体外 人源间充质干细胞向功能性类心肌细胞的分化

本实验方案的总体目标是诱导并观察间充质干细胞的心肌细胞向分化。该方法有助于回答间充质干细胞研究领域中的关键问题，例如，环境信号可诱导产生何种干预措施以生成功能性心肌细胞。该技术的主要优势在于，它采用细胞聚集体形成和心脏胎儿层结构，而非药理学试剂或遗传物质。

该技术的意义延伸至心血管疾病的治疗，因为它进一步阐明了间充质干细胞的心肌生成潜能。与我一同演示该操作的有：本实验室的博士生法尔瓦·伊克巴尔（Farwah Iqbal）小姐，以及本实验室的培训学员马克斯·利布勒（Max Librach）和纳达尔·加斯纳（Nadav Gasner）。根据文本方案分离新生大鼠器官组织后，将心室切成两半，转移至含有10毫升PBS的10厘米培养皿中，并置于冰上静置，以去除血液。

然后使用弯头剪刀将心室壁剪成直径为2至3毫米的小块。用移液管将10到12只动物的心脏组织块转移至一个50毫升离心管中，静置使其沉降。尽可能吸除PBS P/S溶液，注意不要吸走任何心脏组织块。

然后加入 10 毫米的新鲜 PBS P/S。为了分离心肌细胞，在心脏组织块沉降后，用含 0.15% 胰蛋白酶的 PBS 替换 PBS P/S，并在 37°C 条件下振荡孵育 10 分钟。弃去上清液。

然后，再重复胰蛋白酶消化三次，但将上清液倒入含有10毫升100% FBS的50毫升收集管中。接下来，离心细胞管并吸除上清液。然后用含10% FBS和1% P/S的DMEM-F12重悬细胞，并将其接种至六孔板中。

细胞贴壁后，更换为2 mL新鲜培养基。为制备预染色的间充质干细胞（MSCs），从直径10 cm培养皿中取出达到70%至80%融合度的MSC培养物的培养基，加入3 mL细胞解离液。将培养皿置于37°C、5%二氧化碳条件下孵育5分钟。

将解离的细胞转移至15毫升离心管中，在400 × g条件下离心5分钟。吸除上清液，注意不要扰动细胞沉淀，然后重新悬浮细胞。随后使用自动细胞计数仪对细胞进行计数。

将细胞用含10% FBS和1% P/S的DMEM-F12培养基稀释至浓度为每毫升1 × 10⁶个MSCs。然后，在1.5毫升离心管中加入可存活且不可转移的荧光染料，并将MSCs孵育30分钟。在400 × g离心5分钟后，吸除上清液，并将沉淀重悬于培养基中，调整浓度为每毫升1 × 10⁶个MSCs。

然后将间充质干细胞以每六孔板孔10 × 10⁴个细胞的浓度接种到心肌细胞上。为制备聚集体共培养物，需在α-MEM培养基中制备间充质干细胞的单细胞悬液，该培养基添加10% FBS和1% P/S。通过将25 µL细胞悬液滴加至10 cm组织培养皿盖内表面，以启动聚集体的形成。

将盖子盖在含有 PBS P/S 的底部培养皿上。在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳条件下孵育培养皿。在体视显微镜下，于三天后观察液滴中聚集体的形成情况。

如果超过80%的液滴中含有形成的聚集体，则使用1毫升移液器从盖子上收集液滴，并将聚集体直接转移至原代大鼠心肌细胞单层上。将共培养的聚集体孵育最多两周，每72小时更换一次全部培养基。

每天使用明场显微镜观察聚集物是否附着于胎儿细胞层。当观察到收缩的聚集物时，进行记录。活跃的聚集物会以同步方式收缩，我们推测这些聚集物之间通过无物理活动的胎儿细胞层存在传导性。

吸去培养基，每孔加入2毫升PBS。然后移除PBS，每孔加入2毫升解离液。将培养板置于37°C、5%二氧化碳条件下孵育3分钟。

如图所示，三种不同类型的HMSCs在直接共培养中表现出相似的丰度和形态。在将悬滴转移至心肌细胞进行聚集体共培养后的2至3天，FTM和足月huck PBCs形成的聚集体较BMSCs更大。本实验中，对未分化MSCs进行流式细胞术分析CD49F表达显示，96%的FTM huck PBCs、89%的huck PBCs以及53%的BMSCs细胞表面CD49F呈阳性。

对TRA赢85细胞进行流式细胞术分析，结果显示，在直接心肌细胞共培养体系中，FTM huck PBCs和足月huck PBCs均上调了心肌细胞相关标志物SIRPA的表达，而BMSCs则无此上调现象。如图所示，在直接共培养条件下，FTM huck PBCs中cx43的上调水平显著高于足月huck PBCs或BMSCs。荧光显微镜分析表明，处于分化状态的FTM和足月huck PBCs均上调了cx43的表达。

足月出生的huck PBCs中该比例高于足月产妇来源的细胞。然而，荧光显微镜显示，在足月产妇来源的huck PBCs细胞膜上可观察到cx43阳性斑点，而在足月细胞中则主要位于细胞质内。最后，如图所示，在共培养后的分选人源细胞上进行高倍荧光显微镜观察，证实了cx43在细胞质膜上的高丰度表达。

一旦掌握，该实验的关键步骤若操作得当，每步可在一小时内完成。进行该实验时，必须保持无菌操作。所涉及的原代动物组织若处理不当，可能引入污染。

完成此操作后，可进一步采用其他方法，例如对收缩性聚集体进行长期培养，以回答更多问题，如这些结构的长期存活能力。该技术建立后，可使间充质干细胞领域的研究人员探索来自较年轻来源的间充质干细胞（如胚外组织）的分化潜能。观看本视频后，您应能够充分掌握如何制备间充质干细胞聚集体，并将其与直接分离的原代胎儿组织层相结合，从而为心肌向分化提供适当的诱导环境。

请注意，使用BrdU可能具有极高危险性，在进行本实验操作时，必须采取适当的预防措施，例如妥善处理细胞毒性废弃物。