Name: DiI灌注作为血管可视化的方法墨西哥恶性肿瘤 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-16T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 5 s
Description: 学习使用DiI灌注技术可视化墨西哥钝口螈（Ambystoma mexicanum）的血管系统。该方法通过荧光显微镜成像，帮助研究人员深入理解再生医学中的血管再生机制，适用于肢体、尾部、心脏等多种组织的再生研究。

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这项研究由布莱根医院支持 &amp;#38; 妇女医院以及“出生希望”基金会。作者谨向惠特德实验室的所有成员致以感谢，感谢他们的支持与建议。

所有墨西哥钝口螈实验均依照布莱根妇女医院（BWH）机构动物护理与使用委员会的规定进行。
1. 设置灌注实验
<ol>
	<li>将一只成年墨西哥钝口螈放入盛有0.1%三卡因溶液（MS222）的塑料容器中，麻醉15-20分钟，或直至完全麻醉。确保容器中三卡因溶液的量足以完全浸没墨西哥钝口螈。 
	注意：所有操作必须遵循机构动物护理指南。在BWH，当墨西哥钝口螈对足部夹捏测试无反应时，即认为已完全麻醉，这意味着轻捏足部时无反射性运动。 
	警告：尽管三卡因是专用于水生生物的麻醉剂，但仍应避免皮肤直接接触三卡因溶液。</li>
	<li>设置墨西哥钝口螈灌注工作站。
	<ol>
		<li>将吸水垫放置在平坦、水平的表面上，吸水面朝上。</li>
		<li>在聚苯乙烯泡沫框架上切割一个合适大小和形状的孔洞，使麻醉后的墨西哥钝口螈能够仰卧其中。将框架放在吸水垫上。 
		注意：可在框架正下方额外放置一些纸巾以增强吸水性。</li>
		<li>将灌注管路安装到蠕动泵上。将泵设置为0.7 ml/min的流速，顺时针方向流动。</li>
		<li>用0.7x PBS和5%葡萄糖按1:4的比例配制稀释液。</li>
		<li>在50 mL锥形管中，将10 mL稀释液与200 µL DiI储备液混合。盖紧后通过倒置混匀。用铝箔纸包裹该管，以避免工作液暴露于光线下。 
		注意：体积应根据墨西哥钝口螈的大小按比例调整。上述数值适用于体长（吻至尾）约15 cm的个体。此体型的动物可能尚未达到完全性成熟，因此此时可能无法确定性别。</li>
		<li>用0.7x PBS填充一个50 mL锥形管。 
		注意：PBS将用于预冲管路循环以及墨西哥钝口螈的放血。</li>
		<li>将27号蝶形针连接至灌注管路的出口端。将蝶形针的两翼折叠在一起，并固定在夹具支架上。</li>
		<li>将灌注管路的自由端放入装有0.7x PBS的50 mL锥形管中，启动灌注泵，直至整段管路充满液体。当整个管路充满PBS后暂停泵。 
		注意：务必始终保持管路中无气泡，因为气泡会导致墨西哥钝口螈发生空气栓塞，从而阻碍完全灌注。</li>
		<li>在聚苯乙烯泡沫框架的墨西哥钝口螈形状模具中放置一张纸巾。使用移液管将三卡因溶液浸湿纸巾。 
		注意：在纸巾中央剪一个小方孔，以便在灌注过程中排出液体。</li>
		<li>将麻醉后的墨西哥钝口螈仰卧放置于聚苯乙烯泡沫框架内的纸巾上。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 打开蝾螈胸腔
<ol>
	<li>使用手术镊夹住蝾螈胸部中央轴线处的皮肤，位置略低于肩线，然后向上提起。</li>
	<li>用手术刀在被提起的皮肤处做一个小切口。</li>
	<li>切除胸部的一块方形皮肤，以暴露两块软骨板。
	<ol>
