其眼部涂抹凡士林以防止干燥。无需特殊处理，但在接受全身麻醉的操作后24小时内为动物提供饮食凝胶。&#160;由于该操作不涉及手术暴露宿主肌肉、仅限于单侧后肢且不影响正常功能，且已知许多常用镇痛药物会影响肌肉正常再生，因此研究者经IACUC批准可在MIME操作后不给予镇痛处理。&#160;
1. 动物模型
<ol>
	<li>MIME 实验的宿主小鼠
	<ol>
		<li>使用 NSG-GFP 小鼠（8 - 10 周龄，雄性）作为肌肉移植物研究的宿主。 
		注：这些小鼠是同种异体肌肉移植物的理想宿主，因其缺乏成熟的 T 淋巴细胞和 B 淋巴细胞，自然杀伤细胞功能缺失，细胞因子信号传导存在缺陷，并且已被其他研究者用于非肌肉细胞的同种或异种移植14。普遍表达的 GFP 可便于区分宿主来源（GFP+）和供体细胞来源（GFP-）的肌纤维。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>MIME 实验的供体小鼠
	<ol>
		<li>使用 C57BL/6J 小鼠（12 - 16 周龄）作为供体小鼠。 
		注：这些小鼠是合适的供体，因其基因组已完全测序，无已知的骨骼肌病理特征，易于获得且成本较低，且不表达 GFP。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 准备受体肌肉组织
<ol>
	<li>缝合引导缝线并获取供体EDL肌肉
	<ol>
		<li>通过颈椎脱位法处死供体小鼠，并在使用桌面式异氟烷蒸发器（由医用氧气驱动，吸入异氟烷浓度为2-5%，以达到有效麻醉效果）实施全身麻醉后进行开胸操作。</li>
		<li>为暴露EDL肌肉，使用手术剪切开腿部前侧表面的皮肤。在腿部前侧定位胫骨前肌（TA肌肉），将其移除以显露位于其后方的EDL肌肉。将一对镊子的尖端滑入EDL肌肉后方，施加轻柔牵引，观察足趾是否伸展（此现象可确认该肌肉为EDL肌肉）。                                                                                                                                                 &#160;                       &#160; &#160; &#160; &#160; &#160; &#160; &#160; &#160;               
		注意：在获取组织前，应对供体组织区域进行外科无菌准备。</li>
		<li>使用约10 cm长的4-0丝线（编织型、不可吸收、无菌缝线），在EDL肌肉的近端和远端肌腱处各打两个双结，以固定引导缝线。（图1A）。</li>
		<li>切断EDL肌肉的远端肌腱，翻转EDL肌肉，随后切断其近端肌腱。</li>
		<li>将供体EDL肌肉置于盛有小鼠任氏液的培养皿中。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 为 MIME 准备宿主小鼠
<ol>
	<li>麻醉
	<ol>
		<li>使用由医用氧气驱动的台式异氟烷蒸发器，通过吸入异氟烷（1.5 - 5%，根据效果调整）对宿主小鼠实施全身麻醉。</li>
		<li>先在诱导室中诱导麻醉，随后将小鼠转移至鼻罩以维持麻醉状态，在对动物进行其他操作期间持续维持麻醉。麻醉过程中使用等温凝胶加热垫为动物提供保温支持。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>皮肤准备
	<ol>
		<li>为去除动物体毛，将脱毛膏涂抹于左侧后肢前侧表面。右侧后肢作为后续操作的对照肢体。</li>
		<li>脱毛膏作用2分钟。使用浸有磷酸盐缓冲液（PBS）的擦拭巾清除脱毛膏及脱落的毛发。脱毛完成后，依次交替使用聚维酮碘清洗液和70%乙醇擦拭巾各三次，对皮肤进行消毒。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在宿主胫前肌（TA肌）中创建针道
	<ol>
		<li>沿宿主TA肌长轴方向，将一根18号（1英寸长）外科针穿过TA肌中心部位（图1B）。针道应沿TA肌全长以头尾方向穿过肌腹中心（图1B）。 
		注：此步骤的目的是创建一个针道，用于植入供体肌肉组织。将供体组织植入TA肌中心，可能有助于供体组织中的卫星细胞（SCs）迁移，并促进在整个宿主TA肌中进行肌生成。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将供体组织嵌入宿主TA肌的针道中
	<ol>
		<li>当外科针位于宿主TA肌内时，将供体组织一端的引导缝线沿尾头方向穿过外科针的管腔（图1C）。</li>
		<li>在将针沿尾头方向从宿主TA肌中退出的同时，牵引引导缝线，使供体组织穿过针道。</li>
		<li>利用供体组织尾端和头端的引导缝线调整其位置，确保供体组织完全嵌入宿主TA肌内部（图1D）。</li>
		<li>当供体组织位置调整至最佳后，剪除引导缝线，并使用尖头镊子对供体组织的位置进行最后微调。</li>
