DiI Perfusion as a Method for Vascular Visualization in Ambystoma mexicanum

该程序的总体目标是可视化蝾螈的脉管系统。这种方法可以帮助回答再生医学领域关于蝾螈再生组织血运重建复杂性的关键问题。这种血管可视化技术的主要优点是，动物体内的所有血管都可以在标准荧光显微镜上轻松成像。

虽然这种方法可以提供对蝾螈肢体再生的见解，但它也可以应用于其他组织，例如尾巴、心脏、眼睛、鳃或其他器官。在打开蝾螈胸之前，首先通过捏住脚趾来确认适当的镇静水平。然后，使用手术钳沿胸部中轴捏住皮肤，就在肩线下方。

使用手术刀，在皮肤被拉起的地方做一个切口，然后去除胸部的一块方形皮肤，露出两个软骨板。接下来，在胸腔上方打开一个窗口，小心地撕裂结缔组织，不要切开任何主要血管。使用镊子单独提起每个软骨板，用手术剪刀切除每个软骨板。

用镊子小心地捏住暴露的心包。将组织拉起并用手术剪刀刺穿，深度足以在不伤害心脏的情况下去除心包。然后，轻轻地取出心包，露出心脏和主动脉，以清楚地看到心脏在主动脉约 5 毫米处，从心脏分支出来。

要灌注蝾螈，请在聚苯乙烯泡沫框架旁边放置一个带有加载的蝶针的夹架，以便轻松纵夹臂以插入针头。打开蠕动泵，通过泵管冲洗 0.7x PBS，并将针尖指向喙部。将镊子滑到主动脉弓下方并稍微向上拉。

然后，纵针夹组合，使针头沿着主动脉的长度向动物头部延伸，并将针头插入主动脉约 5 毫米，将镊子保持在主动脉后面以提供支撑。心脏心房的明显扩大可以确认插入成功。快速撕裂一个心房并让血液排出。

然后，用大约 20 至 30 毫升的 PBS 灌注蝾螈。成功灌注后，动物的颜色应从浅粉色变为白色。灌注所有 PBS 后，暂停蠕动泵并将管路的自由端移入 15 mL的 Dil 溶液管中。

重新启动泵，注意避免在管道中产生气泡，并将整个工作 Dil 原液灌注给动物。在成功的灌注中，蝾螈会变成亮粉色，在鳃中最为明显。当所有 Dil 都灌注完后，暂停泵并将管路的自由端放入 4% 多聚甲醛溶液中。

然后，重新启动泵并灌注至少 10 毫升固定剂。施用完所有多聚甲醛后，停止泵并取出针头。将蝾螈转移到塑料培养皿上，然后将培养皿放在荧光显微镜载物台上。

然后，在灯光关闭的情况下，选择一个允许激发 Dil 的过滤器，Dil 会发出红色橙色的光。成功灌注后，Dil 染色在所有蝾螈组织中都显示为红色入院信号，包括尾巴、四肢、鳃和眼睛。一旦掌握，如果执行得当，这项技术可以在一小时内完成。

在尝试此程序时，请务必记住在打开胸腔时注意不要撕裂主要血管或心脏，并将针头插入与主动脉对齐的位置，以防止穿刺。按照这个程序，可以执行其他方法，如骨骼准备来回答其他问题。经过开发，这项技术为生物医学领域的研究人员探索不同物种的脉管系统铺平了道路。

看完这个视频后，您应该对如何使用羰花青染料 Dil 进行蝾螈的心脏灌注有很好的了解。不要忘记，使用针头和多聚甲醛可能非常危险，并且在执行手术时应始终采取预防措施，例如佩戴适当的个人防护设备。