利用优化用于本科教学实验室的酵母雌激素筛选法检测个人护理产品中的雌激素类配体

本实验的总体目标是利用酵母雌激素筛选法，定量检测从个人护理产品中提取的人类雌激素受体激动剂。该方法有助于解答毒理学、内分泌干扰及生态生理学领域的关键问题，因为它能够检测并定量环境水体、食品及个人护理产品中的环境雌激素。这种体外技术的主要优势在于成本低廉、应用广泛，并且为教授实验技术技能提供了优良的平台。

检测环境雌激素至关重要，因为它们可能改变激素信号传导，特别是在胎儿发育以及青春期等生理转变时期。该方法中最困难的部分是计算和数据分析，我们已开发出一个易于使用的应用程序来简化这些步骤。此外，精确的移液操作也至关重要。

本方案首先需要配制试剂。准备葡萄糖和半乳糖培养基、50%乙醇的溶剂对照，以及检测第一天将使用的雌二醇标准品，同时配制第二天所需的LacZ缓冲液、二硫苏糖醇和碳酸钠。通过0.2微米滤膜过滤，对葡萄糖和半乳糖培养基进行除菌处理。

单个96孔板上最多可对23种不同的个人护理产品（PCPs）或提取对照进行三份重复检测。个人护理产品包括肥皂、护发霜、洗发水、防晒霜、化妆品、剃须膏和润肤乳。为拍摄需要，样品将仅从八种个人护理产品中制备。

将每份样品各1克与10毫升无水乙醇加入15毫升锥形管中。此外，制备一份阴性提取对照，其中包含11毫升无水乙醇置于15毫升锥形管中。通过手动振荡与涡旋振荡相结合的方式，对每个锥形管中的内容物均质化处理30分钟。

将锥形管在水平转子离心机中以允许的最高速度离心10分钟。通过40微米细胞滤网将每管上清液倾入50毫升锥形管中。然后将每个50毫升锥形管中的内容物转移至玻璃闪烁瓶中。

将离心管敞口置于通风橱中一周，使乙醇完全挥发。保护干燥样品免受光照，以避免光敏成分降解。样品干燥后，每份样品加入1 mL 50%乙醇重新溶解，然后涡旋振荡以混匀。

在准备酵母雌激素筛选（YES）平板前约42小时或两个晚上，使用无菌技术，将每种活性酵母培养物各0.1毫升接种至装有10毫升滤膜除菌葡萄糖培养基的无菌锥形瓶中进行传代培养。在30摄氏度下培养，并继续将原始培养物作为菌种保存。两天后，即YES检测的第一天，使用无菌技术将悬浮的酵母培养物与滤膜除菌的半乳糖培养基在无菌烧杯中进行稀释。

通过移液将每份酵母样品各120微升，以三份重复加入透明聚苯乙烯板中，同时设置三份半乳糖培养基空白对照。使用酶标仪在610纳米波长下检测，确认稀释后的酵母培养物净光密度值为0.065 ± 0.005。通过减去半乳糖培养基空白对照的OD610值，计算酵母的净OD610值。

使用带有无菌注射器吸头的多通道移液器，按照此板布局将稀释后的酵母悬液加入无菌聚丙烯96孔微孔板的各孔中。移液过程中，通过持续轻轻摇动烧杯或使用移液器反复吹打，保持酵母悬液均匀悬浮。最后，向板布局中绿色标注的H10至H12孔各加入120 µL过滤除菌的半乳糖培养基，作为培养基对照，用于校正仅由培养基本身带来的吸光度干扰。

为每种酵母菌株与比色底物的组合分别准备平板。接下来，根据平板布局，通过连续稀释在每个平板中构建标准曲线。使用带无菌吸头的单通道移液器，向 A2、A2 和 A3 孔中各加入 5 微升雌二醇标准品。使用多通道移液器通过移液操作混匀各孔内容物，然后将 205 微升液体从 A1 至 A3 孔转移至 B1 至 B3 孔。重复此 205 微升的转移操作，直至 G 行。完成连续稀释后，弃去 G1 至 G3 孔中的 205 微升液体。此步骤结束时，所有标准品孔中应含有 120 微升液体。

向每孔中加入5微升50%乙醇，加入对象为含有酵母悬液的车辆对照孔，即该板布局中以蓝色标示的H1、H2和H3孔。下一步是向含有酵母悬液的孔中加入5微升的样品或阴性提取对照，每份样品或对照设三个复孔，该类孔在板布局中以紫色标示。注意记录各样品或提取对照所加入的具体孔位。

