骨髓间充质干细胞质膜囊泡的制备及其在潜在细胞质置换治疗中的应用

本实验的总体目标是利用源自小鼠骨髓间充质干细胞（BMSCs）的血浆膜囊泡（PMVs），将一种新型的细胞质置换疗法递送至小鼠腓肠肌。该方法有助于解答以下问题：通过PMV融合将来自年轻BMSC的细胞质补充到细胞中，是否能够改善甚至逆转与衰老相关的表型。该技术的主要优势在于，PMV可包裹BMSC的胞质内容物，并能通过机械挤出法快速诱导生成。

在演示该方法时，由于挤出和构建步骤难以通过测试来真正掌握，因此实际操作至关重要。为生成PMVs，首先将小鼠BMSCs在六孔板的一个孔中，使用完全DMEM培养基，在37摄氏度、5%二氧化碳的湿化培养箱中进行培养。当细胞达到90%融合度时，用0.5毫升无钙PBS冲洗孔内，再加入0.5毫升0.25%胰蛋白酶-EDTA使细胞脱离。

在37摄氏度条件下孵育3分钟后，用手掌轻拍培养板数次以促进细胞解离，并加入1毫升培养基终止消化。将细胞转移至5毫升锥形管中进行离心，然后将沉淀重悬于4毫升新鲜培养基中。随后将细胞分至新的6孔板的两个孔中，并将培养板放回细胞培养箱中继续培养24小时。

第二天，通过胰蛋白酶消化法（如前所示）从一个孔中收集细胞。离心收集后，将细胞沉淀重悬于0.5毫升新鲜培养基中。将细胞悬液加入1毫升胰岛素注射器中，并将注射器连接至滤器装置。

快速下压推杆，使细胞通过滤膜，并弃去挤出的培养基。然后像刚才演示的那样，加载并推出0.5毫升额外的培养基通过滤膜，收集第二次挤出的培养基。取150微升收集的培养基接种到35毫米玻璃底培养皿中，静置约10分钟，使囊泡沉降。

然后使用配备CCD相机的倒置相差显微镜，以20倍物镜确认PMVs的存在。为了追踪PMVs中的线粒体包封情况及膜电位，将融合度为90%的BMSC细胞培养物分别在新鲜培养基中加入适当的线粒体染料或线粒体膜电位探针，于37摄氏度孵育30分钟。随后用PBS每次0.5毫升洗涤细胞三次，并通过胰蛋白酶消化法收集细胞，用于PMV的制备，以便如上所述通过共聚焦显微镜进行观察。

为了追踪PMV蛋白的细胞质定位，首先在分别装有50微升无血清DMEM的0.5毫升离心管中，将两微克的EGFP表达盒用的超螺旋质粒DNA和六微升阳离子转染试剂各自稀释。涡旋混匀各管，随后短暂离心。然后将转染试剂逐滴加入含有稀释DNA溶液的离心管中。

将DNA转染混合物剧烈涡旋震荡一分钟，然后短暂离心，并在室温下孵育10分钟。接着，向六孔板中30%汇合度的BMSC培养物加入两毫升新鲜培养基，并将DNA混合物逐滴加入细胞中。转染后48小时，通过胰蛋白酶消化收集BMSC，并按照前述方法制备PMVs。

然后可使用100倍油镜通过共聚焦显微镜分析PMVs。在注入PMVs之前，将BMSC培养物用膜染色荧光细胞示踪染料在1毫升新鲜培养基中于37摄氏度下标记30分钟，并通过胰蛋白酶消化收获细胞。将标记的细胞重悬于0.5毫升新鲜培养基中，培养基中添加1微克聚乙烯胺，并按所示方法制备PMVs。

然后通过离心浓缩PMVs，并将沉淀物轻轻涡旋重悬于100微升新鲜培养基中。接着，将细胞吸入一支配有30号针头的1毫升胰岛素注射器中，并用75%乙醇消毒麻醉后的BALB/c小鼠腓肠肌外部。随后，将PMVs的全部体积缓慢注射至肌肉内，并将动物置于加热灯下恢复。

12小时后，将75%乙醇滴加到肌肉上，用剪刀切开皮肤，并在两端完整取下腓肠肌。用PBS冲洗肌肉，然后将其置于荧光显微镜下。使用20倍物镜，用锋利的剃刀片去除无荧光的肌肉组织碎片，将剩余的强红色荧光组织切成约9个立方毫米大小的立方体。

将每个组织块包埋于最佳切割温度介质中，随后将组织块浸入液氮中冷冻5分钟，最后将组织样本于-20 °C保存直至分析。

如相差显微镜下使用20倍物镜观察所示，由BMSCs产生的PMVs主要表现为直径约三微米的粒径范围。BMSCs转染荧光表达盒48小时后，显示PMVs包载了细胞质中的EGFP蛋白。此外，使用荧光线粒体染料染色表明，大部分PMVs含有线粒体。

其中大部分对线粒体膜电位染料呈阳性染色，表明线粒体具有功能活性。在体内给药前使用聚乙烯胺处理，可防止PMV在离心浓缩以去除细胞组分过程中发生聚集。在PMV生成前对BMSCs进行膜染料标记，有助于生成可荧光示踪的PMV。

事实上，通过肌肉内递送标记的PMV后，对腓肠肌冷冻切片进行可视化观察表明，PMV可能通过内吞作用被递送至肌细胞胞质中。在进行PMV制备操作时，需注意使用适当数量的细胞装填注射器，并在将细胞冲洗过滤膜时迅速推动活塞。该技术建立后，为干细胞治疗领域的研究人员探索小鼠衰老相关疾病的治疗方法开辟了道路。

观看本视频后，您应充分了解如何从骨髓间充质干细胞（BMSC）制备PMV，以将细胞质递送至小鼠腓肠肌。