Name: 用四甲基铵进行实时离子电渗疗法，以量化体细胞分数和脑细胞外空间的变性 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 45 s
Description: 了解实时离子电渗疗法，利用四甲基铵（TMA）定量测量脑组织细胞外空间的体积分数和迂曲度。该方法可实时表征活体大脑ECS的关键物理参数，为研究脑生理与疾病提供重要技术手段。

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本工作由美国国立卫生研究院神经疾病与中风研究所资助，项目编号 R01 NS047557。

<ol><li>Sykova, E., Nicholson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diffusion+in+brain+extracellular+space%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Diffusion in brain extracellular space.</a> Physiol Rev. 88 (4), 1277-1340 (2008).</li>
<li>Nicholson, C. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/publication/230904011_Diffusion_and_related_transport_mechanisms_in_brain_tissue">Diffusion and related transport mechanisms in brain tissue.</a> Rep Prog Phys. 64 (7), 815-884 (2001).</li>
<li>Nicholson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ion-selective+microelectrodes+and+diffusion+measurements+as+tools+to+explore+the+brain+cell+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Ion-selective microelectrodes and diffusion measurements as tools to explore the brain cell microenvironment.</a> J Neurosci Methods. 48 (3), 199-213 (1993).</li>
<li>Nicholson, C., Phillips, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ion+diffusion+modified+by+tortuosity+and+volume+fraction+in+the+extracellular+microenvironment+of+the+rat+cerebellum%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Ion diffusion modified by tortuosity and volume fraction in the extracellular microenvironment of the rat cerebellum.</a> J Physiol. 321, 225-257 (1981).</li>
<li>Nicholson, C., Sykova, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+space+structure+revealed+by+diffusion+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Extracellular space structure revealed by diffusion analysis.</a> Trends Neurosci. 21 (5), 207-215 (1998).</li>
<li>Xie, L. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sleep+drives+metabolite+clearance+from+the+adult+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Sleep drives metabolite clearance from the adult brain.</a> Science. 342 (6156), 373-377 (2013).</li>
<li>Hrabetova, S., Nicholson, C. Biophysical properties of brain extracellular space explored with ion-selective microelectrodes, integrative optical imaging and related techniques. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Biophysical+properties+of+brain+extracellular+space+explored+with+ion-selective+microelectrodes%2C+integrative+optical+imaging+and+related+techniques">Electrochemical Methods for Neuroscience Neuroscience</a>. Michael, A. C., Borland, L. M. , CRC press. 167-204 (2007).</li>
<li>Rice, M. E., Okada, Y. C., Nicholson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anisotropic+and+heterogeneous+diffusion+in+the+turtle+cerebellum%3A+implications+for+volume+transmission%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Anisotropic and heterogeneous diffusion in the turtle cerebellum: implications for volume transmission.</a> J Neurophysiol. 70 (5), 2035-2044 (1993).</li>
<li>Vargova, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diffusion+parameters+of+the+extracellular+space+in+human+gliomas%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Diffusion parameters of the extracellular space in human gliomas.</a> Glia. 42 (1), 77-88 (2003).</li>
<li>Haack, N., Durry, S., Kafitz, K. W., Chesler, M., Rose, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Double-barreled+and+concentric+microelectrodes+for+measurement+of+extracellular+ion+signals+in+brain+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Double-barreled and concentric microelectrodes for measurement of extracellular ion signals in brain tissue.</a> J Vis Exp. (103), (2015).</li>
<li>Xiao, F., Hrabetova, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enlarged+extracellular+space+of+aquaporin-4-deficient+mice+does+not+enhance+diffusion+of+Alexa+Fluor+488+or+dextran+polymers%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Enlarged extracellular space of aquaporin-4-deficient mice does not enhance diffusion of Alexa Fluor 488 or dextran polymers.</a> Neuroscience. 161 (1), 39-45 (2009).</li>
<li>Sherpa, A. D., Pvan de Nes,, Xiao, F., Weedon, J., Hrabetova, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gliotoxin-induced+swelling+of+astrocytes+hinders+diffusion+in+brain+extracellular+space+via+formation+of+dead-space+microdomains%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Gliotoxin-induced swelling of astrocytes hinders diffusion in brain extracellular space via formation of dead-space microdomains.</a> Glia. 62 (7), 1053-1065 (2014).</li>
<li>Kume-Kick, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Independence+of+extracellular+tortuosity+and+volume+fraction+during+osmotic+challenge+in+rat+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Independence of extracellular tortuosity and volume fraction during osmotic challenge in rat neocortex.</a> J Physiol. 542 (Pt 2), 515-527 (2002).</li>
<li>Saghyan, A., Lewis, D. P., Hrabe, J., Hrabetova, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+diffusion+in+laminar+brain+structures+exemplified+by+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Extracellular diffusion in laminar brain structures exemplified by hippocampus.</a> J Neurosci Methods. 205 (1), 110-118 (2012).</li>
<li>Fedirko, N., Svichar, N., Chesler, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fabrication+and+use+of+high-speed%2C+concentric+H%2B-+and+Ca2%2B-selective+microelectrodes+suitable+for+in+vitro+extracellular+recording%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophys%22%5BJournal%5D)">Fabrication and use of high-speed, concentric H+- and Ca2+-selective microelectrodes suitable for in vitro extracellular recording.</a> J Neurophys. 96 (2), 919-924 (2006).</li>
<li>Nicholson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diffusion+from+an+injected+volume+of+a+substance+in+brain+tissue+with+arbitrary+volume+fraction+and+tortuosity%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Diffusion from an injected volume of a substance in brain tissue with arbitrary volume fraction and tortuosity.</a> Brain Res. 333 (2), 325-329 (1985).</li>
<li>Nicholson, C., Tao, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hindered+diffusion+of+high+molecular+weight+compounds+in+brain+extracellular+microenvironment+measured+with+integrative+optical+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Hindered diffusion of high molecular weight compounds in brain extracellular microenvironment measured with integrative optical imaging.</a> Biophys J. 65 (6), 2277-2290 (1993).</li>
<li>Thorne, R. G., Nicholson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+diffusion+analysis+with+quantum+dots+and+dextrans+predicts+the+width+of+brain+extracellular+space%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">In vivo diffusion analysis with quantum dots and dextrans predicts the width of brain extracellular space.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (14), 5567-5572 (2006).</li>
<li>Wolak, D. J., Thorne, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diffusion+of+macromolecules+in+the+brain%3A+implications+for+drug+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Pharm%22%5BJournal%5D)">Diffusion of macromolecules in the brain: implications for drug delivery.</a> Mol Pharm. 10 (5), 1492-1504 (2013).</li>
</ol>

