利用N-酰基修饰的甘露糖胺对唾液酸进行代谢性糖工程改造

该技术的总体目标是生成具有修饰唾液酸表达的细胞或细胞衍生产物。因此，将细胞用 N-酰基修饰的甘露糖胺处理，这些甘露糖胺在细胞内代谢为相应的唾液酸，并随后在细胞表面表达。该方法有助于回答糖生物学领域中的关键问题，例如糖缀合物对受体-配体相互作用的影响。

该技术的主要优势在于其易于应用且具有纯粹的细胞毒性。为了演示代谢性糖工程，我们将使用市售的 N-乙酰甘露糖胺。此外，我们还将演示 N-丙酰基和 N-丁酰基甘露糖胺的合成与使用。

展示了代谢性糖工程对多聚唾液酸表达的生物学效应。首先，将431.2毫克甘露糖胺盐酸盐溶解于含有磁力搅拌子的15毫升玻璃瓶中的10毫升3毫摩尔甲醇钠溶液中。将混合物置于冰上冷却至0摄氏度。

搅拌的同时，将210 µm丙酰氯逐滴缓慢加入溶液中。然后，在0 °C下孵育搅拌中的混合物4小时。随后，将溶液转移至50 mL塑料管中，并用细针在管盖上刺4到8个孔。

使用液氮快速冷冻溶液。然后将样品冻干至完全干燥。冻干后，将干燥产物溶于乙酸乙酯、甲醇和水中。

使用移液器将溶液加载到预先制备好的硅胶柱上。用500毫升溶剂洗脱后，收集每份4毫升的洗脱组分。将洗脱得到的组分转移至15毫升塑料管中，并用细针在管盖上刺3至6个小孔。

用液氮冷冻溶液后，将样品冻干至完全干燥。在37摄氏度和5%二氧化碳条件下，用RPMI培养基培养Kelly神经母细胞瘤细胞。在应用甘露糖胺之前，用胰蛋白酶和EDTA孵育10分钟，使Kelly神经母细胞瘤细胞脱落。

用RPMI培养基中和胰蛋白酶后，使用血细胞计数板对细胞进行计数。为检测唾液酸单糖，将细胞接种于48孔组织培养板中，每孔加入500微升培养基。为分析多聚唾液酸，将细胞接种于六厘米直径的细胞培养皿中，加入三毫升培养基。

将溶于RPMI的相应甘露糖胺衍生物加入新铺板的细胞中，终浓度为5毫摩尔，在37摄氏度、5%二氧化碳条件下培养，每24小时更换含有N-酰基修饰甘露糖胺的培养基。处理结束后，倾去培养基，用PBS洗涤细胞。用胰蛋白酶和EDTA孵育10分钟，使细胞脱离。

通过向脱离的细胞中加入等体积的细胞培养基来中和胰蛋白酶。随后，将脱离的细胞转移至15毫升塑料离心管中。在500 × g 条件下离心3分钟。弃去上清液后，用5毫升磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞3次。

离心后，将收集的细胞沉淀重悬于500 µL预冷的HPLC裂解缓冲液中。使用超声处理器探头以中高振幅对样品进行三次超声处理，每次30秒，每次超声间隔将样品置于冰上冷却至少1分钟。裂解后的细胞样品再次离心，将上清液与膜组分分离，分装至1.5 mL塑料离心管中。

进行酸水解时，向分离的膜组分中加入150微升1摩尔的三氟乙酸（TFA）溶液。在80摄氏度下振荡孵育样品4小时，转速为200至600转/分钟。随后，将样品转移至含有3千道尔顿截留膜的0.5毫升滤管中。

将样品在21摄氏度条件下以20,000 × g离心约30分钟，直至上层相体积小于20微升。随后弃去插入物，并用细针在含有超滤液的管盖上刺穿两到四个小孔。用液氮冷冻样品后，进行过夜冻干。

将干燥的样品重悬于10 µL 120 mM TFA溶液中，并加入50 µL DMB溶液。将样品转移至避光的1.5 mL离心管中，以避免紫外光照射。将细胞膜样品和标准品在56 °C下孵育1.5小时。

孵育后，向每个样品中加入4微升400毫摩尔/升的氢氧化钠溶液，以终止标记反应。进行高效液相色谱分析时，将色谱柱温度设置为40摄氏度，并将荧光检测器的激发波长设为373纳米，发射波长设为448纳米。进样体积为10微升，在0.5毫升/分钟的流速下，以甲醇、乙腈和水作为流动相，运行15分钟以分离探针。