		<li>通过镊子对合皮肤针孔创口边缘（图1E - F），并用27号外科针尖蘸取兽用组织粘合剂封闭皮肤创口。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 肌肉内注射肌毒素以诱导同步的肌肉变性与再生
<ol>
	<li>在MIME手术后，向宿主胫骨前肌（TA）注射50 - 60 µL的1.2% BaCl2（肌毒素），以诱导宿主肌肉及其内部植入的供体组织发生广泛的肌纤维损伤15。
	<ol>
		<li>在宿主TA肌腹长度方向上的三个位点（近端、中段和远端三分之一处）注射BaCl2。 
		注意：将BaCl2、心脏毒素或notexin等肌毒素注射入骨骼肌，可引起同步的肌纤维损伤，随后启动再生过程16。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 术后动物护理
<ol>
	<li>注射 MIME 和 BaCl2 后，用乙醇清洁宿主小鼠的左后肢，并涂抹一层薄薄的凡士林以保护皮肤。</li>
	<li>完成术后皮肤护理后，将宿主小鼠从鼻罩中取出。</li>
	<li>将小鼠放入无垫料的单独恢复笼中。通过在恢复笼一半底部放置等温凝胶加热垫，为恢复中的动物提供热支持。 
	注意：仅加热一半区域，以便动物在需要时可自行移开远离加热垫。</li>
	<li>待宿主小鼠完全从麻醉中恢复后，将其放回原始笼具中。将动物送回动物饲养设施，直至进行后续实验。每日监测宿主小鼠，直至其达到后续实验条件——例如：MIME 后第 3 天或第 14 天。MIME 操作后，实验人员及兽医人员均需对动物进行监测，主要内容包括评估动物是否精神状态良好、警觉且反应灵敏；同时观察动物是否存在明显的疼痛表现，或在活动、进食、饮水及理毛方面是否存在困难。</li>
</ol>
6. 组织采集
<ol>
	<li>获取宿主肌肉
	<ol>
		<li>通过颈椎脱位和开胸术处死宿主小鼠，操作过程中使用由医用氧气驱动的台式异氟烷蒸气发生器进行全身麻醉（吸入异氟烷；2–5%，根据效果调整）。&#160;研究者亦获得IACUC批准，可在处死前于全身麻醉下采集胫前肌（TA肌肉）。&#160;</li>
		<li>为暴露宿主TA肌肉，使用手术剪剪开腿部前侧皮肤。定位前腿中的TA肌肉，切断其远端肌腱，翻转肌肉并切断近端附着点（见第2.1节）。</li>
		<li>采集左侧（实验侧）和右侧（对照侧）的TA肌肉。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>&#160;快速冷冻所获取的肌肉
	<ol>
		<li>将获取的肌肉置于称量纸上，使用天平称重。</li>
		<li>短暂地将肌肉浸入矿物油中以进行冷冻保护，随后吸去多余油分。</li>
		<li>将肌肉置于铝箔上，通过迅速浸入盛有液氮的杜瓦瓶中实现快速冷冻。将样品转移至标记好的冻存管中，并储存在–80 °C冰箱中以备后续研究。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
7. 组织学研究
<ol>
	<li>冷冻切片肌肉组织以获取连续横截面
	<ol>
		<li>将样品从-80 °C冰箱转移至装有液氮的杜瓦瓶中，随后运至冷冻切片机。</li>
		<li>在冰冻切片机中，每次仅处理一个样本。使用预冷的剃须刀片（刀片存放于冰冻切片机内），在趾长伸肌（TA肌）中段腹侧切割两次，获得厚度约为1–2 mm的肌肉组织片段。保留该片段用于制备冰冻切片，将其余肌肉组织放回原冻存管中。</li>
		<li>使用最佳切割温度（OCT）包埋剂将组织厚片固定于冷冻切片机样本盘上。将样本盘置于样本托上。</li>
		<li>用切片机切取20 µm厚的切片以粗糙化样本表面。将数个20 µm厚的冷冻切片收集到载玻片上用于后续分析。</li>
		<li>如果20 µm切片的质量令人满意，将切片厚度调整为5 µm，并收集若干切片以评估质量。若5 µm切片质量合格，则进行连续切片。每张载玻片收集2–3片，共收集足够3张载玻片的切片数量。</li>
		<li>分别采集每只动物实验组（左侧）和对照组（右侧）的TA肌肉切片。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>研究GFP表达 
	注意：指定一组已制备的切片（第 7.1 节）用于研究肌纤维中的 GFP 表达。
	<ol>
		<li>在切片上滴加约50 µL抗荧光淬灭剂，盖上玻璃盖玻片，用透明指甲油封固盖玻片边缘。</li>
		<li>使用光学显微镜和荧光显微镜（参见 材料表），使用10倍物镜和适合观察GFP的滤光片观察切片。
		<ol>
			<li>采集约15张重叠的视野数字图像，以覆盖胫骨前肌（TA）横截面的整个区域。通过将显微镜从荧光模式切换至相差模式，获取每个视野的相差图像。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>使用合适的成像软件打开图像，该软件应能够拼接单个图像以生成一幅完整的复合图像； 例如，使用 &#34;光融合&#34; 成像软件中“文件”菜单下的选项，如材料清单所列 材料表.</li>
