Name: 用天然电泳，凝胶电泳和电解法分析线粒体电子传递链的超复合物 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 37 s
Description: 学习天然电泳结合凝胶内活性检测和电洗脱技术，用于分离和分析线粒体电子传递链超复合物的组装与功能。该方法可保持超复合物的生理完整性，适用于细胞能量代谢和疾病机制研究。

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本工作获得了美国心脏协会创始人分会 [12GRNT12060233] 和罗切斯特大学强儿童研究中心资助。

<ol><li>Lenaz, G., Genova, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Supramolecular+organisation+of+the+mitochondrial+respiratory+chain%3A+a+new+challenge+for+the+mechanism+and+control+of+oxidative+phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Exp+Med+Biol%22%5BJournal%5D)">Supramolecular organisation of the mitochondrial respiratory chain: a new challenge for the mechanism and control of oxidative phosphorylation.</a> Adv Exp Med Biol. 748, 107-144 (2012).</li>
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<li>Beutner, G., Eliseev, R. A., Porter, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Initiation+of+electron+transport+chain+activity+in+the+embryonic+heart+coincides+with+the+activation+of+mitochondrial+complex+1+and+the+formation+of+supercomplexes%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Initiation of electron transport chain activity in the embryonic heart coincides with the activation of mitochondrial complex 1 and the formation of supercomplexes.</a> PloS one. 9 (11), e113330(2014).</li>
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<li>Rosca, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+mitochondria+in+heart+failure%3A+decrease+in+respirasomes+and+oxidative+phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovasc+Res%22%5BJournal%5D)">Cardiac mitochondria in heart failure: decrease in respirasomes and oxidative phosphorylation.</a> Cardiovasc Res. 80 (1), 30-39 (2008).</li>
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<li>Althoff, T., Mills, D. J., Popot, J. L., Kuhlbrandt, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arrangement+of+electron+transport+chain+components+in+bovine+mitochondrial+supercomplex+I1III2IV1%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Arrangement of electron transport chain components in bovine mitochondrial supercomplex I1III2IV1.</a> EMBO J. 30 (22), 4652-4664 (2011).</li>
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<li>Davies, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macromolecular+organization+of+ATP+synthase+and+complex+I+in+whole+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Nat+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Macromolecular organization of ATP synthase and complex I in whole mitochondria.</a> Proc Nat Acad Sci USA. 108 (34), 14121-14126 (2011).</li>
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<li>Wittig, I., Carrozzo, R., Santorelli, F. M., Schagger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+assays+in+high-resolution+clear+native+gels+to+quantify+mitochondrial+complexes+in+human+biopsies+and+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Functional assays in high-resolution clear native gels to quantify mitochondrial complexes in human biopsies and cell lines.</a> Electrophoresis. 28 (21), 3811-3820 (2007).</li>
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<li>Wittig, I., Beckhaus, T., Wumaier, Z., Karas, M., Schagger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+estimation+of+native+proteins+by+blue+native+electrophoresis%3A+principles+and+practical+hints%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Mass estimation of native proteins by blue native electrophoresis: principles and practical hints.</a> Mol Cell Proteomics. 9 (10), 2149-2161 (2010).</li>
<li>Alavian, K. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+uncoupling+channel+within+the+c-subunit+ring+of+the+F1FO+ATP+synthase+is+the+mitochondrial+permeability+transition+pore%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Nat+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">An uncoupling channel within the c-subunit ring of the F1FO ATP synthase is the mitochondrial permeability transition pore.</a> Proc Nat Acad Sci USA. 111 (29), 10580-10585 (2014).</li>
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<li>Zickermann, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+biology.+Mechanistic+insight+from+the+crystal+structure+of+mitochondrial+complex+I%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Structural biology. Mechanistic insight from the crystal structure of mitochondrial complex I.</a> Science. 347 (6217), 44-49 (2015).</li>
<li>Zhu, J., Vinothkumar, K. R., Hirst, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+mammalian+respiratory+complex+I%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structure of mammalian respiratory complex I.</a> Nature. 536 (7616), 354-358 (2016).</li>
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作者无任何利益冲突需要披露。