		<li>去除皮肤，打开一个足够大的胸腔窗口，以便清晰观察心脏以及从心脏分出的大约 5 mm 的主动脉。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用镊子或闭合的剪刀小心撕开结缔组织，以避免切断任何主要血管。</li>
	<li>用镊子逐个提起每一块软骨板，并用手术剪将其切除。</li>
	<li>用镊子轻轻夹住心包膜，向上提起，然后用手术剪刺破心包膜；切口深度应刚好足以刺穿极薄的心包膜，且切口大小应足以取出心包膜。注意不要剪到心脏。</li>
	<li>小心地去除心包膜，以暴露心脏和主动脉。 
	注意：使用移液管定期用三卡因溶液冲洗胸腔和鳃部，以保持操作区域清洁，并维持蝾螈的麻醉状态。</li>
</ol>
3. 墨西哥钝口螈的灌注
<ol>
	<li>将装有蝶形针头的铁架台放置在聚苯乙烯泡沫框架旁边，使铁架台的臂部能够轻松操作，以便将针头插入蝾螈主动脉。插入时，针尖应朝向动物的头侧，并保持针头与主动脉平行，以避免穿透对侧血管壁。</li>
	<li>打开蠕动泵。0.7x PBS 应持续流经管路。</li>
	<li>将针头插入主动脉。
	<ol>
		<li>将镊子滑至主动脉弓下方，轻轻向上提起，以便获得良好的操作空间。</li>
		<li>调整针头与夹具的位置，使针头沿主动脉长轴方向行进，指向头部。在插入针头时，用镊子在主动脉后方提供支撑。 
		注意：针头应插入主动脉足够深度，以确保灌注过程中不会滑脱。对于一条15 cm的蝾螈，插入深度约为5 mm。务必使针头与主动脉完全对齐，避免贯穿性穿刺。贯穿性穿刺可能导致大出血，并降低灌注成功率。成功插入的标志是可见心脏心房明显扩张。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>迅速用剪刀划开一侧心房，使血液流出。
	<ol>
		<li>用三卡因溶液冲洗，防止血液在胸腔内积聚和形成血凝块。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用约20–30 mL PBS对蝾螈进行灌注。 成功的灌注会使动物体色由浅粉色变为白色。</li>
	<li>暂停蠕动泵，将管路的自由端移入盛有15 mL DiI溶液的离心管中。重新启动泵，注意避免在管路中产生气泡。</li>
	<li>用全部配制好的DiI工作液对蝾螈进行灌注。 
	注意：在成功的灌注中，蝾螈体色将变为DiI特有的亮粉色，这一变化在鳃部最为明显。</li>
	<li>完成DiI灌注后暂停泵，将管路自由端放入4%多聚甲醛（PFA）溶液中以固定组织。重新启动泵，至少灌注10 mL PFA。 
	警示：PFA具有毒性，应妥善操作和处理。操作时需佩戴手套和护目镜，并在通风橱内配制溶液。使用PFA对蝾螈进行灌注以固定组织将导致动物死亡。</li>
</ol>
4. 结束灌注并进行可视化准备
<ol>
	<li>停止蠕动泵，并将针头从蝾螈主动脉中取出。</li>
	<li>将蝾螈放置在塑料板上。 
	注意：使用一个大号培养皿的一半效果较好，可向蝾螈上倒入少量三卡因（Tricaine）或磷酸盐缓冲液（PBS），以保持其皮肤湿润并提高观察质量。</li>
	<li>将所有使用过的材料丢弃至相应的废物容器中。手术器械先用70%乙醇清洗，动物之间用玻璃珠灭菌器进行消毒，实验结束后通过高压灭菌法进行灭菌。用PBS溶液冲洗管路，然后排空、完全干燥并妥善保存以备后续使用。</li>
</ol>
5. 观察灌注的墨西哥钝口螈
<ol>
	<li>将墨西哥钝口螈置于荧光共聚焦显微镜下。</li>
	<li>关闭灯光，因为光照会妨碍对DiI染色血管的观察。</li>
	<li>使用绿色荧光发射滤光片组（例如 使用共聚焦显微镜观察蝾螈血管系统时，采用ET-CY3染料，并用波长为545 nm的激发光。 
	注意：为获得高质量图像，可采用以下参数：曝光时间1.1 s，增益1x，饱和度1.0，放大倍数2X。</li>
</ol>

