利用N酰基修饰 Mannosamines 对唾液酸的代谢 Glycoengineering

该技术的总体目标是产生具有修饰唾液酸表达的细胞或细胞衍生产物。因此，用 N-酰基修饰的甘露糖胺处理细胞，这些甘露糖胺被代谢成相应的唾液酸，随后在细胞表面表达。这种方法可以帮助回答糖生物学领域的关键问题，例如糖缀合物对受体-配体相互作用的影响。

该技术的主要优点是易于应用且具有纯细胞毒性。为了演示代谢糖工程，我们将使用市售的 N-乙酰甘露糖胺。此外，我们将演示 N-丙酰和 N-丁酰甘露糖胺的合成和用途。

显示了代谢糖工程对多唾液酸表达的生物学效应。首先，将 431.2 毫克盐酸甘露糖胺溶解在 10 毫升三毫摩尔甲醇钠溶液中，溶于装有搅拌棒的 15 毫升玻璃瓶中。在冰上将混合物冷却至零摄氏度。

搅拌的同时，向溶液中缓慢滴加 210 微米的丙酰氯。然后，将搅拌混合物在 0 摄氏度下孵育 4 小时。然后，将溶液转移到 50 毫升塑料管中，并用细针在管帽上戳 4 到 8 个孔。

使用液氮快速冷冻溶液。然后，将样品冻干直至完全干燥。冻干后，将干燥产物溶于乙酸乙酯、甲醇和水。

使用移液管，将溶液加载到先前制备的硅胶柱上。洗脱 500 mL 溶剂后，收集 4 mL 馏分。将洗脱的馏分转移到 15 mL塑料管中，然后用细针在管盖上戳三到六个孔。

用液氮冷冻溶液后，将样品冻干直至完全干燥。在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳的 RPMI 培养基中培养 Kelly 神经母细胞瘤细胞。在应用甘露糖胺之前，通过将 Kelly 神经母细胞瘤细胞与胰蛋白酶和 EDTA 孵育 10 分钟来分离它们。

用 RPMI 培养基中和胰蛋白酶后，使用 Neubauer 室对细胞进行计数。为了测量唾液酸单糖，将细胞置于 500 微升培养基中，放入 48 孔组织培养板中。对于多唾液酸的分析，将细胞置于直径为 6 厘米的细胞培养皿上的 3 毫升培养基中。

将溶解在 RPMI 中的相应甘露糖胺衍生物添加到新铺板的细胞中，终浓度为 5 毫摩尔，并在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳下孵育，每 24 小时更换一次含有 N-酰基修饰甘露糖胺的培养基。处理后，倒出培养基并用 PBS 洗涤细胞。将细胞与胰蛋白酶和 EDTA 一起孵育 10 分钟，以分离细胞。

通过向分离的细胞中加入相同体积的细胞培养基来中和胰蛋白酶。然后，将分离的细胞转移到 15 毫升塑料管中。将样品以 500 倍 G 离心 3 分钟，弃去上清液后，用 5 毫升 PBS 洗涤细胞 3 次。

离心后，将收集的细胞沉淀重悬于 500 μL 冰冷的 HPLC 裂解缓冲液中。用超声处理针以中高振幅对样品进行 3 次超声处理，持续 30 秒，在两次循环之间将样品在冰上冷却至少 1 分钟。离心裂解的细胞样品后，在 1.5 mL 塑料管中将上清液与膜组分分离。

对于酸水解，向分离的膜级分中加入 150 微升一摩尔 TFA 溶液。将样品在 80 摄氏度下孵育 4 小时，并以 200 至 600 RPM 的速度摇动。接下来，将样品运输到带有 3 千道尔顿排阻膜的 0.5 毫升滤管中。

样品在 20， 000 倍 G 和 21 摄氏度下离心约 30 分钟，直到上相体积小于 20 μL。然后，丢弃插入物，并用细针在含有超滤液的试管盖上戳两到四个孔。用液氮冷冻样品后，将其冻干过夜。

干燥的样品重悬于 10 μL 的 120 毫摩尔 TFA 溶液中，并加入 50 μL DMB 溶液。将样品转移到 1.5 mL 深色试管中，以保护样品免受紫外线照射。将细胞膜样品和标准品在 56 摄氏度下孵育 1.5 小时。