作者声明不存在任何竞争性财务利益。

<img alt="图10" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55755/55755fig10.jpg" /> 
图10：显示常见技术问题的非理想数据。 (a离子电泳微电极常见技术问题示意图：正常功能微电极释放TMA与三种存在技术问题情况的对比。[高倍放大，a1] 在理想离子电泳源中，电流由TMA释放和氯离子摄取均等携带。[高倍放大，a2] 一个电阻过低的离子电泳微电极 nt 释放的TMA较少，摄取的氯离子多于正常情况。[高倍放大，a3] 显示电渗现象的离子电泳微电极释放TMA、氯离子和溶剂。[高倍放大，a4] 随时间推移释放量逐渐增加的离子电泳微电极即， &#34;预热&#34;). (b) 琼脂中获得的非理想数据图：该数据无法通过Walter拟合的曲线进行充分建模，因此无法准确解释；差异产生的具体原因尚不明确。c琼脂中获得的非理想数据表：琼脂中的正常或预期结果显示在第一行（以图表形式呈现...

细胞外间隙（ECS）是存在于所有脑细胞外部的相互连通的通道网络，其中包含组织间液和细胞外基质（图1a 和 图1b）。许多脑细胞功能所需物质（包括营养物质、激素和神经递质）的分布通过ECS中的扩散实现。该间隙的物理参数（包括体积、几何结构和细胞外基质）的变化会显著影响物质在ECS中的扩散以及脑细胞所处的局部离子浓度，从而对脑细胞功能产生深远影响1,2。
实时离子电渗（RTI）用于测定脑区的两个结构特征：容积分数和迂曲度3,4,5。容积分数（α）是指在代表性基本体积中，细胞外间隙（VECS）所占组织体积与总组织体积（Vtissue）的比例；
<img alt="方程" src="/files/ftp_upload/55755/55755eq1.jpg" />
迂曲度（λ）是指某种物质在脑区扩散时所受到的相对阻碍程度，与在无障碍介质中的扩散相比；
<img alt="方程" src="/files/ftp_upload/55755/55755eq2.jpg" />
其中D*（cm2 s-1）表示该物质在脑组织中的有效扩散系数，D（cm2s-1）表示该物质在自由介质（如稀琼脂糖凝胶）中的自由扩散系数。
目前，RTI 方法最常用的示踪物质是小阳离子四甲基铵（TMA）。TMA 的分子量为 74 g/mol，在溶液中完全解离，并带有一个正电荷。使用该离子的 RTI 研究表明，α <img alt="方程" src="/files/ftp_upload/55755/55755eq3.jpg" /> 0.2 且 λ <img alt="方程" src="/files/ftp_upload/55755/55755eq3.jpg" /> 1.61,2。这意味着细胞外间隙（ECS）约占全脑总体积的 20%，且小的惰性分子在 ECS 中的扩散速度比在无障碍介质中慢约 2.5 倍3。然而，α 和 λ 会随脑组织的年龄、区域、状态以及病理条件而变化1。这些参数的改变已与大脑发育、衰老、睡眠、癫痫以及其他多种脑部基本过程和疾病相关联1,6。尽管其他技术也可测量 α 和 λ，但 RTI 能够在活体组织的局部区域实时同时测定这两个参数。因此，RTI 已成为研究急性且可逆性干预过程中 α 和 λ 变化的不可或缺的工具。
支持RTI的理论最初由Nicholson和Phillips验证，此后该技术已得到广泛应用4,7。采用RTI的实验首先通过离子电渗法从源微电极向稀释的琼脂糖凝胶中释放一脉冲的四甲铵（TMA）。一旦被释放，离子便从点源自由扩散，沿无数可能的随机路径扩散（图1d）。使用一个约位于100 µm远处的离子选择性微电极（ISM）随时间测量离子浓度的变化（图1c）。将TMA浓度随时间的变化绘制成图，并拟合至一条曲线，从而可计算出扩散系数D以及离子电渗微电极的输送数（参数详见实验方案部分）。利用这些数值，可在感兴趣脑区重复该过程，以获得表观扩散系数D*，并进一步计算容积分数α和迂曲度λ。离子电渗微电极的控制、数据采集、TMA浓度曲线的绘图与拟合，以及实验参数的计算，通常均由专为此设计的Wanda和Walter程序完成（该软件及其使用手册可应要求向作者免费获取）。
本综述的方案部分描述了在啮齿类动物脑片中设计和实施RTI所需的基本操作步骤。该技术也已应用于非啮齿类模型，包括人脑片和 在 活体脑组织制备1,4,6,8,9代表性结果部分展示了理想与非理想的结果，以突出数据解释中的细微差异。最后，讨论部分简要介绍了电阻抗成像技术的故障排除方法、技术局限性、研究细胞外空间的替代技术以及该技术的未来应用前景。
<img alt="图1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55755/55755fig1.jpg" /> 
图1：细胞外间隙（ECS）中的扩散示意图。（a）ECS示意图：展示典型脑组织切片中细胞外间隙的大小和位置。黄色部分标记了灰质脑细胞突起之间的细胞外间隙。在生理条件下，ECS体积约占总组织体积的20%（即体积分数 = 0.2）。（b）ECS放大示意图：突出显示导致扩散曲折性的物理参数，包括脑细胞几何结构（灰色）和细胞外基质（图示为多种颜色的糖胺聚糖和蛋白聚糖组成的网状结构）。（c）从点源扩散的三维示意图：展示惰性分子从离子电渗源向ISMs扩散的净运动方向。在不考虑扩散屏障和细胞摄取的情况下，分子向各个方向外向扩散，形成球形的浓度前沿。ISMs用于量化从离子电渗源释放的惰性分子的局部浓度。（d）脑组织ECS中扩散的计算机模拟：[最左侧] 蒙特卡洛模拟设置；绿色球体代表脑细胞突起，红色十字代表点源。该设置模拟了图1a中所示的脑组织结构。[中间图像] 3个和6个分子在脑组织细胞外间隙中进行随机运动的二维展示。[最右侧] 从点源释放的大量分子的随机运动轨迹。所有分子从点源的净运动方向为外向，如图1c所示。这些累积的随机运动轨迹勾勒出了细胞之间的空间（即细胞外间隙；详见参考文献5中的进一步解释）。<a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55755/55755fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

