Name: 利用N酰基修饰 Mannosamines 对唾液酸的代谢 Glycoengineering (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 6 s
Description: 学习利用N-酰基修饰甘露糖胺进行代谢糖工程，修饰细胞表面唾液酸表达。该方法操作简便且无细胞毒性，可用于研究糖缀合物对受体-配体相互作用的影响，为糖生物学研究提供新工具。

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感谢 L. D. Nguyen 对手稿的校对以及富有成效的讨论。此外，感谢 J. Dernedde 和 H. G. Nguyen 协助我们准备视频拍摄工作。视频的大部分场景是在 R. Tauber 的实验室中拍摄完成的。我们还感谢马克斯·普朗克胶体与界面研究所向我们免费开放其质谱设施。RH 得到了德国研究基金会（DFG）（ProMoAge 项目）的支持。

1. 缓冲液和试剂的制备
<ol>
	<li>3 mM 甲醇钠溶液的制备
	<ol>
		<li>在装有搅拌子的 100 mL 玻璃瓶中，将 8.1 mg 甲醇钠溶于 50 mL 甲醇（3 mM）。室温（RT）下可保存数周。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Tris-HCl 缓冲液的制备
	<ol>
		<li>在装有搅拌子的 100 mL 玻璃瓶中，加入 8.766 g NaCl、157 mg Tris-HCl 和 146 mg EDTA，加 80 mL 水溶解。</li>
		<li>在搅拌过程中，使用 pH 计监测 pH 值，逐滴加入氢氧化钠（1 M，水溶液）或盐酸（20%，水溶液），调节 pH 至 8.0。</li>
		<li>加水定容至 100 mL，使用 0.22 µm 无菌滤器过滤溶液。 
		注：100 mL Tris-HCl 缓冲液终浓度为 150 mM NaCl、10 mM Tris-HCl 和 5 mM EDTA（pH 8.0）。该溶液可在 4 °C 下保存数周。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>抑肽酶溶液的制备
	<ol>
		<li>将 10 mg 抑肽酶溶于 1 mL 水中（1.54 mM）。分装至 10 个 1.5 mL 塑料管中（每管 100 µL）。-20 °C 保存数周。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>亮抑蛋白酶肽溶液的制备
	<ol>
		<li>将 10 mg 亮抑蛋白酶肽溶于 2 mL 水中（10 mM）。分装至 10 个 1.5 mL 塑料管中。-20 °C 保存数周。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>苯甲基磺酰氟（PMSF）溶液的制备
	<ol>
		<li>将 34.8 mg PMSF 溶于 2 mL 乙醇中（100 mM）。分装至 10 个 1.5 mL 塑料管中。-20 °C 保存数周。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>1,2-二氨基-4,5-亚甲基二氧基苯二盐酸盐（DMB）溶液的制备
	<ol>
		<li>取 15.62 mg DMB、352 µL β-巯基乙醇和 48 µL 亚硫酸氢钠溶液（39%），加水至 9.6 mL（终浓度为 6.9 mM DMB、500 mM β-巯基乙醇和 0.19% 亚硫酸氢钠）。分装至 40 个 1.5 mL 塑料管中（每管 250 µL）。避光，-20 °C 保存数周。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>1 M 三氟乙酸（TFA）溶液的制备
	<ol>
		<li>在 15 mL 塑料管中，将 770.3 µL 100% TFA 加入 9.23 mL 水中（1 M）。4 °C 保存数周。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>120 mM TFA 溶液的制备
	<ol>
		<li>在 15 mL 塑料管中，将 92.4 µL TFA（100%）加入 9.91 mL 水中（120 mM）。4 °C 保存数周。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>400 mM 氢氧化钠（NaOH）溶液的制备
	<ol>
		<li>在 15 mL 塑料管中，将 160 mg NaOH 溶于 10 mL 水中（400 mM）。4 °C 保存数周。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Western 印迹裂解缓冲液的制备
