Analyzing Supercomplexes of the Mitochondrial Electron Transport Chain with Native Electrophoresis, In-gel Assays, and Electroelution

天然电泳与凝胶内检测、免疫印迹和天然电洗脱相结合的总体目标是保存和分析线粒体超复合物的组装。这种方法可以帮助回答线粒体电子传递链的蛋白质复合物如何根据许多因素组装成超复合物，包括生物能量需求以及生理和病理条件。该技术的主要优点是，如果作得当，线粒体超复合物的生理完整性和功能在整个漫长的分离过程中得以保留。

该方法还可用于研究超复合物组装的动力学，并分析质膜以及其他细胞内膜中的蛋白质复合物。在准备凝胶内分析时，用于非变性电泳的所有部分不被去污剂污染绝对至关重要，因为它们会导致线粒体超复合物的分解。从透明的天然凝胶上切下一个或多个泳道，并将其转移到标记的容器中。

要进行 complex-1 测定，请将 10 毫升测定缓冲液与 25 毫克硝基蓝四唑和 100 微升 10 毫克/毫升 NADH 混合。将其添加到切除的透明天然凝胶泳道或感兴趣的区域。在摇杆上轻轻搅动至少三分钟后，跟踪蓝色条带的发展。

然后，将凝胶固定在 10 至 20 毫升乙酸溶液中，或在 5 毫摩尔的 Tris pH 7.4 中洗涤以终止反应。拍摄照片以供记录。要进行 complex-5 检测，请从蓝色天然或透明天然凝胶中获得凝胶、泳道或感兴趣区域。

在室温下，在 10 至 20 mL 检测缓冲液中轻轻搅拌孵育样品 2 小时，每毫升寡霉素加注或减 5 μg。孵育后，用 14 mL 新鲜的检测缓冲液替换缓冲液。然后依次加入 190 微升 1 摩尔硫酸镁、27.28 毫克硝酸铅、60 毫克 ATP 和 75 微升寡霉素。

搅拌孵育并观察白色沉淀，因为寡霉素处理的凝胶上的条带将产生非复合物 5 依赖性条带。将凝胶固定在甲醇基固定剂中，因为酸性溶液会溶解铅沉淀物。拍摄结果，然后进行蛋白质转移和免疫印迹，如文本方案中所述。

在电洗脱当天，在每个要使用的玻璃管底部放置一个筛板。如有必要，将玻璃管放入洗脱缓冲液中，并将筛板从内部推到管底部。将带有筛板的玻璃管推入电洗脱仪的模块中。

用洗脱缓冲液润湿垫圈，然后将玻璃管滑入到位。确保玻璃管的顶部与索环齐平。用塞子关闭空索环。

接下来，将湿膜盖放在硅胶接头的底部，并在接头中加入洗脱缓冲液。缓慢上下移液缓冲液和接头，以去除透析膜周围的气泡。将装满缓冲液的适配器滑到玻璃管底部。

然后，去除玻璃管内筛板上出现的所有气泡。用洗脱缓冲液填充每个玻璃管。将 BN-PAGE 的切除条带放入玻璃管中。

将大块切成小块。确保玻璃管内的填充高度约为 1 厘米。然后，将整个模块放入水箱中。

向槽中加入约 600 mL 的冷洗脱缓冲液。确保硅胶适配器盖浸入缓冲液中。在冷藏室中以 350 伏电压洗脱蛋白质之前，在槽底部放置一个搅拌棒 4 小时。

洗脱完成后，从缓冲液槽中取出 Electro-Eluter 模块，并将其放入水槽或碗中。如果使用了塞子，请将其取下以排空上缓冲液室。从每个玻璃管中取出缓冲液并丢弃。

确保硅胶适配器保持在原位，并且筛板下方的液体不会受到干扰或摇晃。然后，小心地取下硅胶适配器以及玻璃管底部的膜盖。将硅胶帽的内容物移液到微管中。

再加入 200 μL 洗脱缓冲液，冲洗硅胶帽并加入微管中。对所有玻璃管重复此过程。将可重复使用的膜帽放入含有 0.5 毫克/毫升叠氮化钠的洗脱缓冲液中，以保存可重复使用的膜帽，然后冷藏。

来自心脏线粒体的超复合物在这里通过凝胶内测定可视化。透明天然凝胶的泳道用于复合物 1 和复合物 5 的凝胶内测定。信号的特异性可以通过使用抑制剂来评估，例如针对 ATP 合酶的寡霉素。

凝胶内检测提供有关蛋白质复合物大小的信息，具有复合物 1 或复合物 5 活性，但不提供有关其组成的信息。蓝色天然凝胶显示可切除用于电洗脱的蛋白质复合物条带。电洗脱后，洗脱液用于进一步分析，如凝胶内测定、通过非变性或变性电泳对洗脱的蛋白质进行银染以及蛋白质印迹。

一旦掌握，如果执行得当，这项技术可以在三天内完成。这三天包括分离线粒体、进行过夜蓝色天然 maxi 电泳和免疫印迹。观看此视频后，您应该对如何使用非变性电泳、凝胶内检测和电洗脱分离和鉴定线粒体超复合物有很好的了解。

在尝试此程序时，重要的是要记住线粒体超复合物很脆弱。样品的冻融应保持在最低限度。非变性电泳和电洗脱应在冰上或冷藏室中进行。

这些技术的含义超出了定义每个超复合体的物理组成。由于超复合物以其天然形式捕获，因此可以进行功能测定。开发后，这项技术为线粒体生物学领域的研究人员重新评估对线粒体电子传递活动及其对线粒体疾病患者的影响的理解铺平了道路。

在此程序之后，可以执行其他方法，如 HPLC、质谱、电子显微镜或膜片钳，以回答其他问题，例如分离的蛋白质复合物的分子组成、结构或电生理特性。