<ol><li>Giuvarasteanu, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scanning+electron+microscopy+of+vascular+corrosion+casts+-+standard+method+for+studying+microvessels%5BTitle%5D)+AND+%22Rom+J+Morphol+Embryo%22%5BJournal%5D)">Scanning electron microscopy of vascular corrosion casts - standard method for studying microvessels.</a> Rom J Morphol Embryo. 48 (3), 257-261 (2007).</li>
<li>Hasan, M. R., Herz, J., Hermann, D. M., Doeppner, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravascular+perfusion+of+carbon+black+ink+allows+reliable+visualization+of+cerebral+vessels%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Intravascular perfusion of carbon black ink allows reliable visualization of cerebral vessels.</a> J Vis Exp. (71), e4374(2013).</li>
<li>Minnich, B., Lametschwandtner, A. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23328838"> Scanning electron microscopy and vascular corrosion casting for the characterization of microvascular networks in human and animal tissues.</a> Microscopy: Science, Technology, Applications, and Education. 1, 29-39 (2010).</li>
<li>Honig, M., Hume, R. I. <a target="_blank" href="http://www.formatex.info/microscopy4/29-39.pdf"> DiI and DiO: versatile fluorescent dyes for neuronal labelling and pathway tracing.</a> Trends Neurosci. 13, 333-335 (1989).</li>
<li>Honig, M. G., Hume, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+carbocyanine+dyes+allow+living+neurons+of+identified+origin+to+be+studied+in+long-term+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Fluorescent carbocyanine dyes allow living neurons of identified origin to be studied in long-term cultures.</a> J Cell Biol. 103 (1), 171-187 (1986).</li>
<li>Schwartz, M., Agranoff, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Outgrowth+and+maintenance+of+neurites+from+cultured+goldfish+retinal+ganglion+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Outgrowth and maintenance of neurites from cultured goldfish retinal ganglion cells.</a> Brain Res. 206 (2), 331-343 (1981).</li>
<li>Li, Y., Song, Y., Zhao, L., Gaidosh, G., Laties, A. M., Wen, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+labeling+and+visualization+of+blood+vessels+with+lipophilic+carbocyanine+dye+DiI%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Direct labeling and visualization of blood vessels with lipophilic carbocyanine dye DiI.</a> Nat Protoc. 3 (11), 1703-1708 (2008).</li>
<li>Kuo, T. H., Kowalko, J. E., DiTommaso, T., Nyambi, M., Montoro, D. T., Essner, J. J., Whited, J. L. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4895330/">Evidence of TALEN-mediated gene editing of an endogenous locus in axolotl.</a> Regeneration. 2 (1), 37-43 (2015).</li>
<li>Brockes, J. P., Kumar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Appendage+Regeneration+in+Adult+Vertebrates+and+Implications+for+Regenerative+Medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Appendage Regeneration in Adult Vertebrates and Implications for Regenerative Medicine.</a> Science. 310 (5756), 1919-1923 (2005).</li>
<li>Smith, A. R., Wolpert, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nerves+and+angiogenesis+in+amphibian+limb+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Nerves and angiogenesis in amphibian limb regeneration.</a> Nature. 257 (5523), 224-225 (1975).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

通过使用亲脂性羰花青染料DiI灌注，可成功实现墨西哥钝口螈血管系统的可视化。在本研究中，我们描述了一种利用蠕动泵对墨西哥钝口螈进行DiI灌注的新型实验方案。我们还展示了随后使用荧光共聚焦显微镜观察墨西哥钝口螈血管系统的方法。本方案借鉴了Li et al.7中报道的大鼠DiI灌注方案，但由于大鼠与墨西哥钝口螈之间存在显著差异，因此需对该方案进行修改，以适用于墨西哥钝口螈模型。
本研究介绍了一种通过DiI灌注来成功可视化墨西哥钝口螈血管系统的方法。由于蝾螈与啮齿类动物在解剖结构和生理特性上存在差异，因此在灌注过程的关键环节——包括穿刺针插入位置、灌注方式以及所用试剂等方面，均需进行相应调整。为了实现成功的灌注，我们尽量减少了对墨西哥钝口螈血管系统的损伤。在打开胸腔时，操作需谨慎，以充分暴露心脏和主动脉，同时避免对主要血管造成任何损伤或撕裂。限制手术剪的使用可防止意外剪切大血管，而小切口则有助于控制心脏和主动脉的暴露程度。当将DiI注射针经由主动脉而非直接插入心腔进行灌注时，灌注成功率显著提高。与小鼠不同，墨西哥钝口螈具有...

