通过细胞外囊泡/外来体转移乳腺基质上皮细胞和乳腺腔细胞之间的乳腺形成能力

该程序的总体目标是从干细胞中分离干细胞转移细胞外囊泡和外泌体的干细胞。并评估这些纳米颗粒的茎转移能力。meso 可以回答干细胞领域关于反式细胞或囊泡中干细胞衍生物的天气关键问题。

或者外泌体可以将干细胞特性转移到非干细胞。该技术的主要优点是诱导干细胞来源于反式细胞囊泡。外泌体可用于将非干细胞直接重编程为干细胞。

演示该程序的是邮政研究员 LeMonsier，以及外科助理 Pei-Ling、温 Tin 和 Shih-Yin，他们都来自我的实验室。首先将 1 个点接种 2 乘以 10 至第六个非贴壁/间充质乳腺上皮细胞或 NAMECs，每 15 厘米培养皿中加入 12 毫升培养基，在细胞培养箱中培养 4 天。第 4 天，收获用于桌面离心的培养基。

然后将上清液转移到锥形管中，进行第二次台式离心。接下来，将上清液转移到新的超速离心机中，进行超速离心 30 分钟。离心结束时，将上清液转移到新的超速离心管中，然后再次超速离心上清液。

去除上清液，将细胞外囊泡外泌体腭重新悬浮在 PBS 中，进行第三次超速离心。然后，将上颚重新悬浮在新鲜的 PBS 中，并最后一次超速离心细胞颗粒。去除上清液，将细胞外囊泡外泌体腭重新悬浮在 100 微升 PBS 中。

然后，通过二辛可宁酸测定法测量细胞外囊泡悬浮液的蛋白质浓度。浓度应约为 20 至 40 μg/100 μL。为了测量细胞外囊泡和外泌体的浓度和大小，将细胞颗粒稀释至每 100 毫升 PBS 含 2 微克蛋白质。

并通过纳米粒子跟踪分析来分析粒子。为了通过密度梯度纯化外泌体，在第三次超速离心后，将上颚重悬于两毫升 40% 碘克沙醇的 PBS 溶液中。并在细胞悬液中依次添加 2 毫升体积的 30%、20%、10% 和 5% 碘克沙醇。

使用移液管通过密度梯度超速离心分离细胞级分，以在离心结束时收获十个梯度层中的每一个。然后，根据标准方案通过 SDS 页面和 western blot 分析每个级分中外泌体标志物的存在。使用针对适当目标外泌体标记物的抗体。

为了首先用细胞外囊泡和外泌体处理乳腺上皮细胞，将每板的第五次流式分选 epcam hi-CD 49F 低腔乳腺上皮细胞接种到明胶涂层的六孔板上。然后，用每毫升 2 微克 NAMEC 衍生的细胞外囊泡和外显体处理每种细胞培养物。每两天用新鲜的细胞外囊泡和外泌体替换培养培养基，持续 10 天。

在治疗期结束时，将一只 3 周龄的雌性麻醉 57 BL6 小鼠置于仰卧位，并去除中腹部的皮毛。用 70% 的酒精和泊酮碘的三个交替周期对手术部位进行消毒。并沿着腹侧胸腹股沟区域在皮肤上做一个 5 厘米的垂直切口。

交替暴露左右第四乳腺脂肪垫。找到每个脂肪垫中的淋巴结，并去除淋巴结下方的整个腺体 perancama。接下来，使用具有原原体和共体活性的天然酶来分离细胞外的囊泡和外体处理的管腔乳腺上皮细胞。

10 分钟后用 5% FBS 的 PBS 溶液中和酶活性。通过离心收集细胞并丢弃 supernatent。计数后，将细胞稀释至每 15 微升 PBS 浓度的 1 倍 10 至 1 倍至第二倍至 10 至 1 倍至第四个细胞。

并使用配备 100 号针头的 27 升微升玻璃注射器将 15 微升乳腺上皮细胞悬液注射到每个脂肪垫中。然后，用伤口夹闭合皮肤。注射后 8 周，从胸部区域到内部区域穿过皮肤做一个垂直切口，并露出右侧和左侧第四乳腺脂肪垫。

取出第四个乳腺，将脂肪垫铺在单个玻璃显微镜载玻片上。然后，将载玻片转移到化学罩上，并在室温下用牧羊犬固定剂固定垫过夜。第二天早上，用 250 mL 70% 乙醇洗涤样品 15 分钟。

然后加入 250 毫升蒸馏水 5 分钟。蒸馏水洗涤后，在室温下用胭脂红明矾染色脂肪垫过夜。然后在 15 分钟的乙醇升序孵育中脱水。

最后一次脱水后，将样品转移到化学罩中的 zylene 中，直到脂肪垫变得透明。然后，用安装介质安装载玻片，并使用数字载玻片扫描仪以每英寸 2， 400 点的速度对脂肪垫进行成像。分离的囊泡和超速离心机腭的大小通常约为 100 纳米，通过纳米颗粒跟踪分析测量。

此外，对 NAMEC 条件培养基的超速离心馏分进行透射电子显微镜分析，揭示了丰富的膜囊泡的存在。如前所述，在密度梯度分离后，可以在 20% 的碘二氧代级分中检测到外泌体标志物。对与 CFSE 标记的 namic 衍生、细胞外囊泡和外显体交易的人管腔乳腺上皮细胞的流侧 emetric 分析显示，在外泌体处理的培养物中，CFSE 信号高出 10 倍。

表明乳腺上皮细胞对 CFSE 标记的细胞外囊泡和外泌体的特异性摄取。此外，虽然阴性对照、PBS 处理的乳腺上皮细胞不表现出 CFSE 单一性，但也可以通过共聚焦显微镜观察到外泌体处理的细胞摄取 namic 衍生的细胞外囊泡和外泌体的证据。值得注意的是，注射流式分选的 epCAMhi/CD49Flo 管腔乳腺上皮细胞的小鼠的脂肪垫经 NAMEC 衍生的细胞外囊泡和外泌体处理 10 天，获得了形成乳腺的能力。

开发后，这项技术为我们在干细胞生物学领域的研究人员铺平了道路。探讨干细胞衍生的反式细胞和囊泡以及外泌体在再生医学和直接细胞重编程中的应用。