		<li>使用合适的图像分析软件打开GFP荧光图像（例如，ImageJ）。使用 &#34;ROI 工具&#34; 记录每根纤维的平均荧光强度。
		<ol>
			<li>通过取10根表现出高GFP表达且形态正常的肌纤维的平均荧光强度的平均值，计算最大GFP（荧光）强度。通过将每根肌纤维的平均荧光强度除以最大GFP强度再乘以100，计算每根肌纤维的最大GFP强度百分比。按照所示方式，将每块胫骨前肌（TA肌肉）的GFP分析结果制成表格。 图3E.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过免疫荧光标记结蛋白和4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）分别研究肌纤维完整性和肌核定位。 
	注意：将上述制备的一组切片专门用于研究肌纤维中的结蛋白标记。
	<ol>
		<li>用2%多聚甲醛在PBS中固定切片10分钟。用PBS洗涤切片三次。 
		警告：操作多聚甲醛时，请穿戴适当的个人防护装备（PPE）。</li>
		<li>用含0.01% Triton-X100的PBS稀释3%牛血清白蛋白，室温封闭30分钟。此封闭液在下文中称为一抗稀释液。</li>
		<li>将兔抗结蛋白免疫球蛋白 G（IgG）用一抗稀释液按 1:200 比例稀释。</li>
		<li>封闭完成后，将稀释的一抗加入切片中，于约4 °C冰箱内孵育过夜。用含0.1% Triton X-100的PBS缓冲液洗涤切片一次（5分钟）。此后该溶液称为第一种洗涤缓冲液。</li>
		<li>用 PBS 清洗切片 3 次，每次 5 分钟。</li>
		<li>用含0.01% Triton X-100的PBS稀释与红色荧光染料偶联的 goat anti rabbit IgG，配制二抗。</li>
		<li>将稀释的二抗加入切片中，室温（约 23 °C）孵育 60 分钟。</li>
		<li>用第一种洗涤缓冲液洗涤切片一次，每次5分钟。再用PBS洗涤切片三次，每次5分钟。</li>
		<li>DAPI 染色 3 分钟。用 PBS 洗涤切片 3 次，每次 1 分钟。在切片上滴加约 50 µL 抗荧光淬灭封片剂，盖上盖玻片。用透明指甲油封固盖玻片边缘。</li>
		<li>使用光学显微镜和荧光显微镜（参见 材料表），使用10倍物镜和适用于观察红色荧光染料的滤光片，依次观察连续切片。</li>
		<li>采集约15个重叠视野的数字图像，以覆盖TA肌肉的整个横截面。通过切换至适当的滤光片设置，采集每个视野DAPI标记的荧光图像。</li>
		<li>使用合适的成像软件打开并分析图像，具体步骤如 7.2.3 - 7.2.4 所述。 
		注意：观察研究图像，识别哪些肌纤维受损（desmin 阴性），哪些肌纤维出现中央核化（desmin 阳性纤维中 DAPI 标记的细胞核位于内部而非周边），以及切片中哪些区域存在炎症和/或纤维化（DAPI 标记的细胞核密集聚集但缺乏肌纤维的区域）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

作者无竞争性财务利益。

本文介绍了我们实验室开发的一种名为 MIME 的新型实验技术的详细方案，该技术用于将供体肌肉组织植入宿主肌肉组织。此方法改编自一种已证实可有效促进供体细胞介导的宿主肌肉成肌作用的开放式肌肉移植技术9,10,17。
MIME 的目的并非使供体肌肉组织本身植入宿主肌肉（目前我们尚不清楚是否会发生这种情况），而是提供供体干细胞（SCs）的来源，这些细胞可在刺激肌肉再生的条件下促进宿主肌肉的肌生成。我们希望，在 MIME 经过基础研究和临床前研究的优化与验证后，能够为指导临床治疗提供有价值的见解，以增强因肌源性肌肉丧失而受损的骨骼肌的再生能力。
关于如何将 MIME 转化为临床治疗，仍有许多问题尚未解答，例如：我们如何控制供体组织的质量？如何控制对供体组织和细胞的免疫排斥反应？供体组织在提供成肌细胞后是否会被清除，还是会在体内留下纤维化瘢痕？供体和/或受体肌肉的肌纤维类型是否会影响供体细胞介导的成肌作用？哪些肌肉能够实际从 MIME 中获益？&#160;目前，我们正在拓展研究，以评估 MIME 是否安全有效，寻找可增强供体来源成肌作用的辅助治疗方法，并回答上述诸多问题。&#160;
在完成小鼠间同种异体MIME移植实验后，我们的下一步是利用尸体来源的人体组织进行人到小鼠的MIME实验，以评估尸体肌肉组织的成肌潜能。我们预计这些实验将开辟一条新的基础与转化研究方向，涉及来自捐赠者的肌肉组织，这些捐赠者已注册了诸如用于教育的遗体捐赠计划（Body Bequest Program）或用于器官捐献的“生命馈赠计划”（Gift of Life program）等项目。
本文所示的代表性数据表明，在MIME术后14天，存在若干存活的肌纤维，这些肌纤维要么缺乏GFP，要么GFP表达水平较低。我们对这些数据的解释是：GFP阴性的供体卫星细胞参与了宿主肌肉的肌生成过程。本实验的开展旨在为将人类尸体组织植入宿主小鼠肌肉做好前期准备。为了明确证实供体卫星细胞在MIME术后确实参与了宿主肌肉的肌生成，建议植入表达荧光报告基因的供体组织，该报告基因应可与GFP明确区分例如，表达红色荧光蛋白的供体组织移植到GFP+宿主肌肉中）。