功能完整的电子传递链（ETC）是线粒体生成ATP所必需的。电子传递链的各复合物能够形成两种类型的超复合物：呼吸体（Cx-I、-III 和 -IV）1 和合成体（Cx-V）2。每个复合物的正确组装对于维持电子传递链的完整性至关重要，而电子传递链以超复合物形式进行组织被认为可提高整体电子传递效率5,22。目前对这些超复合物的组装与解离机制尚不完全清楚，但本文所介绍的实验方案可能有助于更深入地理解这些过程。
研究电子传递链（ETC）组装的主要挑战在于这些蛋白质复合物的尺寸。例如，线粒体呼吸体可能由复合物I（Cx-I，约880 kDa）以及一个或多个复合物III（Cx-III，460 kDa）和复合物IV（Cx-IV，200 kDa，以二聚体形式发挥活性）分子组成，形成分子量约为2,000 kDa的超复合物。此外，复合物V（Cx-V）的分子量约为600 kDa，但已被证明可组装成...

以ATP形式存在的线粒体能量不仅对细胞存活至关重要，也参与调控细胞死亡。通过氧化磷酸化生成ATP需要功能完整的电子传递链（ETC；复合物I至IV）和线粒体ATP合酶（Cx-V）。近期研究表明，这些大型蛋白质复合物会组装成称为呼吸体和合成体的超复合物。1,2分析这些大型复合物和超复合物的组装、动态变化及活性调控具有挑战性。虽然使用氧电极测量耗氧量以及利用分光光度计进行酶活性检测可提供有关电子传递链（ETC）复合物活性的有价值信息，但这些方法无法提供参与的蛋白质复合物或超复合物的存在、大小及亚基组成的相关信息。然而，蓝色及透明天然电泳（分别为BN和CN PAGE）的发展3 已创建一种强大工具，用于揭示这些重要呼吸复合物在生理和病理条件下，其复杂组成与组装/去组装过程，以及超分子结构动态调控方面的关键信息4.
这些复合物组装成更高阶的超复合物，似乎能够调控线粒体的结构与功能5。例如，呼吸体（respirasome）的组装可提高电子传递效率以及线粒体内膜上质子驱动力的生成5。此外，合成体（synthasome）的组装不仅可提高ATP的生成效率以及能量当量向细胞质的转移效率2，还能将线粒体内膜塑造成管状嵴结构6,7。对小鼠胚胎心脏发育过程中超复合物组装的研究表明，心脏中含复合物I（Cx-I）的超复合物的生成始于胚胎第13.5天左右8。其他研究显示，由于衰老或缺血/再灌注损伤，心脏中含复合物I的超复合物含量会下降9,10，或可能在神经退行性疾病的发展过程中发挥作用11。
本方案描述了可用于研究电子传递链（ETC）复合物及超复合物组装与活性的天然凝胶PAGE方法。通过在CN或BN聚丙烯酰胺凝胶中分离蛋白质复合物，可评估线粒体超复合物的近似分子量。CN PAGE还可直接在凝胶中显示所有线粒体复合物的酶活性（即凝胶内活性检测；IGA）12。本研究通过IGA显示呼吸体（respirasomes）的活性，突出Cx-I氧化NADH的能力，并通过IGA检测到由Cx-V的ATP水解活性所揭示的合成体（synthasomes）的存在。含有Cx-I和Cx-V的多种复合物及超复合物也可通过将蛋白质转移至硝酸纤维素膜并进行免疫印迹加以验证。该方法的优势在于，BN或CN PAGE通常根据蛋白质复合物的生理大小和组成进行分离，而转移至膜上后仍可保持条带的原有模式。对BN或CN PAGE中的蛋白质复合物的分析还可采用二维电泳（参见Fiala et al.13 的示例）或蔗糖密度梯度离心14,15。为进一步分析某一特定条带，可将其从BN PAGE中切下，并在天然条件下通过电洗脱纯化该蛋白质复合物中的蛋白质。天然电洗脱可在数小时内完成，相较于蛋白质从凝胶被动扩散至周围缓冲液的方法（如参考文献16所述），可显著缩短处理时间。
总之，这些方法描述了多种可用于进一步表征线粒体膜中高分子量超级复合物的技术途径。

