Name: 从骨髓间充质干细胞制备血浆膜囊泡用于潜在的细胞质替代治疗 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-18T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 34 s
Description: 学习从骨髓间充质干细胞制备血浆膜囊泡的方法，用于细胞质替代治疗。该技术通过机械挤出法封装年轻细胞质，有望改善衰老相关表型，为衰老相关疾病治疗提供新策略。

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本研究由李嘉诚基金会、广东省高水平大学项目&#34;海洋产业绿色技术&#34;、国家自然科学基金（http://www.nsfc.gov.cn/ 项目编号：30971665、81172894、81370925）以及广东省教育厅（http://www.gdhed.edu.cn/ 项目编号：cxzd1123）资助。

8至12周龄的BALB/c小鼠购自中国上海实验动物中心（中国上海），并在特定无病原体和空调控制的动物设施中饲养。动物护理和实验操作均遵循汕头大学制定的《实验室动物使用与护理指南》。
1. 仪器装置的组装
<ol>
	<li>为确保无菌，使用前开启超净台的紫外灯照射 30 分钟。</li>
	<li>拧开一次性 25 mm 滤器单元，将单元的上盖和底座浸入盛有 75% 乙醇的 200 mL 玻璃杯中，浸泡 30 分钟。该单元由医用级聚丙烯制成。</li>
	<li>使用镊子夹取单元的上盖和底座，手动甩去残留乙醇，并在超净台内静置晾干 10 分钟。</li>
	<li>用 PBS 润湿一张 19 mm 聚碳酸酯膜，小心将其放置在滤器底座支撑基质的上方。该聚合物膜表面光滑平整，带有经核孔蚀刻的 3 µm 孔径微孔。</li>
	<li>将上盖与底座拧紧，重新组装滤器单元。确保膜未从中心位置移位。</li>
	<li>取下 1 mL 胰岛素注射器的针头，吸取 1 mL PBS。将注射器连接至滤器单元，推动 PBS 穿过滤器，以润湿组件并检测是否存在泄漏。</li>
</ol>
2. 质膜囊泡（PMVs）的制备
<ol>
	<li>建立骨髓间充质干细胞（BMSC）培养，方法如Nemeth所述 等15，置于含15% FBS和1%青霉素/链霉素的DMEM培养基中，在6孔板中培养，于含5% CO₂的湿润培养箱中孵育2 在 37 °C。</li>
	<li>传代细胞时，移除培养基，并用0.5 mL无钙PBS冲洗孔板。</li>
	<li>加入0.5 mL 0.25%胰蛋白酶-EDTA，37 °C孵育3 min。轻轻用手掌轻敲培养皿数次，以促进细胞脱落。加入1 mL培养基终止消化。</li>
	<li>将细胞收集至15 mL锥形管中，在台式离心机中以200 × g离心2分钟。用4 mL培养基重悬细胞，并将细胞分装至6孔板的两个孔中。 
	注意：细胞通常在约24小时达到汇合。</li>
	<li>为生成PMVs，从一个孔中收集细胞（约5 x 105 通过胰蛋白酶消化法从6孔板中收集细胞，并将细胞重悬于0.5 mL培养基中制成单细胞悬液。</li>
	<li>将细胞装入胰岛素注射器，连接至滤器装置，快速推动针栓使细胞通过滤膜。弃去挤出的液体，因其内仅含少量PMV。</li>
	<li>向注射器中再加入0.5 mL培养基，迅速将其推过滤器。收集第二次挤出的液体，其中含有不同大小的质膜囊泡（PMVs）。</li>
	<li>将150 µL收集的培养基加入35 mm玻璃底培养皿中，静置约10分钟，使PMVs沉降至底部。使用配备CCD相机的倒置相差显微镜，以20倍物镜观察PMVs。</li>
</ol>
3. 使用共聚焦显微镜检测PMVs内的内容
<ol>
	<li>为了在BMSCs中进行转染，将2 µg超螺旋质粒DNA和6 µL阳离子转染试剂分别稀释例如， 在50 µL无血清DMEM中加入PolyJet，涡旋混匀，短暂离心以收集管壁液体。</li>
	<li>将稀释后的溶液（步骤3.1）逐滴加入稀释的DNA溶液中，剧烈涡旋震荡1分钟，短暂离心，室温孵育10分钟。</li>
	<li>将已接种过夜、融合度约为30%的骨髓间充质干细胞（BMSCs）中的旧培养基更换为2 mL新鲜培养基，并逐滴加入DNA转染混合物。</li>
	<li>转染12小时后，更换为2 mL新鲜培养基。</li>
	<li>为了示踪细胞质定位的蛋白质，按照上述方法将细胞转染含有EGFP表达盒的质粒（pEGFP-N1）。转染后48 h，按照上述方法通过胰蛋白酶消化收集细胞，用于PMV的制备。</li>
	<li>用新鲜培养基将细胞与线粒体染料（1 µM，MitoTracker）在37 °C下孵育30分钟，以标记线粒体。</li>
	<li>为检测线粒体膜电位，将细胞在新鲜培养基中与花青染料JC-1（5,5',6,6'-四氯-1,1',3,3'-四乙基苯并咪唑羰花青碘化物）（10 µg/mL）于37 °C孵育30分钟。
	<ol>