血管系统的可视化在理解多种生物体的结构与功能方面起着至关重要的作用。自16世纪起th 自列奥纳多·达·芬奇以来的几个世纪中，循环系统的模型与图形表征一直被研究1使用石蜡和橡胶模具对组织进行灌注，以构建血管系统的三维模型，从而可用于器官发生和发病机制的研究1,2树脂和蜡可用染料（如印度墨水或胭脂红）染色，以便于观察1,2然而，这些技术引发了许多问题，因为其高黏度阻碍了对目标组织的充分灌注1随着该领域的发展日益成熟，共聚焦显微镜和电子显微镜的应用逐渐普及，使得灌注技术从铸型模具转向血管系统的液体灌注，其中一些方法能够在不破坏原始组织的情况下实现血管的灌注与成像3DiI 是一种荧光碳菁染料，此类染料可实现动物灌注，且不会损伤血管组织。
碳菁类染料是一类脂溶性染料，接触后可嵌入细胞膜中。这类染料能够简便且即时地对血管内皮细胞进行染色，随后可在荧光共聚焦显微镜下观察。DiI 可通过细胞脂质膜中的侧向扩散进行移动，这一点已在神经元的标记与示踪研究中得到证实4。从化学结构上看，DiI 的两条烷基链赋予该染料对细胞膜的高亲和力，而其两个共轭环则构成荧光发色团，在绿色荧光滤光片激发下可发射红光波长4。DiI 已被广泛应用于多种研究场景，包括对细胞质膜的成功标记以及神经元的顺行性和逆行性标记5,6。此前，DiI 也已在灌注实验方案中用于小鼠血管系统的可视化研究7。
墨西哥钝口螈（Ambystoma mexicanum）是一种仅生活于墨西哥墨西哥城附近咸水湖中的蝾螈。由于成年个体能够再生完整的四肢、尾部（包括神经索）、部分心脏及其他内脏器官，以及部分眼部组织，这类动物已成为研究再生过程的重要模型8,9。此外，随着遗传学工具在墨西哥钝口螈中的最新应用，人们现在能够以前所未有的深度探究驱动这些再生过程的分子与细胞机制8。完整肢体的再生需要经历广泛的再血管化过程，该过程可能在再生中发挥超出血管传统功能（如提供氧气和营养）的重要作用。因此，理解组织再生背景下的再血管化过程至关重要。此前已有研究使用印度墨水对墨西哥钝口螈的血管进行可视化观察，尽管结果引人注目，但该方法在随后数十年间未被进一步探索10。我们尝试将一种原本为哺乳动物设计的DiI灌注方案进行改良，以实现对墨西哥钝口螈整个血管系统的完整灌注与可视化7。本方案详细描述了成功实施DiI染色技术对墨西哥钝口螈循环系统进行灌注和后续可视化的具体步骤。该方法可实现对稳态组织以及再生组织中通畅血管的精确可视化，为研究墨西哥钝口螈再血管化过程提供了一种新颖的技术手段。