<table><tbody><tr><td>Protean II mini-gel chamber</td><td>Biorad</td><td>1658004</td><td>用于灌注和运行微型凝胶电泳的完整套装</td></tr><tr><td>Protean XL maxi-gel</td><td>Biorad</td><td>1653189</td><td>用于灌注和运行大型凝胶电泳的完整套装</td></tr><tr><td>梯度混合器，Hoefer SG15</td><td>VWR</td><td>95044-704</td><td>用于灌注微型凝胶梯度</td></tr><tr><td>梯度混合器，大型凝胶</td><td>VWR</td><td>GM-100</td><td>用于灌注大型凝胶梯度</td></tr><tr><td>转膜试剂盒</td><td>Biorad</td><td>1703930</td><td>用于将蛋白质湿法转移至膜上的完整套装</td></tr><tr><td>电洗脱仪型号 422</td><td>Biorad</td><td>1652976</td><td>从天然或 SDS-PAGE 凝胶中电洗脱蛋白质</td></tr><tr><td>玻璃板</td><td>Biorad</td><td>1653308</td><td>短板</td></tr><tr><td>玻璃板</td><td>Biorad</td><td>1653312</td><td>间隔板</td></tr><tr><td>玻璃板</td><td>Biorad</td><td>1651823</td><td>内板</td></tr><tr><td>玻璃板</td><td>Biorad</td><td>1651824</td><td>外板</td></tr><tr><td>电源</td><td>Biorad</td><td>1645070</td><td>适用于天然电泳的电源</td></tr><tr><td>ECL-Western&amp;nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>32209</td><td>化学发光底物</td></tr><tr><td>SuperSignal-West Dura</td><td>Thermo Scientific</td><td>34075</td><td>增强型化学发光底物</td></tr><tr><td>胶片/自显影胶片</td><td>GE Health care</td><td>28906845</td><td>用于记录 Western 印迹结果</td></tr><tr><td>胶片处理器 CP1000</td><td>Agfa</td><td>NC0872640</td><td></td></tr><tr><td>Canon Power Shot 640&amp;nbsp;</td><td>Canon</td><td>NA</td><td>用于拍摄凝胶、膜和印迹图像</td></tr><tr><td>Canon Power Shot 640 相机遮光罩&amp;nbsp;</td><td>Canon</td><td></td><td>为在透射光台上拍照提供相机遮光保护</td></tr><tr><td>丙烯酰胺/双丙烯酰胺</td><td>Biorad</td><td>1610148</td><td>40% 预混溶液</td></tr><tr><td>甘氨酸</td><td>Sigma</td><td>G7403</td><td></td></tr><tr><td>SDS（十二烷基硫酸钠）</td><td>Invitrogen</td><td>15525-017</td><td></td></tr><tr><td>Tris 碱</td><td>Sigma</td><td>T1503</td><td>缓冲液</td></tr><tr><td>Tricine</td><td>Sigma</td><td>T0377</td><td></td></tr><tr><td>脱氧胆酸钠</td><td>Sigma</td><td>D66750</td><td>去垢剂</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>E5134</td><td></td></tr><tr><td>蔗糖</td><td>Sigma</td><td>S9378</td><td></td></tr><tr><td>MOPS</td><td>Sigma</td><td>M1254</td><td>缓冲液</td></tr><tr><td>咪唑</td><td>Sigma</td><td>I15513</td><td>缓冲液</td></tr><tr><td>月桂基麦芽糖苷</td><td>Sigma</td><td>D4641</td><td>去垢剂</td></tr><tr><td>Coomassie G250</td><td>Biorad</td><td>161-0406</td><td></td></tr><tr><td>氨基己酸</td><td>Sigma</td><td>O7260</td><td></td></tr><tr><td>Native&amp;nbsp; 分子量标准品</td><td>GE Health care&amp;nbsp;</td><td>17-0445-01</td><td>用于天然电泳的高分子量校准试剂盒</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;货号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;备注&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>NADH</td><td>Sigma</td><td>N4505</td><td></td></tr><tr><td>硝基蓝四氮唑</td><td>Sigma</td><td>N6639</td><td></td></tr><tr><td>Tris HCl</td><td>Sigma</td><td>T3253</td><td></td></tr><tr><td>ATP&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>A2383</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;货号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;备注&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>硝酸铅（Pb(NO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;)&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;）</td><td>Sigma</td><td>228621</td><td></td></tr><tr><td>寡霉素</td><td>Sigma</td><td>O4876</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;货号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;备注&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>丽春红 S</td><td>Sigma</td><td>P3504</td><td></td></tr><tr><td>抗-ATP5A</td><td>Abcam</td><td>ab14748</td><td>ATP合酶亚基ATP5A抗体</td></tr><tr><td>抗-NDUFB6</td><td>Abcam</td><td>ab110244</td><td>复合物I亚基NDUFB6抗体</td></tr><tr><td>抗-VDAC</td><td>Calbiochem</td><td>529534</td><td>VDAC抗体</td></tr><tr><td>ECL HRP标记抗体</td><td>GE Health Care</td><td>NA931V</td><td>ATP5A、NDUFB6和VDAC的二抗</td></tr><tr><td>封闭试剂</td><td>Biorad</td><td>170-6404</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>Sigma</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>氯化钾</td><td>Sigma</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma</td><td>E3889</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;货号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;备注&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>银染试剂盒</td><td>Invitrogen</td><td>LC6070</td><td></td></tr></tbody></table>