		<li>用 0.5 mL PBS 洗涤细胞三次，然后按照上述方法通过胰蛋白酶消化收集细胞，用于 PMV 的制备。</li>
		<li>将收集的培养基150 µL加入35 mm玻璃底培养皿中，静置约10分钟，使PMVs沉降至底部。使用100倍油镜在共聚焦显微镜下观察PMVs。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>检测EGFP或线粒体染料时，开启488 nm激光器，并在505–530 nm范围内收集信号。检测JC-1时，开启488 nm和543 nm激光器，并分别在505–530 nm和560–615 nm范围内收集信号。将针孔值设为约1.4。</li>
</ol>
4. 通过离心法制备浓缩的原代微囊泡
<ol>
	<li>通过胰蛋白酶消化收集细胞，并在 0.5 mL 培养基中按上述方法制备细胞膜囊泡（PMVs）。</li>
	<li>将 PMVs 在台式离心机中以 1,200 × g 的速度于室温下离心 5 分钟。小心吸除上清液，并用轻柔涡旋将沉淀重悬于 100 µL 培养基中。</li>
	<li>取 50 µL PMVs 加入 35 mm 玻底培养皿中，于室温静置约 10 分钟。使用共聚焦显微镜配合 40X 油镜观察 PMVs。</li>
	<li>将一系列稀释的聚乙烯亚胺（PEI）溶液加入骨髓间充质干细胞（BMSC）培养物中，作用 1 小时，并观察细胞毒性迹象。 
	注意：此处选用 2 µg/mL 的 PEI，因在 BMSCs 中未检测到毒性迹象。</li>
	<li>通过胰蛋白酶消化收集细胞，并加入 2 µg/mL 的 PEI 处理 1 小时，以对细胞膜进行电荷修饰，防止聚集。在 0.5 mL 培养基中按上述方法制备 PMVs。浓缩 PMVs 后，按上述方法在共聚焦显微镜下观察。</li>
</ol>
5. 将PMVs注射至腓肠肌
<ol>
	<li>为染色膜，将CM-DiI（氯甲基二烷基吲哚羰花青）染料（10 μM）加入1 mL新鲜培养基中，与BMSCs共同孵育30分钟。</li>
	<li>通过胰酶消化收获细胞（约5 × 105），重悬于0.5 mL培养基中。加入PEI（2 µg/mL），孵育1小时。按照前述方法在100 µL培养基中生成并浓缩PMVs。</li>
	<li>在禁食12小时后，通过注射戊巴比妥钠（10 mg/kg）对BALB/c小鼠进行麻醉。</li>
	<li>用75%乙醇清洁腓肠肌外部表面，使用30 G胰岛素注射器缓慢将PMVs（100 µL）注射至腓肠肌内。</li>
	<li>给予麻醉后，实验期间用湿纱布覆盖小鼠眼睛，并使用白炽灯保温直至其苏醒。将小鼠单独饲养于独立通风笼具中。</li>
	<li>术后12小时为取材腓肠肌，采用颈椎脱位法处死小鼠。</li>
	<li>用75%乙醇淋洒腓肠肌，用剪刀切开皮肤，从两端完整切除整个腓肠肌。</li>
	<li>用PBS冲洗肌肉组织，并在荧光显微镜下使用20倍物镜进行观察。</li>
	<li>用锋利的剃须刀片修剪肌肉，去除无荧光部分，将呈现强红色荧光的区域切成约9 mm3的立方体。</li>
	<li>将每个组织块包埋于最佳切割温度介质（OCT）中，浸入液氮5分钟，随后储存于-20 °C冰箱中备用。</li>
	<li>使用冷冻切片机将冷冻组织切成20 µm厚的切片，贴附于载玻片上。用PBS冲洗切片一次。</li>
	<li>用染色笔在切片周围画圈，加入100 µL DAPI（1 µg/mL）。室温避光孵育10分钟后吸除DAPI溶液，并用PBS洗涤三次。</li>
	<li>在样本上滴加封片剂，盖上盖玻片，并用指甲油封固。使用共聚焦显微镜配合100倍油镜观察切片。</li>
	<li>检测CM-DiI时，开启543 nm激光器，收集560–615 nm信号；检测DAPI时，开启405 nm激光器，收集420–480 nm信号。将针孔值设定为约1.4。</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本文提出的细胞质置换疗法相较于其他已报道的方法（如基因治疗、分子治疗和细胞治疗）具有独特优势。由骨髓间充质干细胞（BMSCs）产生的去核细胞质微泡（PMVs）不仅包裹了干性基因的产物，还包含完整的细胞器，这些成分对于改善与细胞衰老相关的老化表型至关重要。当年轻细胞的细胞质被递送至衰老细胞时，功能失调的细胞机制可能得到短暂缓解；同时，表观基因组可能被重编程并恢复活力，从而产生持久效果。此外，外源性线粒体可能具有更快的增殖速率，这一点已在我们先前的研究中有所提示12。替换受损线粒体至关重要，因为线粒体功能障碍已被证实与多种衰老相关疾病密切相关11。另外，与干细胞不同，去核的PMVs无法增殖，因此几乎不会引发癌症发展的担忧。最后，PMVs中缺乏细胞核DNA，也降低了因DNA随机整合而导致基因组损伤的风险。
在正常或应激条件下，培养的细胞会产生多种膜性细胞外囊泡（EV）。外泌体来源于晚期内体，大多数哺乳动物细胞均可将其释放为直径30-120 nm的细胞外囊泡1...