	<ol>
		<li>将 5.84 g NaCl、0.1 g 三（羟甲基）氨基甲烷（Tris）、0.1 g CaCl2、0.95 g MgCl2 和 1 g Triton-X100 溶于 100 mL 水中，调节 pH 至 7.8。4 °C 保存。使用前每 100 mL 裂解缓冲液中加入 100 µL 各种蛋白酶抑制剂（抑肽酶、亮抑蛋白酶肽和 PMSF）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）缓冲液的制备
	<ol>
		<li>将 0.3 g Tris、1.5 g 甘氨酸和 0.1 g SDS 溶于 100 mL 水中，调节 pH 至 7.3。室温保存。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Western 印迹转膜缓冲液的制备
	<ol>
		<li>将 0.3 g Tris 和 1.1 g 甘氨酸溶于 90 mL 水中，加入 10 mL 乙醇。室温保存。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>封闭液的制备
	<ol>
		<li>将 1 g 脱脂奶粉溶于 25 mL 磷酸盐缓冲液（PBS）中。每次使用前新鲜配制。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. ManNProp 及相关 N-酰基修饰甘露糖胺的合成
<ol>
	<li>在50 mL玻璃瓶中加入磁力搅拌子，将431.2 mg甘露糖胺盐酸盐溶于10 mL 3 mM甲醇钠溶液中。</li>
	<li>将混合物置于冰上冷却至0 °C。在搅拌条件下，缓慢滴加210 µL丙酰氯（2.4 mmol）或248 µL丁酰氯（2.4 mmol），分别用于合成ManNProp或ManNBut。在0 °C下继续搅拌反应4 h。</li>
	<li>将溶液转移至50 mL塑料离心管中。用细针在塑料管盖上刺4–8个小孔。使用液氮迅速冷冻溶液，随后冷冻干燥（冻干）48 h，或直至完全干燥。</li>
	<li>将350 g硅胶60与750 mL乙酸乙酯/甲醇/水（15:2:1）混合（形成悬浮液）。将该硅胶60悬浮液装入玻璃层析柱（直径35 mm，长度70 cm），并在使用前用额外的100 mL乙酸乙酯/甲醇/水（15:2:1）冲洗预处理好的层析柱。</li>
	<li>将步骤2.3所得干燥产物（5 g干燥物）溶于10 mL乙酸乙酯/甲醇/水（15:2:1）中，用移液器加样至硅胶柱上。在洗脱体积达到500 mL后开始收集4 mL的馏分（适用于ManNProp）。注意：ManNBut大约在700 mL后从层析柱中洗脱出来。</li>
	<li>将洗脱得到的各馏分转移至15 mL塑料离心管中。用细针在管盖上刺3–6个小孔。使用液氮迅速冷冻溶液，随后冷冻干燥至完全干燥。 
	注意：冻干产物可在室温下保存数月。</li>
	<li>通过质谱法验证产物纯度（见第9节）。 
	注意：也可通过1H核磁共振（NMR）验证纯度。</li>
</ol>
3. 细胞培养
<ol>
	<li>在含有10%胎牛血清、100 U青霉素、100 mg链霉素、2 mM L-谷氨酰胺，并添加5 mM ManNAc、5 mM ManNProp或5 mM ManNBut的RPMI（Roswell Park Memorial Institute）培养基中，于37 °C和5% CO2条件下培养Kelly神经母细胞瘤细胞。 
	注意：在不含ManNAc或其类似物的培养基中培养的细胞作为对照。</li>
	<li>在应用甘露糖胺之前，用胰蛋白酶/EDTA（PBS中含0.25%胰蛋白酶和0.02% EDTA）孵育细胞10分钟，使其脱离，然后使用血细胞计数板或细胞计数仪进行计数。根据培养板/皿的尺寸，将细胞以特定数量接种。
	<ol>
		<li>为测定唾液酸单糖，将1 × 105个细胞接种于48孔组织培养板中，每孔加入500 µL培养基；为分析多聚唾液酸，将1 × 106个细胞接种于直径6 cm的细胞培养皿中，加入3 mL培养基。于37 °C和5% CO2条件下孵育，每24小时更换一次培养基。 
		注意：代谢性糖工程（MGE）的效果随处理总时间的延长而增强。为获得较高的代谢效率，建议处理细胞5–7天。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>处理结束后，倾去培养基，用PBS洗涤培养板/皿。加入胰蛋白酶/EDTA（PBS中含0.25%胰蛋白酶和0.02% EDTA）孵育10分钟使细胞脱离。向脱离的细胞中加入等体积的细胞培养基以中和胰蛋白酶活性。将细胞悬液转移至15 mL塑料离心管中。在500 × g条件下离心3分钟，弃去上清液。