<table><tbody><tr><td>蠕动泵&amp;nbsp;</td><td>Marshall Scientific&amp;nbsp;</td><td>RD-RP1</td><td></td></tr><tr><td>灌注管路</td><td>Excelon Lab &amp;和真空管</td><td>436901705</td><td>大小 S1A</td></tr><tr><td>27g 蝴蝶针</td><td>EXELint 医疗产品</td><td>26709</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>AmericanBio</td><td>7647-14-5</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>AmericanBio</td><td>7747-40-7</td><td></td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&amp;nbsp;</td><td>AmericanBio</td><td>7558-79-4</td><td></td></tr><tr><td>NaH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>AmericanBio</td><td>10049-21-5</td><td></td></tr><tr><td>蒸馏水</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HCl</td><td>AmericanBio</td><td>7647-01-0</td><td></td></tr><tr><td>葡萄糖</td><td>ThermoFischer</td><td>A2494001</td><td></td></tr><tr><td>1,1&amp;prime;-二十八烷基-3,3,3&amp;prime;,3&amp;prime;高氯酸四甲基吲哚羰花青</td><td>Sigma Aldrich</td><td>468495</td><td></td></tr><tr><td>乙醇（100% vol/vol）</td><td>Sigma Aldrich</td><td>64-17-5</td><td></td></tr><tr><td>手术镊&amp;nbsp;</td><td>Medline</td><td>MDG0748741</td><td></td></tr><tr><td>聚苯乙烯泡沫框架</td><td></td><td></td><td>任何带有蝾螈形状的聚苯乙烯泡沫方块&amp;nbsp; 剪下</td></tr><tr><td>手术剪</td><td>Medline</td><td>DYND04025</td><td></td></tr><tr><td>手术刀&amp;nbsp;</td><td>Medline</td><td>MDS15210</td><td></td></tr><tr><td>吸水垫</td><td>Avacare Medical</td><td>PKUFSx</td><td></td></tr><tr><td>纸巾</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>标准一次性移液管</td><td>Fisherbrand</td><td>50216954</td><td></td></tr><tr><td>铁架台</td><td>Adafruit</td><td>291</td><td></td></tr><tr><td>甲磺酸三卡因</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E10521</td><td>Tricaine 粉末</td></tr><tr><td>成年墨西哥钝口螈</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MgSO₄&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>AmericanBio</td><td>10034-99-8</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C1016-100G</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO₃&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S5761-500G</td><td></td></tr><tr><td>塑料容器</td><td></td><td></td><td>适用于不同体型的墨西哥钝口螈</td></tr><tr><td>多聚甲醛</td><td>Sigma Aldrich</td><td>30525-89-4</td><td></td></tr><tr><td>墨西哥钝口螈</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>徕卡显微镜</td><td>Leica</td><td>M165 FC</td><td></td></tr><tr><td>ET-CY3 荧光滤光片</td><td>Leica</td><td>M205FA/M165FC</td><td></td></tr><tr><td>MS-222</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

dii 灌注作为墨西哥钝口螈（ambystoma mexicanum）血管可视化的一种方法

DiI Perfusion as a Method for Vascular Visualization in Ambystoma mexicanum

灌注技术已使用数个世纪，用于观察组织的血液循环。墨西哥钝口螈（Ambystoma mexicanum）是一种蝾螈物种，已成为再生研究的重要模型。目前对这些动物在再生过程中如何实现再血管化的机制仍知之甚少。本文报道了一种通过灌注高氯酸1,1’-二十八碳-3,3,3’,3’-四甲基吲哚羰花青（DiI）来可视化墨西哥钝口螈血管系统的简单方法。DiI 是一种亲脂性羰花青染料，可瞬间插入内皮细胞的质膜中。灌注过程使用蠕动泵进行，使 DiI 通过主动脉进入循环系统。在灌注过程中，染料流经墨西哥钝口螈的血管，并在接触时整合到血管内皮细胞的脂双层中。对于一条八英寸长的墨西哥钝口螈，灌注过程大约需要一小时。使用 DiI 灌注后，可立即通过共聚焦荧光显微镜观察墨西哥钝口螈。当使用绿色荧光滤光片激发时，DiI 会发出红橙色光。该 DiI 灌注方法可用于观察墨西哥钝口螈的血管结构，或展示再生组织中再血管化的模式。

通过DiI染色，可以轻松观察蝾螈的血管系统。经脂溶性染料灌注后的动物，其血管在荧光共聚焦显微镜下立即可见。图1.1-1.5为灌注流程的示意图。使用亮粉色染料灌注后，成功完成灌注的蝾螈整体呈现粉红色。在共聚焦显微镜下使用绿色荧光滤光片时，血管网络会显示出红色荧光信号。当灌注成功时，DiI染色可遍及全身组织，包括尾部、四肢、鳃和眼睛（分别见图2A、图2B、图2C、图2D）。灌注失败则表现为血管无红色染色或染色呈斑块状分布。
<img alt="美西螈再生过程示意图，显示截肢后肢体再生的各个阶段。" class="xfigimg"...