<table><tbody><tr><td>A/D 和 D/A 转换器</td><td>National Instruments Corporation</td><td>NI USB-6221 DAQ</td><td>NI USB-6221 目前仍由 NI 作为“传统”设备销售。NI 建议在新安装中使用 NI USB-6341 X 系列 DAQ，但我们尚未测试更新的设备。本文描述了 NI USB-6221 与 MATLAB 和 Windows 7（32 位）的使用方法。替代方案：更早的 PCI-MIO-16E-4 A/D 转换器（仅限在 Windows XP 或更早操作系统下使用），搭配 BNC-2090 BNC 连接面板和 SH68-68-EP 电缆。如 Wanda 手册所述，已有实验性 MATLAB 程序可用于处理 Axon 二进制文件。</td></tr><tr><td>琼脂糖</td><td>Lonza</td><td>NuSieve GTG Agarose #50081</td><td>用于制备稀释琼脂糖凝胶以进行 RTI 测量</td></tr><tr><td>ISM 放大器</td><td>Dagan</td><td>Model IX2-700 双通道细胞内前置放大器</td><td>离子和参考电压放大器，配备 N=0.1（参考毛细管）和 N=0.001（离子毛细管）的前置放大头</td></tr><tr><td>生物复合显微镜（配备 4x 和 10x 物镜）</td><td></td><td></td><td>用于修整微电极尖端并检查微电极；多个供应商可选，&lt;em&gt;例如&lt;/em&gt; AmScope</td></tr><tr><td>硼硅酸盐 θ 型毛细玻璃管</td><td>Harvard Apparatus</td><td>Warner Instruments 型号 TG200-4；订单号 #64-0811</td><td>双通道玻璃管，用于制备离子选择性微电极和离子电渗微电极；外径 2.0 mm，内径 1.4 mm，隔膜厚度 0.2 mm，长度 10 cm</td></tr><tr><td>画笔</td><td>Winsor &amp; Newton</td><td>University Series 233，0 号</td><td>圆头软柄画笔，可在 Amazon 购得</td></tr><tr><td>本生灯</td><td>Fisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>用于观察微移液管的相机</td><td>Olympus</td><td>OLY-150</td><td>需配备显示器，物镜下方照明器上的红外滤光片为可选配置</td></tr><tr><td>图表记录仪</td><td></td><td></td><td>用于在四甲基铵标准液校准期间及 RTI 实验过程中连续记录离子选择性微电极上的电压；&lt;em&gt;例如&lt;/em&gt; Kipp &amp; Zonen BD112 双通道图表记录仪，可购买翻新设备</td></tr><tr><td>三甲基氯硅烷，超纯，&gt; 99%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>目录号 #92360</td><td>用于硅烷化；注意：易燃，具有急性毒性（经口、经皮、吸入），可致皮肤腐蚀、眼部损伤，遇水剧烈反应，详见 Sigma-Aldrich 安全信息以获取完整说明</td></tr><tr><td>商用软件</td><td>The MathWorks</td><td>MATLAB，数据采集工具箱</td><td>用于通过 Wanda 和 Walter 程序进行数据采集与分析。请注意，可申请学术许可。</td></tr><tr><td>护目镜</td><td>Fisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>固定式复合显微镜</td><td>Olympus</td><td>BX51WI</td><td>也可使用其他配备固定载物台的复合显微镜</td></tr><tr><td>镊子</td><td>Fine Science Tools</td><td>#11251-10</td><td>用于修整玻璃毛细管；Dumond #5 镊子，建议使用已用过且不再用于精细操作的</td></tr><tr><td>通风橱</td><td></td><td></td><td>用于硅烷化处理及用液体离子交换剂填充离子选择性毛细管尖端；多个供应商可选，&lt;em&gt;例如&lt;/em&gt; Erlab 销售的 Captair 配备适当滤芯</td></tr><tr><td>玻璃显微镜载玻片</td><td>Fisher</td><td>#12-550A</td><td>用于修整微电极尖端</td></tr><tr><td>加热/搅拌器</td><td>Fisher</td><td>Corning PC-420D</td><td>用于制备稀释琼脂糖凝胶及搅拌溶液</td></tr><tr><td>离子电渗装置</td><td>Dagan</td><td>ION-100 和 PS-100</td><td>ION-100 为单通道离子电渗装置，电压合规范围为 ±130 V；PS-100 为外接电源；替代方案：&lt;em&gt;例如&lt;/em&gt; Axon Instruments（现为 Molecular Devices）生产的 Axoprobe-1A，已停产，可查看翻新设备的供应情况（如 eBay 等网站）</td></tr><tr><td>四甲基铵用液体离子交换剂（LIX）</td><td>World Precision Instruments</td><td>IE190 钾离子交换剂</td><td>注意：此产品等同于原始 Corning 钾离子交换剂 477317，基于四苯基硼酸盐；切勿与苏黎世 ETH Simon 博士实验室开发的中性载体钾离子交换剂混淆，后者无法感应四甲基铵，由 Fluka 销售。您也可自行配制四甲基铵用液体离子交换剂：将 3%（重量）四（对氯苯基）硼酸钾溶解于 2,3-二甲基硝基苯中。化学品可从 Fluka（现属 Sigma）购买。参见 Oehme 和 Simon（1976）Anal. Chim. Acta 86: 21-25；注意：该液体离子交换剂的毒理学性质尚未完全明确，摄入或接触人体可能有害，请谨慎操作！液体离子交换剂应储存在阴凉避光处。