	<ol>
		<li>加入5 mL PBS重悬细胞并离心（参见步骤3.3），重复洗涤两次。 
		注意：去尽上清液后的细胞沉淀可在-20 °C保存数天。若需进一步分析多聚唾液酸的表达，请继续进行第10节操作。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 用于高效液相色谱分析的细胞裂解
<ol>
	<li>高效液相色谱裂解缓冲液的制备
	<ol>
		<li>将5 mL Tris-HCl缓冲液、5 µL抑肽酶溶液、20 µL亮抑蛋白酶肽溶液和50 µL苯甲基磺酰氟（PMSF）溶液混合。 
		注意：5 mL高效液相色谱裂解缓冲液包含150 mM NaCl、10 mM Tris-HCl、5 mM EDTA、1.54 µM抑肽酶、40 µM亮抑蛋白酶肽和1 mM PMSF（pH 8.0）。该缓冲液应在细胞裂解前新鲜配制。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将收集的细胞沉淀（步骤3.3）分别重悬于500 µL预冷的高效液相色谱裂解缓冲液中，使用超声处理器探头在中高振幅下进行三次超声处理，每次30秒。每次超声间隔需将样品置于冰上冷却至少1分钟。</li>
</ol>
5. 分离膜组分
<ol>
	<li>将裂解的细胞样品在 4 °C、20,000 × g 条件下离心 2 小时 &#176;C. 分离上清液（约 480 &#181;L），置于1.5 mL塑料管中。使用以下方法测定这些组分的蛋白浓度： 例如，Bradford 法或二辛可宁酸（BCA）法。 
	注意：胞质组分的蛋白浓度（约 1 mg/mL）可与所测得的相应唾液酸种类的含量进行关联分析。沉淀物代表膜组分，用于步骤 6.1。</li>
</ol>
6. 酸性水解
注意：细胞膜中的寡糖和多糖被水解为单糖。此外，单糖上可能存在的O-修饰也被水解。这是定量高效液相色谱（HPLC）分析所必需的，因为膜组分中的绝大多数唾液酸天然存在于糖缀合物中，并可能带有O-乙酰基或O-乳酰基修饰。
<ol>
	<li>向分离的膜组分（第5步中的沉淀）中加入150 µL 1 M TFA溶液。在80 °C下以200 - 600 rpm振荡孵育样品4小时。</li>
	<li>使用带有3 kDa截留膜的0.5 mL滤管，在20,000 × g、21 °C条件下离心约30分钟，直至上层液体体积少于20 µL。 
	注意：此步骤对于去除高分子量碎片至关重要。</li>
	<li>将含有小分子（包括唾液酸种类）的下层液体转移至2 mL塑料管中。用细针在塑料管盖上刺2 - 4个小孔。使用液氮快速冷冻样品，然后过夜冻干。 
	注意：干燥后的样品可在室温下保存数天。如需长期保存，请更换为无孔管盖。</li>
</ol>
7. 荧光标记
<ol>
	<li>将干燥的样品重新悬浮于10 µL 120 mM TFA溶液中，并加入50 µL DMB溶液。将样品转移至避光的1.5 mL离心管中，以防紫外线照射。</li>
	<li>对于标准品，在避光的1.5 mL离心管中，将1 µL Neu5Ac（60 ng/mL，溶于水）或1 µL Neu5Gc（60 ng/mL，溶于水）溶解于10 µL 120 mM TFA溶液中，再加入50 µL DMB溶液。</li>
	<li>将细胞膜样品和标准品在56 °C避光条件下孵育1.5小时。孵育结束后，向每个样品中加入4 µL 400 mM NaOH溶液以终止标记反应。</li>
</ol>
8. 高效液相色谱分析
注意：标记的样品在配备C18反相柱（110 Å，3 µm粒径，4.6 x 150 mm）、荧光检测器和馏分收集器的高效液相色谱（HPLC）系统上进行分析。所用溶剂为甲醇、乙腈和水。如果HPLC系统无内置脱气装置，测量前务必对所有溶剂进行脱气处理。
<ol>
	<li>将色谱柱温度设置为 40 &#176;C，并将荧光检测器的激发波长设置为373 nm，发射波长设置为448 nm。进样10 &#181;取1 L样品体积，以甲醇/乙腈/水（6:8:86）为流动相，流速0.5 mL/min，分离探针50 min。进行质谱分析时，收集目标峰。 
	注意：Neu5Gc 预计在 6–8 分钟后洗脱，Neu5Ac 在 9 分钟后&#160;12 分钟，Neu5Prop 在 17–23 分钟，Neu5But 在 38–44 分钟。分馏后的样品可在 4 °C 保存数小时。 &#176;避光保存。</li>
	<li>每次测定完样品后，在1.0 mL/min流速下用7.5 min冲洗色谱柱（&#8776; 1.5 柱体积）甲醇/乙腈/水（6:25:69），然后以甲醇/乙腈/水（6:8:86）在 1.0 mL/min 流速下重新平衡系统 7.5 分钟。</li>
	<li>对于定量分析，使用相应高效液相色谱系统（HPLC）的操作软件，计算目标唾液酸峰的峰面积。22. 