利用天然电泳、凝胶内活性检测和电洗脱分析线粒体电子传递链的超复合物

Analyzing Supercomplexes of the Mitochondrial Electron Transport Chain with Native Electrophoresis, In-gel Assays, and Electroelution

线粒体电子传递链（ETC）将多种燃料分解所产生的能量转化为细胞的生物能量货币ATP。ETC由5个巨大的蛋白质复合物组成，这些复合物还可进一步组装成称为呼吸体（C-I、C-III和C-IV）和合成体（C-V）的超复合物，从而提高电子传递和ATP生成的效率。五十多年来，已有多种方法被用于测量ETC功能，但这些方案无法提供有关单个复合物及超复合物组装状态的信息。本方案描述了天然聚丙烯酰胺凝胶电泳（native PAGE）技术，该方法在二十多年前被改良用于研究ETC复合物的结构。天然电泳可将ETC复合物以其有活性的形式分离开来，随后可通过免疫印迹、凝胶内活性检测（IGA）以及电洗脱纯化等方法对这些复合物进行分析。通过将天然PAGE结果与其他线粒体检测方法的结果相结合，可以获得关于ETC活性、其动态组装与解聚过程，以及这些过程如何调控线粒体结构与功能的更全面的认识。本文还将讨论这些技术的局限性。总之，如下所述的天然PAGE结合免疫印迹、IGA和电洗脱技术，是研究线粒体ETC超复合物功能特性与组成成分的一种强有力的方法。

为观察线粒体超复合物，采用从小鼠中 freshly 分离的线粒体17,18。线粒体超复合物对反复冻融循环敏感，可能导致其解体，尽管部分研究人员可能认为此情况尚可接受。若因储存需要必须冷冻，则为确保最佳效果，样品冻融次数不应超过一次。
为了通过蓝非变性凝胶电泳（BN PAGE）观察线粒体电子传递链（ETC）复合物，将分离自心脏线粒体的100 µg蛋白质上样至4-10%的凝胶中（图1A）。在电泳过程中，上样缓冲液和阴极缓冲液中的考马斯亮蓝足以标记蛋白质复合物。超级复合物需经数字方式增强对比度后可见（未显示）。对于CN PAGE，将两份分离线粒体来源的20 µg蛋白质样品上样至3-8%的CN凝胶中并进行分离（图1B）。CN ...