</td></tr><tr><td>微电极夹持器</td><td>WPI</td><td>M3301EH</td><td>用于在硅烷化处理及用液体离子交换剂填充离子选择性毛细管尖端时固定离子选择性微电极预制件；WPI 销售两种版本的夹持器，透明 M3301EH 和黑色 M3301EH。根据我们的经验，透明 M3301EH 比黑色 M3301EH 更坚固。</td></tr><tr><td>显微操作器</td><td>Narishige</td><td>MM-3</td><td>用于在硅烷化处理及用液体离子交换剂填充离子选择性毛细管尖端时定位离子选择性微电极预制件；可用任何工作状态良好的三轴显微操作器替代</td></tr><tr><td>微移液管拉制仪</td><td>Sutter Instruments</td><td>Model P-97</td><td>用于拉制双通道玻璃管；其他拉制仪也可使用，只要其能适配大直径双通道玻璃管</td></tr><tr><td>微探针温度计</td><td>Physiotemp</td><td>Model BAT-12R</td><td>该温度计的细探针应放置在记录位点附近</td></tr><tr><td>针头</td><td>BD</td><td>注射器和针头 #305122（25 号）</td><td>用于硅烷化处理；BD PrecisionGlide 针头 25 G × 5/8 英寸（0.5 mm × 16 mm）</td></tr><tr><td>5X 干式物镜</td><td>Olympus</td><td>MPlan N</td><td></td></tr><tr><td>10X 水浸物镜</td><td>Olympus</td><td>UMPlan FL N</td><td>10X 物镜为水浸式，数值孔径为 0.3，工作距离为 3.3 mm</td></tr><tr><td>塑料容器（带盖）</td><td>Fisher</td><td>#14-375-148</td><td>用于储存四甲基铵标准溶液和微电极</td></tr><tr><td>固定式显微镜用平台及 x-y 平移台</td><td>EXFO</td><td>Gibraltar Burleigh</td><td>平台用于承载切片室、显微操作器及其他附件，x-y 平移台可在不破坏记录稳定性的前提下移动显微镜</td></tr><tr><td>多孔微型杯</td><td></td><td></td><td>用于在稀释琼脂糖凝胶中进行 RTI 测量；自制</td></tr><tr><td>可重复使用粘合剂</td><td>Bostik</td><td>Blu-Tack</td><td>用于固定微电极至夹持装置及其他用途；多个供应商可选，可在 Amazon 购得</td></tr><tr><td>具备精确 x、y、z 定位功能的机器人显微操作器</td><td>Sutter Instruments</td><td>MP-285</td><td>需要两个显微操作器分别独立夹持离子选择性微电极和离子电渗微电极。也可将微移液管粘合成间隔阵列（见正文）。</td></tr><tr><td>带低通滤波器的信号调理单元</td><td>Axon Instruments</td><td>CyberAmp 320 或 380</td><td>制造商已不再供货，但可能在 eBay 上有售；替代方案：&lt;em&gt;例如&lt;/em&gt; Cygnus Technology 的 FLA-01 滤波/放大器。该设备为单通道仪器，使用多极贝塞尔滤波器，最低截止频率为 10 Hz，但公司可根据需要修改为更低截止频率（2 Hz）。</td></tr><tr><td>银丝</td><td>A-M Systems</td><td>#7830</td><td>直径 0.015&quot;，裸丝（无涂层）</td></tr><tr><td>切片室</td><td>Harvard Apparatus</td><td>Warner 型号 RC-27L</td><td>此为浸没式切片室；请勿使用界面式切片室</td></tr><tr><td>体视显微镜</td><td></td><td></td><td>用于硅烷化处理及用液体离子交换剂填充离子选择性毛细管尖端；水平安装；多个供应商可选</td></tr><tr><td>10 mL 注射器</td><td>BD</td><td>注射器和针头 #309604</td><td>用于反向填充微电极及硅烷化处理；BD 鲁尔锁头</td></tr><tr><td>0.22 &amp;micro;m 孔径注射器滤器</td><td>Whatman</td><td>#6780-1302</td><td>用于过滤反向填充溶液；可在 Fisher 购得</td></tr><tr><td>28 号、97 mm 注射器针头</td><td>World Precision Instruments</td><td>MicroFil MF28G-5</td><td>用于反向填充微电极</td></tr><tr><td>聚四氟乙烯（=PTFE）管</td><td>Component Supply</td><td>STT-28 PTFE 管轻壁（28 号）</td><td>用于离子选择性毛细管的硅烷化处理；可套在 BD PrecisionGlide 针头 25 G × 5/8 英寸上。注意：必须使用聚四氟乙烯，PVC 管会被热蜡熔化。</td></tr><tr><td>温度控制系统</td><td>Harvard Apparatus</td><td>Warner 型号 TC-344B 和 SH-27A</td><td>TC-344B 为双通道自动温度控制器，SH-27A 为在线加热器；控制器和加热器可与 Warner 切片室配合使用</td></tr><tr><td>四甲基铵（TMA）氯化物</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T-3411</td><td>5 M 溶液；注意：具有急性毒性（经口、经皮、吸入），致癌性，对水生环境有害，详见 Sigma-Aldrich 安全信息以获取完整说明</td></tr><tr><td>振动刀片式切片机</td><td>Leica</td><td>VT1000S</td><td>用于切割脑切片</td></tr><tr><td>二甲苯</td><td>Fisher</td><td>X5-1</td><td>用于硅烷化处理；注意：易燃，具有急性毒性（经口、经皮、吸入），可致皮肤腐蚀、眼部损伤，具有致癌性，详见 Fisher 安全信息以获取完整说明</td></tr></tbody></table>