在基因、酶和细胞替代疗法的建立方面已投入大量努力，由此取得了重大突破，甚至实现了临床应用1,2,3最近，一种基于细胞核移植技术的、颇具争议的线粒体替换疗法已被应用 体外 高龄女性或携带致死性线粒体DNA突变女性的受精4在动脉粥样硬化、2型糖尿病、阿尔茨海默病和癌症等年龄相关性疾病中发现的缺陷通常具有多方面因素。已有文献记载，脂滴的积累、淀粉样蛋白的沉积、未折叠蛋白在内质网中的滞留，以及蛋白酶体、自噬体和线粒体的功能障碍，均会促进这些疾病的发生或加重。5,6,7,8,9,10,11目前尚无针对细胞质和细胞器功能障碍进行直接修复的机制，而这种功能障碍会导致细胞衰老和老化表型。
我们此前已报道过通过机械挤出哺乳动物细胞来生成质膜囊泡（PMVs）的方法12。除细胞核外，膜或细胞质中的组分（包括蛋白质和RNA）以及细胞器（如线粒体）均存在于PMVs中。本质上，PMV可被视为一种微型的去核细胞。更重要的是，在正常培养条件下，PMVs与缺乏线粒体的Rho0细胞融合后恢复了有丝分裂活性。这是首篇关于建立一种潜在高效的细胞质置换治疗策略的报道。
骨髓间充质干细胞（BMSCs）是一类具有多向分化潜能的前体细胞，通常从骨髓中分离获得，并可在体外培养中 readily 扩增。在间充质干细胞（MSCs）中已检测到胚胎干细胞标志物 Oct4、Nanog 和 SOX2 的低水平表达13。端粒酶活性亦可测得。此外，MSCs 不表达共刺激分子和人类白细胞抗原（HLA）II 类分子，且 HLA I 类分子表达水平较低，这些特性使其成为再生医学和免疫调节应用中理想的异基因（即“即用型”&#34;off-the-shelf&#34;）治疗细胞14。
在此，我们描述了如何通过将小鼠骨髓间充质干细胞（BMSCs）经由孔径为3-µm的聚碳酸酯膜挤出以制备PMVs，利用共聚焦显微镜检测PMVs中线粒体的存在及其膜电位的维持情况，通过离心制备浓缩但未聚集的PMVs，并进行 体内 向小鼠腓肠肌注射PMVs。