本方案描述了利用天然电泳分离功能性线粒体电子传递链复合物（Cx I-V）及其超复合物的方法，以揭示其组装和结构信息。该天然凝胶可进一步用于免疫印迹、凝胶内活性检测以及通过电洗脱进行纯化，从而对各个复合物进行更深入的表征。

线粒体电子传递链（ETC）将多种燃料分解所产生的能量转化为生物能量货币……

天然电泳结合凝胶内活性检测、免疫印迹以及天然电洗脱的总体目标是保存并分析线粒体超复合物的组装状态。该方法有助于解答线粒体电子传递链中的蛋白质复合物如何根据多种因素（包括生物能量需求以及生理和病理条件）组装成超复合物。该技术的主要优势在于，若操作得当，可在漫长的分离过程中始终维持线粒体超复合物的生理完整性和功能活性。该方法还可用于研究超复合体组装的动力学，以及分析质膜和其他细胞内膜中的蛋白质复合物。进行凝胶内检测时，必须确保所有用于非变性电泳的器具均未被去污剂污染，因为去污剂会导致线粒体超复合体解体。从一块透明的非变性凝胶中切下一至多条泳道，并转移至已标记的容器中。进行复合体-1 活性检测时，将 10 毫升检测缓冲液与 25 毫克氮蓝四唑（nitro blue tetrazolium）以及 100 微升浓度为 10 毫克/毫升的 NADH 混合。将该混合液加入切下的透明天然凝胶条带或目标区域。在摇床中轻轻振荡至少 3 分钟，观察蓝色条带的形成情况。然后，用10至20毫升乙酸溶液固定凝胶，或在5毫摩尔Tris（pH 7.4）中洗涤以终止反应。拍摄照片用于记录。为进行复合物-5检测，从蓝色天然凝胶或透明天然凝胶中获取凝胶、泳道或目标区域。将样品在 10 至 20 毫升检测缓冲液中，于室温下轻柔振荡孵育两小时，缓冲液中可含或不含 5 微克/毫升的寡霉素。孵育结束后，更换为 14 毫升新鲜检测缓冲液。然后依次加入 190 微升 1 摩尔硫酸镁、27.28 毫克硝酸铅、60 毫克 ATP 以及 75 微升寡霉素。在温和振荡条件下孵育，并观察白色沉淀的形成，因为寡霉素处理的凝胶中会出现非复合体5依赖性的条带。使用基于甲醇的固定液固定凝胶，因为酸性溶液会溶解铅沉淀。拍摄结果照片，随后按照文本方案中所述进行蛋白质转膜和免疫印迹分析。电洗脱当天，将烧结板置于每个待用玻璃管的底部。如有必要，可先将玻璃管放入洗脱缓冲液中，再从管内将烧结板推至管底。随后将带有烧结板的玻璃管插入电洗脱仪的模块中。用洗脱缓冲液润湿密封圈，将玻璃管插入到位。确保玻璃管的顶部与密封圈齐平。用堵头封闭空的密封圈。接着，将一个湿润的透析膜帽置于硅胶适配器底部，并用洗脱缓冲液填充适配器。缓慢上下移液缓冲液和适配器，以去除透析膜周围的任何气泡。将充满缓冲液的适配器沿玻璃管下滑至底部。然后，去除玻璃管内凝胶层中出现的所有气泡。用洗脱缓冲液填充每根玻璃管。将切下的BN-PAGE胶带放入玻璃管中。将大块样品切成小块，确保玻璃管内的填充高度约为一厘米。然后将整个模块放入罐中。向槽中加入约 600 毫升冷洗脱缓冲液。确保硅胶适配器帽浸没在缓冲液中。在冷室中进行蛋白洗脱前，先在槽底部放入一个搅拌子，并在 350 伏电压下洗脱四小时。洗脱完成后，将电洗脱装置模块从缓冲液槽中取出，放入水槽或容器中。如果使用了堵头，请将其移除以排空上层缓冲液室。移除每根玻璃管中的缓冲液并弃去。确保硅胶适配器保持原位，且砂芯下方的液体未受扰动或摇晃。然后，小心地将硅胶适配器连同膜帽从玻璃管底部取下。用移液器将硅胶帽内的内容物转移至微量离心管中。用另外 200 微升洗脱缓冲液冲洗硅胶帽，并将其加入微量离心管中。对所有玻璃管重复此步骤。将可重复使用的膜帽置于含有 0.5 毫克/毫升叠氮化钠的洗脱缓冲液中保存，并将其冷藏。通过凝胶内检测法对心脏线粒体中的超复合物进行可视化。透明天然凝胶的泳道用于复合物1和复合物5的凝胶内检测。可通过使用抑制剂（如用于ATP合酶的寡霉素）来评估信号的特异性。凝胶内检测可提供有关蛋白质复合物大小的信息，以及复合物1或复合物5的活性信息，但无法提供其组成信息。蓝色天然凝胶可显示蛋白质复合物的条带，可将其切下用于电洗脱。电洗脱后，所得洗脱液可用于进一步分析，如凝胶内检测、通过天然或变性电泳对洗脱蛋白进行银染，以及蛋白质印迹（Western blotting）。一旦掌握，正确操作下可在三天内完成该技术。这三天包括线粒体分离、过夜大孔径蓝色天然电泳以及免疫印迹。观看本视频后，您将充分理解如何利用天然电泳、胶内活性检测及电洗脱技术来分离和鉴定线粒体超复合物。在进行该实验操作时，必须注意线粒体超复合体较为脆弱，应尽量减少样品的冻融次数。非变性电泳和电洗脱操作应在冰上或低温环境中进行。这些技术的意义不仅限于确定每种超复合物的物理组成。由于超复合物是以其天然形式被捕获的，因此可以进行功能测定。该技术建立后，为线粒体生物学领域的研究人员重新评估线粒体电子传递活性及其对线粒体疾病患者的影响铺平了道路。采用此方法后，还可进行高效液相色谱（HPLC）、质谱分析、电子显微镜观察或膜片钳等其他方法，以进一步探究所分离蛋白质复合物的分子组成、结构或电生理特性等其他问题。