该技术主要受限于供体组织中所含干细胞（SCs）的性质。若供体组织中的干细胞具有活力，则该技术有望促进由供体细胞介导的肌生成；而若这些干细胞无活力，则&#160;成肌作用无法发生。然而，由于&#160;SCs 具有很强的韧性，死后约 2 周内仍具有活力，因此在实验目的下，收获后几分钟内植入的供体组织极有可能促进供体细胞介导的肌生成13此外，如上所述，由于整个肌肉组织（包含卫星细胞、成熟肌纤维以及肌肉定居的成纤维细胞）被植入宿主肌肉中，有可能发生纤维化。然而，这一假设需要通过实验加以验证。关于由损伤性收缩、冷冻损伤及实验性肌毒素引起的肌肉损伤的相关文献表明，免疫细胞（主要是巨噬细胞）能够有效清除受损肌纤维的细胞碎片，并重塑细胞外基质。18因此，MIME 和 BaCl 处理后可能发生2 注射后，只要宿主免疫细胞能够接触到退化的供体肌纤维，它们便可清除碎片，仅留下供体的卫星细胞（SCs）。最后，供体来源的肌生成程度取决于嵌入宿主肌肉中的供体肌肉组织的量。若要使宿主肌肉完全由供体细胞来源的肌纤维重新填充，则需要采用X射线或γ射线照射等方法清除宿主肌肉中的卫星细胞，并需重复进行MIME操作。
已有研究表明，通过外科手术暴露宿主肌肉并将供体组织片缝合到宿主肌肉上，可促进供体细胞介导的肌生成9,10,17。这种开放性外科手术方法过去曾被用于追踪肌生成过程，并建立人类肌肉疾病的鼠类模型。MIME 技术的创新之处在于其具有微创性，无需通过外科手术暴露宿主肌肉。这降低了医源性感染的风险以及宿主动物的不适程度，因此在需要时，可在同一宿主肌肉上重复进行 MIME 操作。
我们预计，MIME 技术可能是对目前用于将供体肌肉组织植入宿主小鼠的开放性外科手术方法的一种适宜改进。该技术通过将活检获取的人体肌肉嵌入宿主小鼠肌肉中，有望加速人源化小鼠模型的构建。此外，根据我们从小鼠到小鼠移植的初步数据，我们预计只要供体干细胞（SCs）具有活性，MIME 技术即可有效实现由供体细胞介导的肌生成。最后，经过进一步的测试与验证，我们希望 MIME 技术将有助于开发新的治疗方法，以促进患有肌肉疾病的人体中供体细胞介导的肌生成。
MIME 技术的成功关键在于将供体组织精确地植入宿主肌肉的筋膜腔室（肌外膜）内。只有当供体组织被置于宿主肌肉腔室内时，才能以精确的方式向宿主肌肉提供干细胞（SCs）。如果供体组织被放置在宿主肌肉之外，其后续命运尚不明确。在我们的 MIME 实验模型中，我们选用胫骨前肌（TA 肌）作为宿主肌肉，因为该肌肉位于小腿前外侧，位置表浅且形态显著。TA 肌的大小、走向和解剖位置使其易于在 MIME 操作后确认供体组织是否被正确植入宿主 TA 肌内。本文中，我们提供了实验证据表明，在 MIME 术后 3 天，供体组织仍稳定存在于宿主 TA 肌内；而在术后 14 天，宿主肌肉中已出现由供体细胞介导的肌生成过程。

健康的骨骼肌尽管属于终末分化细胞，但由于存在一类称为卫星细胞（satellite cells, SCs）的组织驻留性成肌细胞，仍具有优异的再生能力1,2；相关研究综述见3,4。然而，在由肌营养不良症、创伤或加速衰老引起的病理条件下，肌肉再生可能无法跟上肌肉分解的速度，从而导致进行性肌纤维丢失5。尽管已开发出有效方法用于从肌肉中分离SCs并在体外扩增以获得大量成肌细胞（继而形成肌管），但将这些细胞移植至宿主肌肉后生成生理相关数量肌纤维的尝试仍收效甚微6。与其他多种细胞类似，当成肌细胞单独注射入宿主组织时，大多数细胞无法成功植入7,8。我们已证明，神经肌肉电刺激（neuromuscular electrical stimulation, NMES）可促进人成肌细胞在再生缺陷型宿主小鼠肌肉中的成肌过程8。其他研究者也发现，通过手术移植带有SCs的活检肌肉或单根肌纤维，即使不使用NMES，也能实现一定程度的成肌，提示移植包含SCs的完整肌纤维可能比单独移植成肌细胞更具优势9,10。由于供体或工程化肌肉组织移植至宿主肌肉中的效果优于单独细胞移植，因此组织或类组织结构可能为供体细胞的植入提供了关键信号；这一概念在涉及多种细胞类型的细胞治疗研究中正变得越来越明确10,11,12。
最近的研究数据表明，从人类尸体死亡后超过两周获取的卫星细胞（SCs）在培养中能够形成肌管13。因此，我们拟评估将死后获取的肌肉组织植入活体宿主体内是否可逆转肌纤维的丢失。我们开发了一种名为MIME的新技术，用于将供体肌肉组织植入活体宿主的骨骼肌组织中，以促进供体细胞来源的肌生成。MIME技术包括：用手术针穿过宿主肌肉以形成针道；将一小段供体肌肉组织经针道拉入宿主肌肉内；使供体组织嵌入宿主肌肉中；并用组织粘合剂封闭针孔。在其他实验中对安乐死小鼠进行技术练习后，我们现已在免疫缺陷且全身性表达绿色荧光蛋白（GFP）的活体小鼠中实施MIME，并在MIME术后3天和14天进行随访观察。MIME术后3天，我们证实将供体小鼠（GFP-）的趾长伸肌（EDL）肌肉植入宿主小鼠（GFP+）的胫前肌（TA）后，供体组织仍稳定嵌于宿主肌肉中。MIME术后14天，在给予氯化钡（BaCl2）肌毒素造成损伤以诱导肌生成后，我们发现单个宿主TA肌肉中约有5%、26%、26%和43%的肌纤维分别表现为无宿主贡献、极少量宿主贡献、中等程度宿主贡献和最大程度宿主贡献。在MIME及肌毒素注射后，约95%的TA肌纤维出现中央核化现象（为变性及继发再生的标志）。