进行质谱分析时，将每份收集的高效液相色谱样品各取 20 微升注入液相色谱-质谱联用系统。在液相色谱-质谱联用系统的分析软件中，于总离子流色谱图中选择目标峰。查看该分离峰的质谱图，并显示其质荷比在 300 至 700 范围内的正离子模式质谱信号。

向先前制备的糖工程化细胞沉淀中加入一毫升 Western blot 裂解缓冲液，涡旋混匀。将样品置于冰上孵育 30 分钟，每 5 分钟涡旋一次。随后，在 4°C 条件下以 20,000 × g 离心 1.5 小时。

然后，将含有裂解细胞蛋白的上清液收集到1.5毫升离心管中。通过向每份90微升的蛋白组分中加入10微升Laemmli上样缓冲液来制备SDS-PAGE样品。将样品煮沸5分钟。

将样品加入8% SDS-丙烯酰胺凝胶后，在室温下以25毫安的电流运行电泳2小时。电泳结束后，小心地从凝胶上取下玻璃盖板，并切去含有加样孔的凝胶上部。接着，将凝胶置于预先用Western印迹缓冲液浸泡过的0.2微米硝酸纤维素膜上。

根据系统说明书将蛋白质转移至硝酸纤维素膜上。从转印装置中取出硝酸纤维素膜后，用丽春红（Ponceau red）染色以显示蛋白质，从而检测转印质量。随后，将硝酸纤维素膜转移至塑料孵育盒中，并加入10毫升封闭液。

孵育硝酸纤维素膜后，倒掉封闭液，加入PBS中的单克隆抗多聚唾液酸735抗体。孵育后，用PBS至少洗涤膜三次，每次五分钟。然后，向硝酸纤维素膜中加入与辣根过氧化物酶偶联的多克隆抗小鼠IgG二抗。

孵育并洗涤膜后，将其转移至适当成像仪的成像板上。随后，根据制造商的说明检测信号。DMB标记的N-羟乙酰神经氨酸在7至9分钟之间洗脱。

此外，DMB标记的N-乙酰神经氨酸在10至12分钟之间洗脱。色谱图中观察到的几个较小峰代表未反应的DMB及反应中间产物。细胞裂解液的高效液相色谱（HPLC）色谱图显示出多个未明确的峰，这些峰代表了内源性杂质以及DMB与细胞裂解液中存在的其他α-酮酸反应产生的副产物。

使用 N-乙酰甘露糖胺处理通常会导致细胞表面 N-糖基化神经氨酸的减少。在经 N-丙酰基神经氨酸或 N-丁酰基神经氨酸处理的裂解细胞色谱图中，可观察到表明相应非天然唾液酸出现的色谱峰。DMB 与唾液酸种类发生反应后，其分子量相较于未标记该染料的唾液酸种类增加 116.2 道尔顿。

除了具有增强离子化的物种外，还观察到钠加合物。DMB-Neu5Gc 的洗脱时间紧随未反应或部分反应的 DMB 物种之后，这解释了 DMB-Neu5Gc 质谱图中出现未定义峰的原因。用 N-丙酰基甘露糖胺或 N-丁酰基甘露糖胺处理 Kelly 神经母细胞瘤细胞，会导致细胞表面多唾液酸的表达减少。

另一方面，使用N-乙酰甘露糖胺处理可导致多聚唾液酸表达增加。通过应用该技术，可在数天内生成完全唾液酸化的细胞。这类糖基工程化细胞可用于后续实验。

例如，可用于研究受体-配体相互作用，或如本例所示，用于抑制多唾液酸的表达。此处介绍的代谢工程操作流程已针对唾液酸实验进行了优化，但该流程同样可用于动物实验。

我们希望，本文提供的实验方案及本视频能够帮助研究人员将代谢性糖工程引入实验室，以分析唾液酸及其受体在生物系统中的功能与生物学作用。有机化学家可合成具有更复杂结构的N-酰基修饰型甘露糖胺，并按照本方案建议加以使用。根据本方案，所有样品均应在荧光标记后立即进行分析。

因此，高效液相色谱仪与交流磁化率仪之间的分析应无延迟。