	注意：所获得的数据可与Neu5Ac或Neu5Gc标准品以及胞质组分中测得的蛋白浓度进行比较（见第5.1节）。</li>
</ol>
9. 唾液酸单糖的质谱分析
注意：可通过液相色谱（LC）电喷雾电离质谱法（ESI-MS）进一步分析目标HPLC保留峰，以确认非天然唾液酸种类。
<ol>
	<li>进行质谱分析时，将20 µL收集的样品注入液相色谱/质谱选择性检测器（LC/MSD）系统，以79.9%甲醇、20%异丙醇和0.1%甲酸作为流动相，流速为0.5 mL/min，毛细管电压为4 kV，毛细管温度为350 °C22,23。</li>
	<li>在相应LC/MSD系统的分析软件中，从总离子流色谱图中选择目标峰，查看该分离峰的质谱图，并显示质荷比（m/z）在300至700之间的正离子模式谱图。 
	注意：使用DMB对唾液酸进行标记会导致其分子量增加116.2 g/mol。DMB标记的唾液酸种类具有以下分子量：DMB-Neu5Ac = 424.2 g/mol，DMB-Neu5Gc = 441.8 g/mol，DMB-Neu5Prop = 436.2 g/mol，DMB-Neu5But = 453.2 g/mol。常见的加合物包括乙腈、钠离子或异丙醇。</li>
</ol>
10. 凯利神经母细胞瘤细胞中多聚唾液酸的蛋白质印迹分析
<ol>
	<li>细胞裂解液的制备
	<ol>
		<li>向第 3.3 步获得的细胞沉淀中加入 1 mL Western blot 裂解缓冲液，涡旋混匀。冰上孵育 30 分钟，每 5 分钟涡旋一次。将样品在 4 °C、20,000 × g 条件下离心 1.5 小时。 &#176;C. 收集含有裂解细胞蛋白的上清液。</li>
		<li>测定蛋白质组分的蛋白浓度， 例如，Bradford 法或 BCA 法。将样品稀释至蛋白质浓度为 1.5 &#181;克/&#181;L，溶于裂解缓冲液中。</li>
		<li>将样品与上样缓冲液混合，按比例加入10 μL上样缓冲液，充分混匀后置于沸水浴中加热5-10分钟以变性蛋白质，随后置于冰上冷却，待进行SDS-PAGE分析。 &#181;L Laemmli 样品缓冲液至 90 &#181;L蛋白组分（1.5 &#181;克&#181;L）并将样品煮沸 5 分钟24.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>免疫印迹
	<ol>
		<li>使用8% SDS-丙烯酰胺凝胶，浓度为20 - 30 &#181;L型胶槽，厚度为0.75或1 mm。在室温下以25 mA电流电泳2小时。</li>
		<li>小心地从凝胶上取下玻璃盖。切下并丢弃含有加样孔的凝胶上部。将凝胶置于一张硝酸纤维素膜（0.2 μm）上 &#181;m），此前已用Western blot缓冲液浸泡。根据系统的建议，将蛋白质转移至硝酸纤维素膜例如， 4℃下，250 mA 反应 1 小时 &#176;C）。</li>
		<li>从印迹系统中取出硝酸纤维素膜，用丽春红（Ponceau red）染色以显示蛋白质。将硝酸纤维素膜转移至塑料染色缸中，加入10 mL封闭液，在室温下孵育1小时，或在4 °C下孵育过夜。 &#176;C.</li>
		<li>倾倒封闭液，加入单克隆抗多聚唾液酸735抗体（1 &#181;g/mL）的 PBS 溶液中，在室温下孵育 1 小时，或在 4 °C 下孵育过夜 &#176;C. 孵育后，用 PBS 洗涤膜至少三次，每次 5 分钟。</li>
		<li>加入多克隆山羊抗小鼠 IgG 二抗（1 &#181;g/mL）与辣根过氧化物酶（HRP）或荧光标记物在 PBS 中孵育。室温下孵育膜 1 小时。孵育后，用 PBS 洗涤膜至少三次，每次 5 分钟。</li>
		<li>将膜转移至适当成像仪的成像板上，按照制造商说明书检测信号。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

如果通过质谱分析化学合成的 ManNAc 衍生物 ManNProp 和 ManNBut，应仅检测到两种样品正确的质荷比峰。因此，可认为产物纯度超过 99%。在裂解细胞的膜组分中可检测到少量通常不存在于人类细胞中的 Neu5Gc29。这很可能通过一种补救途径实现，该途径从培养基中胎牛血清的唾液酸糖缀合物中回收 Neu5Gc30。使用唾液酸生物合成的天然前体 ManNAc 处理细胞，可显著降低细胞表面 Neu5Gc 表位的表达。
迄今为止，在所有被研究的细胞中，修饰型甘露糖胺的应用几乎无毒性。细胞能够耐受培养基中较高毫摩尔浓度的糖类，这是必要的，因为目前尚无特异性的N-酰基甘露糖胺转运蛋白。已有研究表明，N-酰基甘露糖胺的应用可激活信号转导通路，这可能影响细胞的生长或分化31,32。但这种效应究竟是由于唾液酸化模式的改变，还是反映了对修饰型...

唾液酸是一种单糖，通常存在于糖缀合物的非还原末端，例如N-和O-聚糖或糖脂。在所有单糖中，唾液酸具有一些独特的化学特性：它具有9个碳原子的骨架结构，C-1位上有一个羧基，在生理条件下该羧基发生去质子化而带负电荷，C-5位上则含有一个氨基。尽管迄今为止已鉴定出50多种天然存在的唾液酸变异体1，但在人类中最主要的唾液酸形式是N-乙酰神经氨酸（Neu5Ac）。其他哺乳动物还表达较大量的N-羟乙酰神经氨酸（Neu5Gc）2,3。
由于唾液酸在糖缀合物中处于暴露位置，因此参与了大量受体-配体相互作用，例如流感病毒血凝素依赖性的与宿主细胞的结合4。一种具有重要生物学功能的唾液酸表位是多聚唾液酸，尤其在胚胎发育及神经系统中发挥关键作用。多聚唾液酸是由多达200个α2,8-连接的唾液酸组成的聚合物。多聚唾液酸的主要蛋白载体是神经细胞黏附分子（NCAM）。多聚唾液酸的表达可调节NCAM的黏附特性，其表达会降低细胞黏附性，并增强神经系统的可塑性5。
（多）唾液酸表达水平的变化最终会影响多种不同的生物学相互作用。这可用于在分子水平上研究已知的依赖唾液酸的生物学过程，揭示新的糖缀合物相互作用，或探索潜在的治疗策略。目前已有多种方法可用于调控细胞表面唾液酸的表达，例如使用特异性针对唾液酸的糖苷酶（唾液酸酶）进行处理、抑制唾液酸生物合成相关酶的活性6,7,8，或敲低或改变唾液酸生物合成关键酶的表达9。
另一种调控唾液酸表达的多功能方法是代谢糖工程（MGE，也称为代谢寡糖工程，MOE）。在此方法中，细胞、组织甚至动物被施用带有C2位氨基修饰的非天然ManNAc衍生物。作为唾液酸的前体分子，这些ManNAc类似物在被细胞摄取后，会单向代谢生成非天然唾液酸，并可表达于唾液酸化糖缀合物上。使用带有脂肪族C2修饰的ManNAc衍生物（如ManNProp或ManNBut）处理的细胞确实会将其掺入 N丙酰基神经氨酸（Neu5Prop）或 N唾液酸丁酰化物（Neu5But）在其糖缀合物中10,11通过在 ManNAc 的 C2 位引入官能团，可将产生的非天然唾液酸进行偶联， 例如， 通过施陶丁格连接反应或叠氮-炔环加成反应，与荧光染料连接，从而在细胞表面可视化12.