我们在 MIME+BaCl2 处理后第 14 天研究 TA 肌肉，因为该时间点正处于再生的中间阶段，此时大多数再生肌纤维具有中央细胞核。我们使用表达 GFP 的小鼠作为 MIME 的宿主，以便在将来将人尸体来源的肌肉移植到宿主小鼠体内时，能够轻松区分宿主来源和供体来源的肌纤维。我们选用小鼠的 EDL 肌肉作为实验性供体组织，因为来自该肌肉的单个肌纤维显示出比 TA 肌肉更强的成肌潜能9。此外，EDL 肌肉与 TA 肌肉功能协同，且具有相似的纤维类型组成。我们的初步数据表明，MIME 能够促进供体细胞来源的肌生成在宿主肌肉中的发生。

<table><tbody><tr><td>NSG-GFP 小鼠</td><td>The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME)</td><td>Stock #021937</td><td>广泛表达绿色荧光蛋白的免疫缺陷宿主小鼠</td></tr><tr><td>C57BL/6J 小鼠</td><td>The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME)&amp;nbsp;</td><td>Stock #000664</td><td>对照供体小鼠</td></tr><tr><td>台式异氟烷蒸发器&amp;nbsp;</td><td>VetEquip (Livermore, CA)</td><td>Item #901801</td><td>吸入式麻醉系统</td></tr><tr><td>Magic 脱毛膏</td><td>Softsheen Carson (New York, NY)</td><td>N/A</td><td>无须剃须的脱毛乳膏</td></tr><tr><td>4-0 丝线，黑色，编织，不可吸收缝合线</td><td>Roboz Surgical Instrument Co, Inc. (Gaithersburg, MD)</td><td>SUT106631</td><td>用于固定供体组织的引导缝合线</td></tr><tr><td>VetBond 兽用组织粘合剂</td><td>3M (Maplewood, MN)</td><td>Catalog #1469Sb</td><td>用于无缝合皮肤闭合的兽用组织粘合剂</td></tr><tr><td>氯化钡&amp;nbsp;</td><td>Ricca Chemical Company (Arlington, TX)</td><td>Product #R0854000-500A 854-16&amp;nbsp;</td><td>诱导肌肉损伤并促进再生的肌毒素</td></tr><tr><td>Deltaphase 恒温凝胶加热垫&amp;nbsp;</td><td>Braintree Scientific (Braintree, MA)</td><td>&amp;nbsp;Item #39DP</td><td>为麻醉状态下的动物提供热支持的加热垫</td></tr><tr><td>HM525NX 冷冻切片机&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>ThermoFisher (Waltham, MA)</td><td>Catalog #HM525NX&amp;nbsp;</td><td>用于制备肌肉冷冻切片的冷冻切片机</td></tr><tr><td>Vectashield 抗荧光淬灭封片剂</td><td>Vector Laboratories, Inc. (Burlingame, CA)</td><td>Catalog Number: H-1000</td><td>用于保护免疫荧光标记样品中荧光信号的抗荧光淬灭介质</td></tr><tr><td>兔抗结蛋白抗体</td><td>Labvision Thermo Scientific (Fremont, CA)</td><td>RB9014P</td><td>用于结蛋白免疫荧光标记的兔抗结蛋白抗体</td></tr><tr><td>山羊抗兔 Alexa 568 抗体</td><td>ThermoFisher (Waltham, MA)</td><td>Catalog#: A-21069</td><td>用于结蛋白免疫荧光标记的山羊抗兔二抗</td></tr><tr><td>4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）&amp;nbsp;</td><td>Seracare (Milford, MA)</td><td>Catalog #5930-0006 或 71-03-01</td><td>用于细胞核荧光标记的试剂</td></tr><tr><td>Axio Scope.A1 显微镜</td><td>Carl Zeiss (Peabody, MA)&amp;nbsp;</td><td>Product #Axio Scope.A1</td><td>光学与荧光显微镜</td></tr><tr><td>Photoshop CS4</td><td>Adobe Systems (San Jose, CA)</td><td>Photoshop CS4</td><td>用于图像拼接的成像软件</td></tr><tr><td>Image J</td><td>National Institutes of Health (Bethesda, MD)</td><td>Image J for Windows 64-bit Operating System</td><td>用于定量荧光分析的成像软件</td></tr></tbody></table>

微创肌肉嵌合技术（mime）——一种促进供体细胞介导肌生成的新型实验技术

Minimally Invasive Muscle Embedding (MIME) - A Novel Experimental Technique to Facilitate Donor-Cell-Mediated Myogenesis

骨骼肌具有再生能力，这归因于存在于组织中的、可生成肌纤维的（成肌性）卫星细胞（SCs），这些细胞在适当条件下能够形成新的肌纤维。尽管SCs可从肌肉组织中分离并进行培养 体外，将获得的成肌细胞移植到宿主肌肉中时，其促进肌生成的效果并不理想。通过外科手术暴露宿主肌肉，并将供体肌肉组织片段或连同其卫星细胞（SCs）分离的肌纤维移植至宿主肌肉，相比成肌细胞移植能更有效地促进肌生成。我们开发了一种名为微创肌肉嵌入（Minimally Invasive Muscle Embedding, MIME）的新技术。MIME 技术包括用手术针穿过宿主肌肉，将一段供体肌肉组织经针道拉入并嵌入宿主肌肉内，使其作为宿主肌肉中卫星细胞的来源。本文详细描述了在一种全身细胞表达绿色荧光蛋白（green fluorescent protein, GFP）的免疫缺陷小鼠模型中实施 MIME 的具体步骤。宿主小鼠的免疫缺陷可降低供体组织发生免疫排斥的风险，而 GFP 的表达则便于区分宿主来源的肌纤维（GFP+）与供体细胞衍生的肌纤维（GFP-）。我们的初步数据显示，MIME 可用于将供体小鼠的趾长伸肌（extensor digitorum longus, EDL）植入宿主小鼠的胫骨前肌（tibialis anterior, TA）中。数据还表明，当使用肌毒素（氯化钡，BaCl₂）处理宿主肌肉后，MIME 植入的供体组织能够更有效地参与肌纤维再生。2在MIME后将供体细胞注入宿主肌肉，有证据显示宿主肌肉中存在供体细胞来源的肌生成现象，单个宿主胫前肌（TA）中约有5%、26%、26%和43%的肌纤维分别表现为无宿主贡献、宿主贡献极少、中等程度宿主贡献和最大程度宿主贡献。

在MIME术后第3天，通过MIME植入的供体EDL肌肉被容纳于宿主TA肌室内（图2A-C）。正如预期，对供体小鼠TA肌肉横切面在荧光光学下进行观察，未显示绿色荧光，因其不表达GFP（图2D）。相反，未植入供体组织的宿主小鼠TA肌肉横切面中，TA肌纤维呈现均匀的绿色荧光，因为这些纤维表达GFP（图2E）。在通过MIME植入供体肌肉组织的肌肉横切面中，宿主肌纤维（GFP+）与供体肌纤维（GFP-）之间存在一条明显的分界线。图中所示视野的相差图像分别在图2D-F对应的图2E'-F'中展示，提示在无GFP信号的区域确实存在肌纤维。
在注射 MIME 和 BaCl2 后第 14 天，通过研究未标记或使用抗结蛋白抗体标记的胫前肌连续横切面（图 3），我们发现，在来自宿主小鼠的未处理肌肉中，GFP 信号由所有肌纤维表达，但在 MIME 处理的肌肉中则无表达（红色结蛋白标记可检测到存活的肌纤维）。在经 MIME 和 BaCl2 注射处理的宿主胫前肌中，许多结蛋白阳性（desmin+）肌纤维未检测到 GFP 信号，表明供体细胞来源的肌生成明显存在（图 3C-D、3 C'-D'）。由宿主与供体成肌细胞可能融合而形成的嵌合肌纤维可通过这些纤维所表现出的低至中等水平的 GFP 荧光进行检测。大量嵌合纤维出现在整个胫前肌横径范围内，提示供体干细胞能够在宿主肌肉的肌外膜内迁移数百微米。GFP 阳性纤维的定量结果见于 图 3E。图 4 展示了经 MIME 加 BaCl2 处理的整个胫前肌连续横切面的高倍放大图像。
<img alt="大鼠肢体手术；步骤 B-F；器械使用；组织、针头、缝线、麻醉。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55731/55731fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 1"> 
图 1．最小侵入性肌肉嵌植术（Minimally Invasive Muscle Embedding, MIME）的操作步骤。 