利用四甲基铵实时离子电渗法量化脑细胞外间隙的容积分数与迂曲度

Real-time Iontophoresis with Tetramethylammonium to Quantify Volume Fraction and Tortuosity of Brain Extracellular Space

本文综述了实时离子电渗法（RTI）的基本原理与操作流程，该方法是研究和量化活体脑组织细胞外间隙（ECS）的金标准。ECS 包围所有脑细胞，内含组织间液和细胞外基质。许多脑功能所需物质（包括神经递质、激素和营养物质）的转运均通过 ECS 以扩散方式进行。在正常脑活动过程（如睡眠）以及病理状态（如缺血）中，该空间的体积和几何结构均会发生变化。然而，脑内 ECS 的结构及其调控机制，尤其是在疾病状态下的特性，仍远未被充分阐明。RTI 方法可测量活体脑组织的两个物理参数：容积分数和迂曲度。容积分数指 ECS 占组织总体积的比例；迂曲度则反映物质在脑区中扩散时所受阻碍程度的相对指标，相对于无障碍介质中的扩散而言。在 RTI 实验中，通过源微电极向脑 ECS 脉冲释放一种惰性分子；当分子从该源扩散出去时，使用距离约 100 µm 的离子选择性微电极随时间测量该离子浓度的变化。根据所得的扩散曲线，可计算出容积分数和迂曲度。该技术已被用于多种物种（包括人类）的脑切片以及活体（in vivo）研究，以探讨 ECS 的急性和慢性变化。与其他方法不同，RTI 能够实时检测脑 ECS 的可逆性与不可逆性改变。

通过设计一项实验来测量在低渗刺激过程中α的变化，展示了RTI技术的实用性（图8和图9）。先前的研究已表明，通过灌注低渗人工脑脊液（ACSF）降低细胞外液（ECS）的渗透压，会导致α减小，同时λ13增大。
在本实验中，对大鼠脑切片在对照条件以及低渗人工脑脊液灌流条件下进行了电阻抗成像（RTI）。制备了一根离子选择性微电极（ISM），并将其校准参数输入Wanda软件，拟合Nicolsky方程，计算得到斜率（M）为58.21 mV。将离子选择性微电极与电泳微电极置于琼脂中，彼此间距120 µm，以测量迁移数。共进行了三次记录，并按照实验方案第6步的程序对曲线进行拟合与分析（图8a<...

本方案描述了实时离子电渗法，这是一种用于测量活体脑组织细胞外间隙（ECS）物理参数的方法。通过检测惰性分子在细胞外间隙中的扩散情况，可计算出细胞外间隙的体积分数和迂曲度。该方法适用于研究脑细胞外间隙的急性可逆性变化。