这些非天然唾液酸的表达对多种生物过程具有引人注目的影响，包括病原体感染、肿瘤细胞的黏附与迁移、普通细胞黏附，以及血管生成和细胞分化（综述见：Wratil et al.13）。有趣的是，使用N-酰基修饰的甘露糖胺进行代谢标记（MGE）也可用于干扰多聚唾液酸的表达。多聚唾液酸由两种不同的多聚唾液酸转移酶（ST8SiaII 和 ST8SiaIV）催化生成。已有研究表明，非天然唾液酸前体（如 ManNProp 或 ManNBut）可抑制多聚唾液酸转移酶 ST8SiaII 的活性14,15。此外，在人神经母细胞瘤细胞中的研究已证实，应用 ManNProp 或 ManNBut 也会整体降低唾液酸化水平15。
MGE 与 N-酰基修饰的甘露糖胺是一种易于应用的方法，已成功用于哺乳动物和细菌细胞培养，以及多种不同物种的完整动物体内 秀丽隐杆线虫16斑马鱼17，或小鼠18,19,20,21特别是带有脂肪族修饰的 ManNAc 衍生物（包括 ManNProp 和 ManNBut），即使在细胞培养基或血浆中达到毫摩尔浓度时，也几乎无细胞毒性。此外，这些化合物相对易于合成。
在此，我们提供有关如何使用MGE的详细说明 N-N-乙酰化修饰的甘露糖胺。首先，介绍了该领域中两种最常用的ManNAc衍生物ManNProp和ManNBut的化学合成方法。接着，我们展示了如何将MGE应用于一个 体内 实验。以神经母细胞瘤细胞系Kelly为例，通过Western blot检测显示，经ManNAc衍生物处理后，多聚唾液酸表位的表达水平降低。细胞表面的非天然唾液酸通过高效液相色谱（HPLC）进行定量，并进一步通过质谱分析进行表征。

<table><tbody><tr><td>细胞</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>92110411</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 培养基</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R8758</td><td></td></tr><tr><td>75 ml 组织培养瓶</td><td>Greiner</td><td>690175</td><td></td></tr><tr><td>48 孔板</td><td>Corning</td><td>3548</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清（FCS）</td><td>PAA</td><td>A15-102</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素溶液（Pen/Strep）</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶</td><td>Gibco</td><td>15400-054</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Roth</td><td>X986.1</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Serva</td><td>37190.03</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Roth</td><td>2326.2</td><td></td></tr><tr><td>SDS-PAGE 电泳设备（电泳槽、玻璃器皿等）</td><td>VWR</td><td>SDS Gel/Blot</td><td></td></tr><tr><td>丙烯酰胺</td><td>Roth</td><td>3019.1</td><td></td></tr><tr><td>蛋白分子量标准</td><td>Fisher Scientific</td><td>267620</td><td></td></tr><tr><td>硝酸纤维素膜</td><td>GE Healthcare</td><td>10600002</td><td></td></tr><tr><td>丽春红（Ponceau red）</td><td>Roth</td><td>5938.2</td><td></td></tr><tr><td>脱脂奶粉</td><td>Roth</td><td>T145.3</td><td></td></tr><tr><td>化学发光试剂（ECL）</td><td>Millipore</td><td>WBLUF 0500</td><td></td></tr><tr><td>0.5 ml 离心过滤管，含 3 kDa 超滤膜</td><td>Merck-Millipore</td><td>UFC500324</td><td></td></tr><tr><td>15 mL 离心管</td><td>Sigma-Aldrich (Corning)</td><td>CLS430791-500EA</td><td></td></tr><tr><td>2-巯基乙醇</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6250-10ML</td><td></td></tr><tr><td>2-丙醇</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34965-1L</td><td>HPLC 梯度级</td></tr><tr><td>4,5-亚甲二氧基-1,2-苯二胺二盐酸盐</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4784-50MG</td><td></td></tr><tr><td>48 孔平底组织培养板</td><td>Sigma-Aldrich (Corning)</td><td>CLS3548-100EA</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 离心管</td><td>Sigma-Aldrich (Corning)</td><td>CLS430829-500EA</td><td></td></tr><tr><td>乙腈</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34967-1L</td><td>HPLC 梯度级</td></tr><tr><td>牛肺抑肽酶（Aprotinin）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A1153-10MG</td><td>冻干粉末，3-8 TIU/mg 固体</td></tr><tr><td>丁酰氯</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>109614-250G</td><td></td></tr><tr><td>C18 反相色谱柱</td><td>Phenomenex</td><td>00F-4435-E0</td><td>110 &amp;Aring;, 3 &amp;micro;m 粒径，4.6 x 150 mm</td></tr><tr><td>D-甘露糖胺盐酸盐</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M4670-1G</td><td></td></tr><tr><td>杜尔贝科磷酸盐缓冲液（Dulbecco's Phosphate Buffered