MIME 在全身麻醉下进行。操作包括将约 10 mg 的供体肌肉（供体小鼠的趾长伸肌，EDL）置于任氏液中，并在肌肉两端系上引导缝线 (A)。将 18 号针头沿受体肌肉的长轴穿入 (B)，然后将供体组织经由针道拉入肌肉内 (C)。供体组织即留置于受体肌肉中 (D)，剪断引导缝线，并用组织粘合剂封闭针孔 (E)。图中箭头指示已封闭的针刺伤口 (F)。<a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55731/55731fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="小鼠移植手术。显示组织整合的荧光显微镜与组织学图像。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55731/55731fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Figure 2"> 
图2。MIME后3天TA肌肉的研究。 
MIME术后3天采集的宿主肌肉；可见宿主TA肌肉上的针刺痕迹（箭头；A-B）。数据进一步证实，植入的供体小鼠EDL肌肉位于TA肌肉腔室内（B-C）。TA肌肉横切面的荧光图像显示，野生型TA肌肉中无绿色荧光（D），NSG-GFP型TA肌肉中呈现明亮的绿色荧光（E），在MIME术后3天的NSG-GFP型TA肌肉中可区分宿主与供体肌肉（F）。D-F对应视野的相差图像分别显示于D'-F'。图F和F'中的红线表示宿主与供体组织之间的分界线。比例尺 = 50 µm。<a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55731/55731fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="肌肉纤维再生、显微镜下GFP强度分析、荧光成像、细胞研究。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55731/55731fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图3"> 
图3。MIME处理后14天胫骨前肌（TA）的研究。 
展示了MIME处理后14天收集的数据。红色信号来自结蛋白（desmin）的免疫荧光标记（结蛋白阳性信号表明肌纤维具有活性），蓝色信号来自DAPI（标记细胞核），绿色信号来自GFP。在从宿主小鼠取材的对照组TA肌肉（后肢右侧）中，几乎所有的肌纤维均呈结蛋白阳性，表明这些肌纤维具有活性（A；红色信号）。此外，根据DAPI染色结果可见，几乎所有肌纤维的肌核均位于周边位置，符合健康肌肉的特征（A；蓝色信号）。对照组TA肌肉的连续切片显示，几乎所有肌纤维均呈现明亮的绿色荧光，表明其GFP阳性。在MIME联合BaCl2 处理的TA肌肉（后肢左侧）中，可见大量结蛋白阳性（desmin(+)）但无明显GFP荧光的肌纤维，提示供体细胞介导的肌生成作用（C-D, C'-D'）。在整个TA肌肉横径范围内均可见GFP荧光强度由低至中等的结蛋白阳性肌纤维（嵌合肌纤维），表明MIME所提供的供体干细胞可在TA肌肉的肌外膜内迁移，并促进来源于供体细胞的肌生成。 A'-D' 为 A-D 中蓝色框内区域的高倍放大图像。E 显示了GFP阳性纤维和中央细胞核纤维的定量分析结果。比例尺 = 100 µm（A-D）和50 µm（A'-D'）。 <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55731/55731fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="使用对比染色的组织荧光显微镜图像；图A-F；细胞结构分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55731/55731fig4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 4"> 
图 4。注射 MIME 和 BaCl2 后 14 天广泛损伤与再生的证据。 
展示了经 MIME+BaCl2 处理的完整胫骨前肌（TA）肌肉的高倍率连续横切面。数据显示，许多呈中等或强 GFP 阳性的肌纤维具有位于中央的细胞核（A-B；A 中的红色信号来自结蛋白 desmin，A 中的蓝色信号来自 DAPI，B 中的绿色信号来自 GFP）。这些结果表明，注射 BaCl2 后发生的变性与再生过程并未影响 GFP 的表达。在此背景下，经 MIME+BaCl2 处理的 TA 肌肉中存在大量细胞核居中的肌纤维，但其 GFP 表达极少甚至无表达，提示这些纤维很可能是由 GFP 阴性（GFP-）的成肌细胞显著参与所导致的成肌作用（或再生）的结果。这些观察结果可通过所选区域的高倍率图像进一步验证（C-F；C 与 D、E 与 F 分别为连续横切面上的重叠区域；图像边框的颜色编码表示这些区域在 A 和 B 中的位置）。比例尺 = 100 µm（A-B）和 50 µm（C-F）。 <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55731/55731fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>