利用亲脂性的1,1'-二十八烷基-3,3,3',3'-四甲基吲哚羰花青高氯酸盐（DiI）染色技术，可对Ambystoma mexicanum进行血管灌注，从而便于清晰观察其血管系统。

DiI 灌注作为墨西哥钝口螈（Ambystoma mexicanum）血管可视化的一种方法

灌注技术已使用数个世纪以可视化组织的血液循环。墨西哥钝口螈（Ambystoma mexicanum）是一种蝾螈物种，其……

本实验的总体目标是可视化墨西哥钝口螈的血管系统。该方法有助于回答再生医学领域中的关键问题，即墨西哥钝口螈再生组织再血管化的复杂过程。这种血管可视化技术的主要优势在于，可在标准荧光显微镜下轻松成像动物体内的全部血管。尽管该方法可用于研究墨西哥钝口螈肢体的再生，也可应用于其他组织，如尾部、心脏、眼睛、鳃或其他器官。在打开墨西哥钝口螈胸腔前，应先通过脚趾夹捏法确认其已达到适当的镇静程度。然后，使用手术镊在肩线正下方的胸腔中轴线上夹捏皮肤。使用手术刀在皮肤被提起处做一切口，切除胸部的一块方形皮肤，以暴露两块软骨板。接着，在胸腔上方打开一个窗口，小心撕开结缔组织，避免切断任何主要血管。用镊子逐个提起每一块软骨板，并用手术剪将其完整切除。用镊子小心夹住暴露的心包膜，将组织轻轻提起，用手术剪刀刺穿心包膜，深度以能去除心包膜且不损伤心脏为宜。随后，轻柔地移除心包膜，暴露心脏和主动脉，以便清晰观察从心脏分出的大约五毫米处的主动脉及心脏结构。为了灌注墨西哥钝口螈，将装有蝶形针头的铁架台放置在聚苯乙烯泡沫支架旁边，使铁架的臂部便于操作以插入针头。打开蠕动泵，使0.7x PBS缓冲液流经泵管，并将针尖朝向前端。将镊子滑至主动脉弓下方，轻轻向上提起。然后移动针头与夹子的组合，使针头沿主动脉长度方向朝向动物头部，将针头插入主动脉约五毫米，并用镊子在主动脉后方提供支撑。成功插入可通过观察到心脏心房明显扩张来确认。迅速刺破其中一个心房，使血液流出。然后，用约 20 至 30 毫升 PBS 灌注蝾螈。成功灌注后，动物体色应由浅粉色变为白色。当所有 PBS 完成灌注后，暂停蠕动泵，并将管路的游离端移入含有 15 毫升稀释液（Dil solution）的离心管中。重新启动泵，注意避免在管路中产生气泡，并将全部工作浓度的Dil溶液灌注到动物体内。在成功的灌注过程中，墨西哥钝口螈的身体会变为鲜粉色，这一变化在鳃部最为明显。当所有Dil溶液完成灌注后，暂停泵的运行，并将管路的游离端插入4%多聚甲醛溶液中。然后，重新启动泵，灌注至少10毫升固定液。当所有多聚甲醛完全注入后，停止泵运行并移除针头。将墨西哥钝口螈转移至塑料培养皿中，并将培养皿置于荧光显微镜载物台上。然后，在关闭光源的情况下，选择一个允许Dil激发的滤光片，Dil会发出红橙色光。成功灌注后，Dil染料在所有蝾螈组织中均可见为红色荧光信号，包括尾部、四肢、鳃和眼睛。一旦掌握该技术，若操作得当，可在一小时内完成。在进行该操作时，需注意在打开胸腔时避免损伤主要血管或心脏，并应沿主动脉方向插入针头，以防止贯穿性穿刺。完成该操作后，可进一步采用其他方法（如骨骼制备）来回答更多科学问题。该技术建立后，为生物医学领域的研究人员探索不同物种的血管系统铺平了道路。观看本视频后，您应能够充分掌握如何使用碳菁染料Dil对墨西哥钝口螈进行心脏灌注。请务必注意，操作针