Salt Solution）</td><td>PAN Biotech</td><td>P04-36500</td><td></td></tr><tr><td>乙二胺四乙酸（Ethylenediaminetetraacetic acid）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E9884-100G</td><td></td></tr><tr><td>甲酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>56302-50ML-GL</td><td></td></tr><tr><td>盐酸溶液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H1758-100ML</td><td>36.5-38.0%，溶于水</td></tr><tr><td>亮抑蛋白酶肽（Leupeptin）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L2884-10MG</td><td></td></tr><tr><td>甲醇</td><td>Carl-Roth</td><td>T169.2</td><td>HPLC 梯度级</td></tr><tr><td>N-乙酰-D-甘露糖胺</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8176-250MG</td><td></td></tr><tr><td>N-乙酰神经氨酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A0812-25MG</td><td></td></tr><tr><td>N-羟乙酰神经氨酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9793-10MG</td><td></td></tr><tr><td>苯甲基磺酰氟（Phenylmethanesulfonyl fluoride）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7626-250MG</td><td></td></tr><tr><td>丙酰氯</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P51559-500G</td><td></td></tr><tr><td>避光安全锁扣管，1.5 mL，棕色（避光）</td><td>Eppendorf</td><td>30120191</td><td></td></tr><tr><td>安全锁扣管，1.5 mL，无色</td><td>Eppendorf</td><td>30120086</td><td></td></tr><tr><td>亚硫酸氢钠溶液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>13438-1L-R-D</td><td>40%，溶于水</td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>746398-500G-D</td><td></td></tr><tr><td>氢氧化钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>795429-500G-D</td><td></td></tr><tr><td>氢氧化钠溶液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>319511-500ML</td><td>1.0 M，溶于水</td></tr><tr><td>甲醇钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>164992-5G</td><td></td></tr><tr><td>三氟乙酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6508-100ML-D</td><td></td></tr><tr><td>Tris 盐酸盐</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T5941-100G</td><td></td></tr><tr><td>含 0.25% 胰蛋白酶和 0.02% EDTA 的 PBS 溶液</td><td>PAN Biotech</td><td>P10-019100</td><td></td></tr><tr><td>水</td><td>Carl-Roth</td><td>T905.1</td><td>HPLC 梯度级</td></tr><tr><td>硅胶 60</td><td>Carl-Roth</td><td>9779.1</td><td></td></tr><tr><td>高效液相色谱仪（HPLC）</td><td>Agilent</td><td></td><td></td></tr><tr><td>电喷雾离子化质谱系统（ESI-MSD-System）</td><td>Agilent</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

利用n-酰基修饰的甘露糖胺对唾液酸进行代谢性糖工程改造

Metabolic Glycoengineering of Sialic Acid Using N-acyl-modified Mannosamines

唾液酸（Sia）是糖缀合物（如N-和O-聚糖或糖脂）中一种极为重要的组成成分。由于其位于寡糖和多糖的非还原末端，并具有独特的化学特性，唾液酸参与了多种不同的受体-配体相互作用。通过修饰细胞表面唾液酸的表达，可进而影响依赖于唾液酸的相互作用。这种方法有助于研究唾液酸依赖性相互作用，并可能以有益的方式影响某些疾病的发展。通过代谢性糖工程（MGE）技术，可以调控细胞表面唾液酸的表达。该方法通过使用C2位修饰的N-乙酰甘露糖胺（ManNAc）衍生物处理细胞、组织甚至整个动物来实现。这些氨基糖作为唾液酸的前体分子，在细胞内被代谢为相应的唾液酸种类，并表达于糖缀合物上。应用该方法可在多种生物学过程中产生引人注目的效应。例如，它可显著降低&#160;经处理神经元细胞中多聚唾液酸（polySia）的表达，从而影响神经元的生长与分化。本文展示了两种最常见的C2位修饰的N-酰基甘露糖胺衍生物——N-丙酰基甘露糖胺（ManNProp）和N-丁酰基甘露糖胺（ManNBut）的化学合成方法，并进一步说明如何在细胞培养实验中应用这些非天然氨基糖。修饰型唾液酸的表达水平通过高效液相色谱法（HPLC）进行定量，并结合质谱分析进一步确认。对多聚唾液酸表达的影响则通过使用商业化多聚唾液酸抗体进行蛋白质印迹（Western blot）分析加以阐明。

荧光标记的Neu5Ac和Neu5Gc标准品的高效液相色谱图如图2所示。采用本文所述方法，DMB标记的Neu5Gc通常在7 - 9分钟的洗脱时间内出峰，而DMB-Neu5Ac则在10 - 12分钟之间出峰。色谱图中通常在2 - 6分钟之间出现若干较小的峰，这些峰代表未反应的DMB及反应中间产物25。
图3展示了细胞裂解液的代表性色谱图。与DMB标记的标准品色谱图（图2）相比，这些色谱图中可见多个未定义的峰。这很可能是因为细胞裂解液本身存在内源性杂质，以及DMB不仅与唾液酸种类反应，还与细胞裂解液中存在的其他α-酮酸（如丙酮酸、琥珀酸和α-酮戊二酸）发生反应所致26。此外，也可能存在少...