本文综述了进行实时离子电渗法（RTI）的基本概念与实验方案，该方法是探索和量化...的金标准

本实验的总体目标是量化脑组织中细胞外间隙的体积分数和迂曲度。该方法可回答有关细胞外间隙与生理功能及疾病之间关系的关键问题。该技术的主要优势在于，能够实时表征细胞外间隙的两个重要参数。通常，初次使用该方法的研究人员会遇到困难，因为离子电渗微电极在实验过程中容易发生特性改变，经常需要在实验中进行故障排查。该方法的可视化演示至关重要，因为要获得成功的记录，必须精确地操作离子选择性微电极和离子电渗电极，并完成多个步骤的操作。开始此操作时，以每分钟2毫升的速度将含有四甲基铵（TMA）的人工脑脊液（ACSF）通入浸没式记录室中。将温度控制器设定至所需温度，并在整个实验过程中用95%氧气和5%二氧化碳混合气体对ACSF进行通气。接着，将接地电极安装在电极架上，并将其尖端浸入流经浸没式记录室的ACSF中。然后，用先前配制的含有TMA的0.3%琼脂糖填充多孔杯，并将其放入浸没式记录室中。现在，将一个离子电渗微电极固定到其中一个显微操作器的移液管固定器上，并将离子电渗微电极的导线连接到离子电渗仪的前置放大器端。接着，将一支校准过的离子选择性微电极（ISM）固定到第二个显微操作器上，并将其连接至对应的前置放大器端。随后，打开装有 Wanda 和 Walter 程序的计算机。在 Wanda 图形用户界面中，单击“校准”。然后，在校准对话框中输入 ISM 校准期间测得的电压值，并单击“拟合数据”。随后，在校准对话框中点击“接受”，以自动将生成的斜率和干扰值传输到主图形用户界面。在图形用户界面的左侧，确保所有实验参数均已在其对应的输入项中设置完毕。接下来，将温度探头放入琼脂杯中。在图形用户界面（GUI）的测量电极框中的温度输入项内记录测得的温度。然后，将微电极至少插入琼脂糖中1,000微米深度，并使其位于杯体中央。使用10倍物镜在显微镜下观察微电极。在双通道放大器上，手动将 ISM 通道连接器移至电压减法输出端，以在参考通道和 ISM 通道之间设置减法。在三个方向轴上将两个微电极尖端精确对中。接下来，在显微操作器控制箱上将两个微电极的相对位置归零，并确保微电极准确且精确地居中。然后，将 ISM 沿一个轴向移离离子电渗微电极 120 微米。接着，在图形用户界面（GUI）中点击“Acquire”开始记录，并让程序运行完成整个记录过程。在此步骤中，打开计算机上的 Walter 程序。在“零记录来源”菜单中，点击 Wanda Voltoro 按钮以读取 Wanda 生成的记录。在随后弹出的窗口中，选择一个或多个要读取的记录，然后点击“打开”。在“一次写入 Excel”菜单中，点击“工作表 1.3”，并按照提示操作，直至记录被自动绘制成图表。开始拟合程序时，在“两个选项”菜单中，单击“选择记录”按钮。然后，在图二的弹出窗口中，使用鼠标将十字光标移至要处理的第一个记录上，并按下任意鼠标键以选择该记录。接着，在菜单中单击“拟合曲线”，并使用至少20次迭代拟合，以获得对数据的精确拟合。接下来，选择“全部选中”以拟合所有数据点，然后选择继续。程序将拟合显示的曲线。随后，在七个结果菜单中点击 Excel，选择将结果写入相应的电子表格程序。为 Excel 文件命名。