<table><tbody><tr><td>IsoporeTM 膜</td><td>Millipore</td><td>TSTP04700</td><td>3 mm 孔径</td></tr><tr><td>一次性滤器</td><td>Xinya，中国上海</td><td>25 mm</td><td>医用级聚丙烯</td></tr><tr><td>胰岛素注射器</td><td>BD</td><td>328446</td><td>1 mL</td></tr><tr><td>pN1-EGFP</td><td>Clontech</td><td>&amp;nbsp;6085-1</td><td></td></tr><tr><td>MitoTracker</td><td>Molecular Probes</td><td>M7514</td><td>Green FM，1 &amp;mu;M</td></tr><tr><td>JC-1</td><td>Beyotime，中国海门</td><td>C2006</td><td>10 mg/mL</td></tr><tr><td>CM-DiI</td><td>Beyotime，中国海门</td><td>C1036</td><td>10 mM</td></tr><tr><td>PEI</td><td>Sigma</td><td>P3143</td><td>Mn = 75,000</td></tr><tr><td>荧光显微镜</td><td>Nikon</td><td>Eclipse TE 2000</td><td>配备 CCD 相机</td></tr><tr><td>共聚焦显微镜</td><td>Carl Zeiss</td><td>LSM 510 Meta</td><td></td></tr><tr><td>PolyJet</td><td>SigaGen</td><td>SL100688</td><td>用于细胞转染</td></tr></tbody></table>

骨髓间充质干细胞质膜囊泡的制备及其在潜在细胞质置换治疗中的应用

Preparation of Plasma Membrane Vesicles from Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells for Potential Cytoplasm Replacement Therapy

我们此前已报道过通过机械挤出法从哺乳动物细胞中生成质膜小泡（PMVs）。将PMVs与线粒体缺陷型Rho0细胞融合后，可在正常培养条件下恢复其有丝分裂活性。动脉粥样硬化、2型糖尿病、阿尔茨海默病和癌症等衰老相关疾病已被证实与多种细胞类型的细胞质及细胞器在机械和功能上的多重缺陷有关。骨髓间充质干细胞（BMSCs）是骨髓中一类独特的细胞群体，具有自我更新能力并能维持其多向分化潜能。通过PMVs介导，将自体年轻BMSCs的细胞质补充至衰老细胞中，为改善甚至逆转与年龄相关的表型提供了一种有前景的策略。本实验方案详细描述了如何通过孔径为3 µm的聚碳酸酯膜挤出法从BMSCs制备PMVs，利用共聚焦显微镜检测PMVs中线粒体的存在及其膜电位的维持情况，通过离心法浓缩PMVs，并进行后续操作 在体 向小鼠腓肠肌注射PMVs。

成功制备PMVs的关键在于滤器单元的正确组装（图1），可通过推动1 mL PBS穿过膜来测试组装是否正确。若出现泄漏，需重新组装滤器单元并再次测试。然而，只有在细胞穿过膜时才能可靠地检测是否存在泄漏。若在普通显微镜下使用10X物镜观察时仅检测到少量PMVs，或PMVs的尺寸大多在1 µm左右，则表明由于滤器单元组装不当，大部分细胞被滞留在装置内部。使用20X物镜在相差显微镜下观察时，直径约为3 µm的PMVs占主导（图2）。由于纳米级PMVs不易被观察到，因此在数量上较大尺寸PMVs所占比例较低。快速推动注射器有助于减少膜碎片的产生，这些碎片显然无法形成球形PMVs。此外，在第一次挤出液中可发现较小尺寸的PMVs（小于1 µm），而较大尺寸的PMVs则主要在第二次挤出液中获得。
PMVs 最独特的特征是包裹了细胞核以外的细胞组分12。在用...

与衰老相关的疾病与细胞质多种组分的缺陷有关。本文介绍了一种从骨髓间充质干细胞制备质膜囊泡的实验方案。该技术有望作为一种细胞质替代疗法，用于改善甚至逆转与衰老相关的表型。