唾液酸是糖缀合物中常见的一种单糖单元，参与多种分子和细胞间的相互作用。本文介绍一种利用代谢性糖工程修饰细胞表面唾液酸表达的方法， N乙酰甘露糖胺衍生物

利用N-酰基修饰的甘露糖胺对唾液酸进行代谢性糖工程改造

唾液酸（Sia）是糖缀合物（如N-和O-聚糖或糖脂）中一种极为重要的组成成分。由于其位于非还原端的特殊位置……

该技术的总体目标是生成具有修饰唾液酸表达的细胞或细胞衍生产物。因此，将细胞用N-酰基修饰的甘露糖胺处理，这些甘露糖胺会被代谢为相应的唾液酸，并随后在细胞表面表达。该方法有助于解答糖生物学领域中的关键问题，例如糖缀合物对受体-配体相互作用的影响。该技术的主要优势在于其易于应用且具有纯粹的细胞毒性。为了演示代谢性糖工程，我们将使用市售的N-乙酰甘露糖胺。此外，我们还将演示N-丙酰基和N-丁酰基甘露糖胺的合成与应用。代谢性糖工程对多聚唾液酸表达的生物学效应如图所示。首先，将431.2毫克甘露糖胺盐酸盐溶解于含有磁力搅拌子的15毫升玻璃瓶中的10毫升3毫摩尔甲醇钠溶液中。将混合物置于冰上冷却至0摄氏度。搅拌的同时，将210 µL丙酰氯逐滴缓慢加入溶液中。然后，在0 °C下孵育搅拌中的混合物4小时。随后，将溶液转移至50 mL塑料管中，并用细针在管盖上刺4到8个孔。使用液氮快速冷冻溶液。然后将样品冻干至完全干燥。冻干后，将干燥产物溶于乙酸乙酯、甲醇和水中。使用移液器将溶液加载到预先制备好的硅胶柱上。用500毫升溶剂洗脱后，收集4毫升的馏分。将洗脱的馏分转移至15毫升塑料管中，并用细针在管盖上刺3至6个小孔。用液氮冷冻溶液后，将样品冻干至完全干燥。在37摄氏度和5%二氧化碳条件下，于RPMI培养基中培养Kelly神经母细胞瘤细胞。在施用甘露糖胺之前，用胰蛋白酶和EDTA孵育10分钟，使Kelly神经母细胞瘤细胞脱离。用RPMI培养基中和胰蛋白酶后，使用血细胞计数板对细胞进行计数。为检测唾液酸单糖，将细胞接种于48孔组织培养板中，每孔加入500微升培养基。为分析多聚唾液酸，将细胞接种于六厘米直径的细胞培养皿中，加入三毫升培养基。将溶于RPMI中的相应甘露糖胺衍生物加入新铺板的细胞中，终浓度为5毫摩尔，在37摄氏度、5%二氧化碳条件下培养，每24小时更换含有N-酰基修饰的甘露糖胺的培养基。处理结束后，倾去培养基，用PBS洗涤细胞。加入胰蛋白酶和EDTA，孵育10分钟，使细胞脱离。向脱离的细胞中加入与胰蛋白酶等体积的细胞培养基以中和胰蛋白酶。随后，将脱离的细胞转移至15毫升塑料离心管中。在500 × g条件下离心3分钟。弃去上清液后，用5毫升磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞3次。离心后，将收集的细胞沉淀重悬于500 µL预冷的HPLC裂解缓冲液中。使用超声处理器探头以中高振幅对样品进行三次超声处理，每次30秒，每次超声间隔将样品置于冰上冷却至少1分钟。将裂解后的细胞样品离心后，将上清液与膜组分分离至1.5 mL塑料离心管中。进行酸水解时，向分离的膜组分中加入150微升1摩尔的三氟乙酸（TFA）溶液。在80摄氏度下振荡孵育样品4小时，转速为200至600转/分钟。随后，将样品转移至含有3千道尔顿截留膜的0.5毫升滤管中。将样品在20,000 × g、21 °C条件下离心约30分钟，直至上层相体积小于20微升。随后弃去插入物，并用细针在含有超滤液的离心管盖上刺2至4个小孔。用液氮冷冻样品后，冷冻干燥过夜。将干燥的样品重悬于 10 微升 120 毫摩尔的三氟乙酸（TFA）溶液中，并加入 50 微升 DMB 溶液。将样品转移至避光的 1.5 毫升离心管中，以避免紫外光照射。将细胞膜样品和标准品在 56 摄氏度下孵育 1.5 小时。