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用天然电泳，凝胶电泳和电解法分析线粒体电子传递链的超复合物

在本视频中，我们将向您展示如何利用凝胶内活性检测方法分析人类胚胎干细胞线粒体呼吸链复合物。...

检测人类胚胎干细胞中线粒体复合物的活性

在本视频中，我们演示了一种称为蓝色天然PAGE的电泳技术，用于分析线粒体呼吸蛋白复合物在其天然折叠且功能活性状态下的情况。阴离子考马斯亮蓝染料使蛋白复合物带负电荷，从而能够基于其大小和结构进行分离。...

蓝非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳：一种用于分析完整线粒体呼吸链复合物的非变性分离技术

本方案展示了通过蓝色天然聚丙烯酰胺凝胶电泳分析线粒体呼吸链复合物的方法。此处描述的是应用于培养的人源细胞的实验方法。...

利用蓝色天然聚丙烯酰胺凝胶电泳与免疫印迹法分析培养的人类细胞中线粒体呼吸链复合物

本文介绍一种提取、分离和鉴定线粒体超复合体的方案，该方案最大限度地减少了去垢剂和考马斯亮蓝的使用。此方法在分辨率与酶活性保持之间实现了最佳平衡，同时降低了不稳定蛋白质-蛋白质相互作用丢失的风险。...

用于分离与分析线粒体呼吸链超复合物的混合型透明/蓝色天然电泳

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酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）线粒体基因组表达产物的标记与可视化

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裂殖酵母Schizosaccharomyces pombe中线粒体呼吸链蛋白的表达及复合物组装分析

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学习天然电泳结合凝胶内活性检测和电洗脱技术，用于分离和分析线粒体电子传递链超复合物的组装与功能。该方法可保持超复合物的生理完整性，适用于细胞能量代谢和疾病机制研究。

利用天然电泳、凝胶内活性检测和电洗脱分析线粒体电子传递链的超复合物

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