注意并记录生成的数据，这些数据将用于确定离子电渗微电极的功能性。如果该离子电渗微电极被认为适用于实验，请在 Wanda 图形用户界面的 TransportNum 结果字段中记录所有试验的平均迁移数。在此步骤中，将一片厚度为400微米的脑切片放入记录室，确保其完全浸没在流动的ACSF中。接着，将离子电泳微电极和离子选择性微电极（ISM）移至脑切片上目标区域的上方。将两个电极浸入流动的ACSF中，但保持在切片之上。然后，将参比通道和离子感应通道的电压均调零至毫伏。等待两个通道的电压稳定。在图表记录仪上，标记离子选择性电极的离子感应通道所测得的电压。接下来，将离子选择性微电极（ISM）和离子电渗微电极插入脑片中，深度为200微米，电极间距离为120微米。计算在流动的ACSF中和脑组织中测得的TMA信号之间的电压差，并将该值输入Wanda图形用户界面（GUI）中“测量电极”框的“基线电压毫伏”字段。在GUI左侧，确保所有实验参数均已正确输入。通过点击“Acquire”开始记录，并完成完整的记录过程。将两个微电极从脑片中移出后，使用图表记录仪确定当前测得的电压与之前测量值之间的任何变化。为分析脑组织记录数据，使用Walter程序重复琼脂糖数据分析的步骤。通过点击 Walter 菜单中的 Excel，将数据写入电子表格程序。然后，记录脑细胞外间隙（ECS）的体积分数、脑 ECS 的迂曲度以及非特异性清除率。为检测传输数，需在琼脂糖中进行新的记录，并在 Walter 程序中重复相关步骤以获得传输数。检查电子表格，确认转运数与脑部测量前获得的转运数相比是否变化超过10%。如果是，则通过离子电渗微电极获得的数据不可靠。本步骤测得的转运数必须与脑部测量前获得的数值高度一致，否则无法认为容积分数准确。将新获得的 ISM 校准数据作为输入，填入 Wanda 校准框中，并检查斜率值与前一次校准相比差异小于 10%。此处展示的是在琼脂中单次试验获得的代表性数据，显示了 TMA 的浓度曲线。此图为在 Walter 中进行数据处理后得到的拟合曲线。拟合曲线中数据的重叠表明，Walter 所进行的曲线拟合准确地模拟了本次试验中的扩散过程。以下是实验前脑组织中琼脂测量数据的表格。以下是小鼠脑切片在对照条件和实验条件下所测得数据的汇总。在低渗刺激下，Alpha 值如预期般降低，而迂曲度增加。在恢复条件下，Alpha 值超过对照组水平。以下是实验后大脑中 agra 测量值的表格。实验前后测得的平均迁移数相差在10%以内，表明在脑组织中记录的数值是可靠的。掌握该技术后，整个操作可在两天内共14小时内完成。第一天，制备并校准离子选择性微电极（ISM）。在第二天，需重新校准离子选择性微电极（ISM），并进行实时离子电渗。在实施该操作时，首先必须精确控制电极之间的间距。其次，只有当离子电渗微电极在整个实验过程中其离子迁移数保持稳定时，方可接受该实验结果。在完成表征小阳离子在细胞外空间扩散特性的实验步骤后，您可以进一步开展其他技术操作，例如整合性光学成像方法，以探究大分子微粒在细胞外空间中的运动方式。观看本视频后，您应能够充分掌握如何在健康与疾病状态下，对活体脑组织中的细胞外空间容积及迂曲度进行实时离子电渗法的定量分析。感谢您的观看，祝您的实验顺利成功。