孵育后，向每个样品中加入 4 微升 400 毫摩尔氢氧化钠溶液以终止标记反应。对于 HPLC 分析，将色谱柱的温度设置为 40 摄氏度，并将荧光检测器分别配置为 373 纳米激发和 448 纳米发射。进样 10 μL 样品体积，以每分钟 0.5 mL的流速分离探针 15 min，以甲醇、乙腈和水为洗脱液。

对于质谱分析，将收集的每种 HPLC 样品的 20 μL 注入 LC 质量选择检测器系统。在 LC 质量选择检测器系统的评估软件中，在总离子色谱图中选择目标峰。查看分离峰的质谱图，并显示 300 到 700 之间的正质荷比。

将 1 mL Western blot 裂解缓冲液添加到先前制备的糖工程细胞沉淀中，然后涡旋。将样品在冰上孵育 30 分钟，每 5 分钟涡旋一次。然后，将样品在 20， 000 倍 G 和 4 摄氏度下离心 1.5 小时。

然后，将含有裂解细胞中蛋白质的上清液收集到 1.5 毫升试管中。通过将 10 微升 Laemmli 样品缓冲液添加到 90 微升每种蛋白质组分中来制备用于 SDS-page 的样品。将样品煮沸 5 分钟。

将样品上样到 8% SDS-丙烯酰胺凝胶上后，在室温下以 25 mA 的浓度运行凝胶 2 小时。完成后，小心地从凝胶上取下玻璃盖，并切出包含上样袋的凝胶上部。接下来，将凝胶放在 0.2 微量硝酸纤维素膜上，之前浸泡在 western 印迹缓冲液中。

根据系统的建议将蛋白质转移到硝酸纤维素中。从印迹系统中取出硝酸纤维素膜后，用丽春红对印迹膜进行染色，以观察蛋白质，从而控制转印质量。然后，将硝酸纤维素膜转移到塑料室中，加入 10 毫升封闭液。

孵育硝酸纤维素膜后，倒出封闭液，并在 PBS 中加入抗多唾液酸单克隆抗体 735 抗体。孵育后，用 PBS 洗涤膜至少 3 次，每次 5 分钟。现在，将与辣根过氧化物酶偶联的多克隆抗小鼠 IgG 二抗添加到硝酸纤维素膜上。

孵育和洗涤膜后，将其转移到适当成像仪的板上。然后，根据制造商的说明检测信号。DMB 标记的 N-羟基神经氨酸，在 7 到 9 分钟内洗脱。

并且，DMB 标记的 N-乙酰神经氨酸在 10 到 12 分钟之间洗脱。在色谱图中观察到的几个较小峰代表未反应的 DMB 和反应中间体。细胞裂解物的 HPLC 色谱图显示了几个未定义的峰，这些峰代表内部杂质和与细胞裂解物中存在的其他 α 酮酸反应产生的 DMB 副产物。

用 N-乙酰甘露糖胺处理通常会导致细胞表面的 N-羟基神经氨酸耗尽。在用 N-丙酰神经氨酸或 N-丁酰神经氨酸处理的裂解细胞的色谱图中，观察到表明相应非天然唾液酸出现的峰。与未用该染料标记的唾液酸物质相比，DMB 与唾液酸物质的反应导致分子量增加 116.2 道尔顿。

除了增强离子种类外，还观察到钠加合物。DMB-Neu5Gc 在未反应或部分反应的 DMB 物质后不久洗脱，这解释了 DMB-Neu5Gc 质谱中出现未定义峰的原因。用 N-丙酰甘露糖胺或 N-丁酰甘露糖胺处理 Kelly 神经母细胞瘤细胞导致细胞表面多唾液酸的表达降低。

另一方面，用 N-乙酰甘露糖胺治疗会导致多唾液酸表达增加。通过应用这种技术，可以在几天内产生完全唾液酸化的细胞。这种糖工程细胞可用于进一步的实验。

例如，研究受体-配体相互作用或如此处所示，抑制多唾液酸的表达。此处介绍的代谢工程程序针对唾液酸实验进行了优化。然而，相同的程序也可用于动物实验。

我们希望我们提出的方案和这个视频制作有助于作者将代谢糖工程带入实验室，以分析唾液酸和唾液酸受体在生物系统中的功能以及生物学作用。有机化学家可以合成具有更复杂结构的 N-酰基修饰甘露糖胺，并按照我们的方案中的建议使用这些。按照我们的方案，所有样品应在荧光标记后立即进行分析。

因此，HPLC 和 ACMS 分析仪之间不应有延迟。