我们介绍一种新型实验技术，称为微创肌肉嵌合（Minimally Invasive Muscle Embedding, MIME），该技术基于以下证据：骨骼肌组织中含有可存活的成肌细胞，当将其植入宿主肌肉时，可促进由供体细胞介导的成肌作用。

微创肌肉嵌合技术（MIME）——一种促进供体细胞介导肌生成的新型实验技术

骨骼肌具有再生能力，这归因于存在于组织中的、可生成肌纤维的（成肌性）卫星细胞（SCs），这些细胞能够形成新的……

该技术的总体目标是将一小段供体肌肉组织植入宿主肌肉中，以促进由供体细胞介导的肌生成。该方法有助于回答再生肌肉生物学领域的一些关键问题，例如，死后获取的肌肉组织是否能够在宿主肌肉中促进供体细胞介导的肌生成。该技术的主要优势在于其具有最小的侵入性。该技术的应用前景可拓展至非致死性肌营养不良症的治疗，因为肌肉包埋、运动训练与免疫疗法的联合应用或许能够恢复某些受累肌肉的再生能力。作为一名物理治疗师和生物医学工程师，我认为 MIME 手术的微创特性至关重要，因为它在不显著破坏宿主肌肉结构与功能的前提下，为肌源性细胞提供了来源以及天然的组织支架。本次操作将由本实验室研究助理 Morium Begam 女士进行演示。首先，按照文本方案中所述方法处死12至16周龄的C57 black six供体小鼠。使用一把手术剪剪开后肢前侧表面的皮肤。找到胫骨前肌（TA）后，将其移除，以暴露位于TA肌肉后方的趾长伸肌（EDL肌肉）。用镊子尖端轻轻滑入肌肉后方，轻拉以观察脚趾是否伸展，从而确认该肌肉为趾长伸肌（EDL）。确定EDL肌肉后，使用长约10厘米的4-0丝线分段，在远端和近端肌腱上缝制引导缝线。在肌肉近端和远端肌腱的缝线上各打两个双结。切断远端趾长伸肌（EDL）肌腱并翻转肌肉，随后切断近端肌腱以游离肌肉。将获取的EDL肌肉置于盛有小鼠任氏液的培养皿中。根据文本方案，对8至10周龄的雄性NSG-GFP宿主小鼠进行麻醉。在眼睛上涂抹凡士林以防止干燥。为准备皮肤，将脱毛膏涂抹于左侧后肢前侧，静置两分钟。使用 PBS 浸润的擦拭巾去除脱毛膏及毛发。用聚维酮碘溶液和 70% 乙醇擦拭巾交替擦拭三次，以清洁皮肤。为在宿主 TA 肌肉中建立针道，沿肌肉长轴方向将外科针穿过肌肉中心。确保将针头沿趾长伸肌（TA）肌肉的纵轴，以头端至尾端的方向穿过肌腹中心。针头插入后，将引导缝线从供体组织的一端穿入，并沿尾端至头端方向通过手术针的内腔。随后，沿尾端至头端方向将针头从宿主肌肉中退出，以引导供体组织穿过针道。将供体EDL肌肉组织正确放置于受体TA肌肉内，利用供体肌肉尾侧和头侧的引导缝线进行定位。在供体组织嵌入后，剪断引导缝线，并使用尖头镊子进行微调。最后，用镊子闭合肌组织上的针孔切口，并以27号手术针尖涂抹兽用组织粘合剂，封闭肌肉组织上的针孔伤口。在MIME之后，沿肌肉长度方向的近端、中段和远端三分之一处，向宿主TA肌肉的三个位点各注射50至60微升1.2%氯化钡。注射后，用乙醇清洁宿主小鼠的腿部，并涂抹一层薄薄的凡士林以保护皮肤。将小鼠放入无垫料的单独恢复笼中。应在笼子的一半下方放置一个等温凝胶加热垫，为宿主小鼠提供热支持，同时仍允许小鼠移动到未加热的一半区域。完成恢复后，将小鼠放回其原始笼子中。使用一把手术剪刀切开腿部前表面的皮肤。找到胫骨前肌后，切断其远端肌腱并游离该肌肉，再切断近端肌腱以完全释放胫骨前肌。分别采集左侧或经处理侧以及右侧或对照侧的胫骨前肌。将收获的肌肉置于称量纸上，用天平称重。为进行冷冻保护，将肌肉短暂浸入矿物油中，然后吸去多余的油。为快速冷冻肌肉，将其放置在铝箔上，并迅速浸入装有液氮的双层烧瓶中。将冷冻样品转移至已标记的冻存管中。供体组织在宿主肌肉内的精确包埋对于 MIME 实验的成功至关重要。三天后，供体 EDL 肌肉仍植入在宿主 TA 肌肉内，宿主肌肉上仍可见针刺痕迹。此外，供体肌肉的横切面未显示绿色荧光，而宿主肌肉的横切面则显示绿色荧光。在移植肌肉的横切面中，GFP阳性宿主肌纤维与GFP阴性供体肌纤维之间存在清晰的边界。治疗后14天，所有肌纤维及未处理的肌肉均呈GFP阳性，但在经处理的宿主肌肉中则不呈GFP阳性。许多GFP阴性的肌纤维经红色desmin标记显示仍具有活力。这表明MIME可导致供体细胞来源的成肌作用。在TA肌肉中存在嵌合肌纤维，通过其弱至中等强度的荧光检测到，这种荧光可能源于宿主与供体成肌细胞的融合。供体成肌细胞存在于宿主肌肉的整个横截面，表明这些细胞可在肌肉内迁移数百微米。一旦掌握，该技术若操作得当，可在15至20分钟内完成。观看本视频后，您应能充分理解如何利用MIME技术将一段供体肌肉嵌入宿主肌肉，以促进供体细胞介导的肌生成。MIME 技术为我们研究尸体来源的人类肌肉是否能够在宿主小鼠中促进供体细胞介导的肌生成提供了途径。该技术还有助于评估神经肌肉电刺激是否能够增强供体细胞介导的肌生成。此方法还可应用于其他系统，例如通过将人体肌肉活检组织植入宿主动物来构建人类疾病动物模型，以及检测含有成肌细胞的肌肉组织模拟物是否能够促进肌生成。

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医学

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