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用四甲基铵进行实时离子电渗疗法，以量化体细胞分数和脑细胞外空间的变性

该视频展示了对小鼠冠状海马脑片进行电刺激后诱发的钾离子浓度动态变化。将双极刺激电极插入海马CA3区的辐射层，同时将钾离子选择性电极置于CA1区的辐射层。电刺激引发动作电位，导致钾离子释放。最后，在存在抑制性分子的情况下，诱发的钾离子反应消失，证实了钾离子浓度的动态变化源于Schaffer侧支中的动作电位产生。...

冠状海马脑片中诱发电位钾离子浓度动态的测量

本视频演示了如何利用离子选择性微电极和电泳微电极测量并比较电信号，以表征脑切片中的细胞外间隙。该过程有助于确定细胞外间隙的体积分数及其迂曲程度。...

利用离子选择性微电极与离子电渗微电极表征脑切片中的细胞外空间

来源： Moye, S. L., et.al. 利用荧光黄电泳技术可视化星形胶质细胞形态。 J. Vis. Exp. (2019)。...

使用荧光染料电泳法在固定的小鼠脑切片中可视化星形胶质细胞形态

本文中，我们介绍了一种快速微离子电渗技术，用于以高空间和时间精度研究突触后信号的整合。...

快速微离子导入谷氨酸和GABA：研究突触整合的有用工具

我们演示了两种用于测量脑组织中离子浓度的离子选择性微电极（双管型和同心型）的制备、校准及其特性。随后在小鼠海马脑片制备中应用这些电极，证明了兴奋性活动会同时改变细胞外钾离子和钠离子浓度。...

用于测量脑组织中细胞外离子信号的双管微电极与同心微电极

我们介绍了用于构建电极的方法，可在清醒小鼠中同时记录细胞外神经活动，并在记录位点附近释放多种神经活性物质。该技术能够对目标神经元的潜在局部突触输入进行详细分析。...

清醒小鼠神经元活动的细胞外记录与神经活性物质的微电泳给药相结合

此处，我们介绍一种方法 在体...

在自由活动大鼠脑电图记录期间进行兴奋性氨基酸的微透析

本文介绍了一种制备小型动物脑组织以进行显微CT成像的简便方法，该方法可在全脑背景下高精度地量化损伤并定位电极。...

一种基于显微CT的小动物脑部病变表征与电极定位方法

星形胶质细胞具有复杂的形态结构，表现为具有多个突起和密集的分布区域。为了分析其精细的形态特征，本文介绍了一种可靠的在轻度固定的组织中进行细胞内 Lucifer yellow...

使用 Lucifer Yellow 离子电泳技术可视化星形胶质细胞形态

本方案描述了实现实时观察所需的手术与技术操作步骤 体内...

利用实时活体多光子显微镜观察聚焦超声联合微泡治疗以增强血脑屏障通透性

我们描述了一种通过脑电场测量和相关生物标志物——脑血流量，来评估颅外刺激剂量-反应曲线的实验方案。由于该方案涉及将电极侵入性地植入脑内，因此需要实施全身麻醉，并优先选择自主呼吸而非控制性呼吸。...

麻醉小鼠颅外刺激电极的放置及脑血流与颅内电场的测量

了解实时离子电渗疗法，利用四甲基铵（TMA）定量测量脑组织细胞外空间的体积分数和迂曲度。该方法可实时表征活体大脑ECS的关键物理参数，为研究脑生理与疾病提供重要技术手段。

利用四甲基铵实时离子电渗法量化脑细胞外间隙的容积分数与迂曲度

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