我们此前已报道过通过机械挤出法从哺乳动物细胞制备质膜囊泡（PMVs）的方法。PMVs 的融合……

本实验的总体目标是利用源自小鼠骨髓间充质干细胞（BMSCs）的质膜囊泡（PMVs），将一种新型的细胞质置换疗法递送至小鼠腓肠肌。该方法有助于解答以下问题：通过PMV融合将年轻BMSC的细胞质补充至细胞中，是否能够改善甚至逆转与年龄相关的表型。该技术的主要优势在于，PMV可包裹BMSC的胞质内容物，并可通过机械挤出法快速诱导生成。在演示该方法时，由于挤出和构建步骤难以通过测试来真正掌握，因此实际操作至关重要。为生成PMVs，首先将小鼠BMSCs在六孔板的一个孔中，使用完全DMEM培养基，在37摄氏度、5%二氧化碳的湿润培养箱中进行培养。当细胞达到90%融合度时，用0.5毫升无钙PBS冲洗孔内，再加入0.5毫升0.25%胰蛋白酶-EDTA使细胞脱离。在37摄氏度条件下孵育3分钟后，用手掌轻拍培养板数次以促进细胞解离，并加入1毫升培养基终止消化。将细胞转移至5毫升锥形管中进行离心，然后将沉淀重悬于4毫升新鲜培养基中。随后将细胞分至新的6孔板的两个孔中，并将培养板放回细胞培养箱中继续培养24小时。第二天，通过胰蛋白酶消化法收集一个孔中的细胞，操作方法如前所述。离心收集细胞后，将沉淀重悬于 0.5 毫升新鲜培养基中。将细胞悬液加入 1 毫升胰岛素注射器中，并将注射器连接至滤器装置。快速下压推杆，使细胞通过滤膜，并弃去挤出的培养基。随后，按照上述方法再次加载并推出0.5毫升额外培养基通过滤膜，收集第二次挤出的培养基。取150微升收集的培养基接种至35毫米玻璃底培养皿中，静置约10分钟，使囊泡沉降。然后使用配备CCD相机的倒置相差显微镜，以20倍物镜确认PMVs的存在。为了追踪PMVs中的线粒体包封情况及膜电位，将90%汇合度的BMSC培养物分别在新鲜培养基中加入适当的线粒体染料或线粒体膜电位探针，于37°C孵育30分钟。随后用PBS每次0.5毫升洗涤细胞三次，并通过胰蛋白酶消化法收集细胞，用于PMV的制备，以便如上所述通过共聚焦显微镜进行观察。为了追踪PMV蛋白的细胞质定位，首先在分别含有50微升无血清DMEM的0.5毫升离心管中，将两微克的EGFP表达盒用的超螺旋质粒DNA和六微升阳离子转染试剂各自稀释。涡旋混匀各管，随后短暂离心。然后将转染试剂逐滴加入含有稀释DNA溶液的离心管中。将DNA转染混合物剧烈涡旋震荡一分钟，短暂离心后，室温孵育10分钟。接着，向六孔板中30%汇合度的BMSC培养物加入两毫升新鲜培养基，并将DNA混合物逐滴加入细胞中。转染48小时后，通过胰酶消化收集BMSC，并按前述方法制备PMVs。然后可使用100倍油镜通过共聚焦显微镜分析PMVs。在注入PMVs之前，将BMSC培养物用膜染色荧光细胞示踪染料在1毫升新鲜培养基中于37摄氏度下标记30分钟，并通过胰蛋白酶消化收获细胞。将标记的细胞重悬于0.5毫升新鲜培养基中，培养基中添加1微克聚乙烯胺，并按所示方法制备PMVs。然后通过离心浓缩PMVs，并将沉淀物轻轻混悬于100微升新鲜培养基中。接着，将细胞吸入一支配有30号针头的1毫升胰岛素注射器中，并用75%乙醇消毒麻醉后的BALB/c小鼠腓肠肌外部。随后，将PMVs的全部体积缓慢注射至肌肉内，并将动物置于加热灯下恢复。12小时后，将75%乙醇滴加到肌肉上，用剪刀切开皮肤，从两端完整取出比目鱼肌。用PBS冲洗肌肉，并将其置于荧光显微镜下。使用20倍物镜，用锋利的剃刀片去除无荧光的肌肉组织碎片，将剩余的强红色荧光组织切成约9个立方毫米大小的组织块。将每个组织块包埋于最佳切割温度介质中，随后将组织块浸入液氮中冷冻5分钟，最后将组织样本保存在-20 °C条件下直至分析。如相差显微镜下使用20倍物镜观察所示，由BMSCs产生的PMVs主要表现为直径约三微米的大小范围。BMSCs转染荧光表达盒48小时后，可观察到PMVs对EGFP蛋白的胞质包裹。此外，使用荧光线粒体染料染色显示，大部分PMVs含有线粒体。其中大部分对线粒体膜电位染料呈阳性染色，表明线粒体具有功能活性。在体内给药前使用聚乙烯胺处理，可防止PMV在离心浓缩以去除细胞组分过程中发生聚集。在PMV生成前对BMSCs进行膜染料标记，有助于产生可荧光示踪的PMV。事实上，在向肌肉内递送标记的PMV后，对腓肠肌冷冻切片进行可视化观察，表明PMV可能通过内吞作用被递送至肌细胞胞质。在进行PMV制备操作时，需注意使用适当数量的细胞装填注射器，并在将细胞冲洗过滤膜时迅速推动活塞。该技术建立后，为干细胞治疗领域的研究人员探索小鼠衰老相关疾病的治疗方法奠定了基础。观看本视频后，您应能够充分掌握如何从骨髓间充质干细胞（BMSC）制备PMV，以将细胞质递送至小鼠腓肠肌的方法。

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Research

科研

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Developmental Biology

发育生物学

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