孵育后，向每个样品中加入4微升400毫摩尔的氢氧化钠溶液，以终止标记反应。进行高效液相色谱分析时，将色谱柱温度设置为40摄氏度，并将荧光检测器的激发波长设为373纳米，发射波长设为448纳米。进样体积为10微升，在0.5毫升/分钟的流速下，以甲醇、乙腈和水作为流动相，分离探针15分钟。进行质谱分析时，将每份收集的高效液相色谱样品各取 20 微升注入液相色谱-质谱选择性检测器系统。在液相色谱-质谱选择性检测器系统的分析软件中，于总离子流色谱图中选择目标峰。查看该分离峰的质谱图，并显示其在质荷比 300 至 700 范围内的正离子质谱信号。向先前制备的糖工程化细胞沉淀中加入一毫升 Western blot 裂解缓冲液，涡旋混匀。将样品置于冰上孵育 30 分钟，每 5 分钟涡旋一次。随后，在 4°C 条件下以 20,000 × g 离心 1.5 小时。然后，将含有裂解细胞蛋白的上清液收集到1.5毫升离心管中。通过向每份90微升蛋白组分中加入10微升Laemmli上样缓冲液来制备SDS-PAGE样品。将样品煮沸5分钟。将样品上样至8% SDS-丙烯酰胺凝胶后，在室温下以25毫安的电流运行电泳2小时。电泳结束后，小心地从凝胶上取下玻璃盖板，并切去含有上样孔的凝胶上部。接着，将凝胶置于预先用Western印迹缓冲液浸泡过的0.2微米硝酸纤维素膜上。根据系统的建议将蛋白质转移至硝酸纤维素膜上。从转印系统中取出硝酸纤维素膜后，用丽春红（Ponceau red）染色以显示蛋白质，从而检测转印质量。随后，将硝酸纤维素膜放入塑料孵育盒中，并加入10毫升封闭液。孵育硝酸纤维素膜后，倒掉封闭液，加入PBS中的单克隆抗多聚唾液酸735抗体。孵育后，用PBS至少洗涤膜三次，每次五分钟。然后，向硝酸纤维素膜中加入与辣根过氧化物酶偶联的多克隆抗小鼠IgG二抗。孵育并洗涤膜后，将其转移至合适成像仪的成像板上，随后根据制造商说明书检测信号。DMB标记的N-羟乙酰神经氨酸在7至9分钟之间洗脱。此外，DMB标记的N-乙酰神经氨酸在10至12分钟之间洗脱。色谱图中观察到的几个较小峰代表未反应的DMB及反应中间产物。细胞裂解液的高效液相色谱图显示多个未明确的峰，这些峰代表细胞裂解液中的内源性杂质以及DMB与其中存在的其他α-酮酸反应产生的副产物。使用N-乙酰甘露糖胺处理通常会导致细胞表面N-羟乙酰神经氨酸的耗竭。在经N-丙酰神经氨酸或N-丁酰神经氨酸处理的裂解细胞色谱图中，可观察到表明相应非天然唾液酸出现的峰。DMB与唾液酸种类发生反应后，其分子质量较未标记该染料的唾液酸种类增加116.2道尔顿。除了具有活性的离子种类外，还观察到钠加合物。DMB-Neu5Gc 的洗脱时间紧随未反应或部分反应的 DMB 物种之后，这解释了 DMB-Neu5Gc 质谱图中出现未定义峰的原因。用 N-丙酰基甘露糖胺或 N-丁酰基甘露糖胺处理 Kelly 神经母细胞瘤细胞，会导致细胞表面多唾液酸的表达降低。另一方面，使用N-乙酰甘露糖胺处理可导致多聚唾液酸表达增加。通过应用该技术，可在数天内生成完全唾液酸化的细胞。此类糖工程改造细胞可用于后续实验。例如，可用于研究受体-配体相互作用，或如本例所示，用于抑制多唾液酸的表达。本文所展示的代谢工程操作流程已针对唾液酸实验进行了优化，但该流程同样可用于动物实验。我们希望，本文提供的实验方案及本视频能够帮助研究人员将代谢性糖工程引入实验室，以分析唾液酸及其受体在生物系统中的功能与生物学作用。有机化学家可合成具有更复杂结构的N-酰基修饰型甘露糖胺，并按照本方案建议的方法加以使用。根据本方案，所有样品均应在荧光标记后立即进行分析。因此，高效液相色谱仪与交流质谱仪之间的分析应无缝衔接，不得有任何延迟。

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