dii-perfusion-as-method-for-vascular-visualization-ambystoma

Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

DiI灌注作为血管可视化的方法<em&gt;墨西哥恶性肿瘤</em

改良的Landis技术能够利用微灌注技术，在对照和实验条件下，对正常大鼠和基因修饰大鼠肠系膜中单个微血管的水力电导率进行配对测量。该方法为评估在生理条件下调控微血管通透性和跨血管交换的机制提供了一种便捷的手段。...

微灌流技术用于研究大鼠肠系膜微血管通透性的调控机制

本方案展示了一种基于荧光的方法，用于可视化血管系统并量化其复杂性 Xenopus tropicalis在对胚胎进行遗传学和/或药理学干预后，将荧光染料注入跳动的心脏，数分钟后即可对血管系统进行成像，以研究心血管发育过程。 体内.

胚胎血管生成的可视化与定量分析 Xenopus tropicalis

本文介绍了墨西哥钝口螈（Ambystoma...

墨西哥钝口螈（Ambystoma Mexicanum）的二维和三维超声心动图

本文介绍了一种通过将DiI溶于固定液后进行心脏灌注，以快速标记辐鳍鱼类血管的实验方案，以青鳉（Oryzias...

使用DiI-固定剂心脏灌注标记硬骨鱼脑和垂体中的血管

本文描述了一种对小鼠下半身进行原位灌注的实验方案，包括膀胱、前列腺、性器官、骨骼、肌肉和足部皮肤。...

建立小鼠下腹部器官与后肢的原位闭路灌注技术

本方案描述了一种独特且具有临床相关性的外周动脉疾病模型，该模型通过结合股动脉和股静脉电凝以及给予一氧化氮合酶抑制剂，在FVB小鼠中诱导后肢坏疽。随后采用心脏内灌注DiI的方法，对足垫血管系统进行高分辨率的三维成像。...

小鼠后肢坏疽模型中足垫血管系统的高分辨率三维成像

本文展示了一种有效的快速血液灌注方案，用于制备非洲爪蟾组织样本，以进行转录组学和蛋白质组学研究。...

Xenopus 中有效的快速血液灌注

本方案介绍了一种具有生理相关性的“器官芯片”肿瘤模型，可用于高效开展基础性和转化性人类癌症研究，推动药物筛选、疾病建模及个体化医学的发展，并详细描述了该模型的加载、维持和评估操作流程。...

建立一种用于癌症研究的生理性人源血管化微肿瘤模型

本方案介绍了一种利用光片荧光显微镜进行定量整体三维血管成像的快速方法。该方法的有效性通过鸡胚模型的咽弓动脉系统加以验证，并对血流动力学力进行了量化。 通过...

小型动物血管系统的快速全组织高分辨率成像用于定量研究

本方案详细描述了一种优化的慢性颅窗结合微血管栓塞小鼠模型的逐步操作方法，适用于 体内 使用荧光聚苯乙烯微球进行双光子显微成像。...

用于微血管栓塞的小鼠模型 体内 使用荧光聚苯乙烯微球的双光子显微镜技术

学习使用DiI灌注技术可视化墨西哥钝口螈（Ambystoma mexicanum）的血管系统。该方法通过荧光显微镜成像，帮助研究人员深入理解再生医学中的血管再生机制，适用于肢体、尾部、心脏等多种组织的再生研究。

DiI 灌注作为墨西哥钝口螈（Ambystoma mexicanum）血管可视化的一种方法

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