为了记录哪些孔含有样品而哪些孔没有，应使用全新的吸头盒，并从吸头盒中与微孔板上对应孔位置相同的位置取用吸头。通过移液操作混匀样品孔、提取对照孔和载体对照孔中的内容物。通过从每个孔中移除205微升，将这些孔中的体积调整至120微升。

用无菌透气胶膜密封每块培养板，贴标签，并在30摄氏度下孵育17小时。孵育17小时后，从孵箱中取出培养板。若无法立即处理，需用塑料薄膜包裹培养板，并将包裹后的培养板在4摄氏度下冷藏保存6天。

准备处理酶标板时，将其拆开。使用多通道移液器混匀每行各孔中的内容物，然后从每个孔中转移 50 µL 酵母悬液至透明聚苯乙烯 96 孔微孔板的对应孔中。标记新酶标板。

为避免孔间交叉污染，每个孔应使用新的移液器吸头，但吸头无需无菌。在通风橱中，将 20 微升 1 摩尔 DTT 加入 20 毫升已解冻并置于室温的 LacZ 缓冲液中，使 DTT 的终浓度为 1 毫摩尔。充分混匀 LacZ 缓冲液。

使用多通道移液器，向聚苯乙烯板的所有孔中加入含有 DTT 以及 ONPG 或 CPRG 的 200 微升 LacZ 缓冲液，并立即使用酶标仪测量并记录所有孔在 610 纳米处的光密度。如有需要，对其他板重复此步骤。用盖子盖住板孔，于 30 摄氏度下避光孵育指定时间。

孵育完成后，从培养箱中取出培养板。使用多通道移液器向每孔中加入100微升碳酸钠溶液，以终止β-半乳糖苷酶反应。使用酶标仪测定各孔在405纳米（ONPG）或574纳米（CPRG）处的光密度值，并记录结果。

可以使用需要安装 Java 的自动化应用程序来计算 LacZ 值。首先，打开附录一中所述的 LacZ 自动化应用程序。按照图一所示的酶标板布局，将所有孔在 405 纳米波长下（ONPG）或 574 纳米波长下（CPRG）的光密度读数粘贴到程序中。

输入孵育时间（小时）以及使检测显色所需的时间，然后点击“下一步”。粘贴所有孔在610纳米处的光密度读数，点击“提交”以显示LacZ检测结果。

LacZ 结果可通过键盘命令复制，并根据需要粘贴到电子表格或其他文件中。开始分析前，请打开在线 YES 检测数据分析应用程序。按照第一个标签页中的说明格式上传 CSV 数据文件。

在第二个标签页中对雌二醇标准曲线进行数字化处理，并估算回归参数。在第三个标签页中查看回归模型的输出结果，然后在第四个标签页中查找与样品LacZ值相对应的插值x轴数值。单击第五个标签页，查看样品的雌激素当量（EEQ）值。

最后，根据文本方案中所述方法，将EEQ值标准化为原始样品质量。图中显示了酵母与17β-雌二醇孵育17小时后的标准曲线示例。如论文中所讨论的原因，CPRG通常是比ONPG更优的底物选择。

与先前的观察结果一致，表达ERβ的酵母检测的敏感性比表达ERα的酵母检测高出一个数量级以上。因此，使用表达ERβ的酵母更常能检测到雌激素活性。本研究的另一个目的是测试与本科生实验课程时间安排相兼容的孵育时长。

在17小时孵育后引入六天冷藏期后，冷藏平板的标准曲线与未冷藏平板的标准曲线具有可比性。使用四参数逻辑回归模型估计参数时，所有冷藏平板的参数标准误均小于未冷藏平板。因此，将平板冷藏六天可减少误差，提高EEQ估计的准确性。

一旦掌握，该技术可在两到三个三至四小时的实验周期内完成。在操作过程中，必须注意在17小时孵育期之前的所有步骤中均采用无菌操作技术，移液时需小心且准确，并遵循图1所示的孔板布局。在完成该操作步骤后，可进一步采用其他方法（如体内动物实验）来研究雌激素作用的其他机制以及对整个生物体的影响。

在该方法开发后，酵母雌激素筛选法（YES）被广泛接受为一种低成本检测食品、植物组织和个人护理产品等环境样品中雌激素类配体的方法。观看本视频后，您应能够充分掌握如何对个人护理产品进行简单提取、培养酵母、制备标准稀释曲线、在96孔板中开展YES检测，并完成相关计算。此外，请务必注意，雌二醇具有极高的危害性，在操作过程中应始终采取佩戴手套及其他个人防护装备、妥善处置废弃物等安全预防措施。