长期的实时成像果蝇眼睛光盘

该方法的总体目标是显示假想盘的实时成像，假想盘是研究各种生物现象（包括细胞增殖、分化、凋亡和竞争）的热门实验对象。这种方法可以帮助回答发育生物学领域的关键问题，例如细胞形态和特定组织中的迁移。该技术的主要优点是连续成像可以显示比固定组织更多的信息，例如细胞迁移。

一般来说，刚接触这种方法的人会很挣扎，因为解剖和安装很困难。这种方法的视觉演示至关重要，因为旋转和转移阶段很难学习，因为解剖不当会导致分辨率不佳。要开始该方案，请用 70% 乙醇对设备进行消毒，并让设备风干。

接下来，从果蝇瓶中选择第三龄幼虫，并在 1X 磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 中洗涤幼虫，以防止果蝇瓶污染。将清洁后的幼虫在室温下放入 9 孔玻璃点板中的一毫升培养基中，置于解剖显微镜下。用一对镊子从后端抓住幼虫 1/3，然后用另一个镊子抓住口钩。

向相反方向拉动两个镊子以释放内部组织。然后，从附着在口钩上的眼脑复合体中取出唾液腺、脂肪体和角质层。如果腹侧神经索仍然连接，请用剪刀将其剪掉。

用一对镊子抓住口钩。使用另一对镊子去除连接背侧大脑和眼盘的组织。接下来，旋转整个复合体，使腹侧朝上。

取下将钩子或椎间盘连接到大脑的细丝。然后，取下口钩，注意在此过程中不要损坏眼盘。眼盘现在在培养基中是游离的，仅通过视柄连接到大脑。

将双层 O 形圈连接到 42 毫米 x 0.17 毫米盖玻片的中心，以固定琼脂糖。接下来，用盖玻片组装腔室。将盖玻片放在载物台接收器上。

然后，将硅 O 形圈放在盖玻片上。然后，设置底座，锁上密封锁，并盖上盖子。使用带有 10 至 200 微升尖端的 20 微升微量移液器，小心地将解剖的眼脑复合物转移到 O 形圈的中心。

去除大部分培养基，向样品中加入 12 微升 0.7% 低熔点 37 摄氏度琼脂糖。将琼脂的末端垂直于样品可以使组织靠近盖玻片，避免样品滚落。在室温下向 O 形圈中心添加 1 毫升培养基。

确保琼脂糖粘在 O 形圈上，以防止样品漂移。将准备好的腔室放在倒置共聚焦显微镜的载物台上 30 分钟以平衡温度。在进行长期实时成像之前，通过微分干涉造影显微镜检查组织是否完整。

将物镜切换到 40 倍进行成像。最后，在 12 分钟内以 1 微米的光学间隔采集 62 微米的 Z 堆栈图像。在总共 40 小时内获取 10 个扫描周期，并确保每个周期包含 12 分钟的成像和 3 分钟的休息。

R3 和 R4 用 GFP 标记。在 10 小时的实时成像会议开始时，有 8 排 ommatidial 簇，最后有 14 排 ommatidial 簇。根据 R3 和 R4 的相对位置，在实时成像过程中离体培养的椎间盘中发生 ommatidial 旋转。

一开始，R3/R4 轴似乎垂直于赤道。然后，它似乎在 3 小时内旋转了 15 度，在 6 小时内旋转了 30 度，在 9 小时内旋转了 45 度，这表明这种方法可以在 10 小时的实时成像中维持感光器分化。看完这个视频后，你应该对如何正确解剖果蝇眼盘和进行实时成像有一个很好的了解。