Name: 在体外人骨髓间充质干细胞分化为心肌样细胞功能 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-09T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 5 s
Description: 学习利用环境信号诱导人间充质干细胞分化为心肌样细胞的方法，无需药物或基因操作。该技术通过聚集体形成与心脏胎层共培养，为心血管疾病治疗提供新策略。

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作者感谢以下工作人员和研究人员的贡献：Matthew Librach、Leila Maghen、Tanya A. Baretto、Shlomit Kenigsberg 和 Andrée Gauthier-Fisher。本工作由安大略研究基金-研究卓越项目（ORF-RE，第七轮）和 CReATe 项目公司资助。

所有涉及动物的研究均按照ARRIVE指南进行并予以报告48所有研究均经机构研究伦理委员会批准（REB 编号 454-2011，Sunnybrook 研究所；REB 29889，多伦多大学，加拿大 多伦多）。所有动物实验均经大学健康网络动物护理委员会（加拿大 多伦多）批准，所有动物的饲养和使用均符合《实验动物护理与使用指南》（第8版）的要求。th （美国国立卫生研究院，2011年版）
1. 组织培养
<ol>
	<li>培养FTM HUCPVCs，足月HUCPVCs（先前已建立）， n 每种至少3个独立的细胞系42 以及在补充有10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素/链霉素（P/S）混合液的α-最低必需培养基（MEM）中培养 commercially available BMSCs。将大鼠原代心肌细胞及MSC-心肌细胞共培养体系培养于含10% FBS和1% P/S的Dulbecco改良Eagle培养基：营养混合物F-12（DMEM-F12）中。 
	注意：使用 0.2-µm 滤器对培养基进行灭菌。配制好的培养基溶液于 4 °C 保存，可存放长达 3 周。</li>
	<li>在湿润培养箱中维持细胞培养（95% 相对湿度、37 °C、5% CO₂）2）并在相位对比显微镜下观察细胞融合度达到70-80%时进行传代。根据所使用的组织培养皿的尺寸，使用适量的培养基。例如， 10 cm 培养皿中加入 10 mL，6 孔组织培养板每孔加入 2 mL。在整个实验过程中使用上述培养条件。</li>
	<li>使用消化酶溶液（6孔板每孔2 mL）在37 °C孵育4分钟，以解离MSC单层细胞，用于传代或建立MSC-心肌细胞共培养。</li>
	<li>将解离的细胞转移至15 mL离心管中，在400 x g下离心5分钟。</li>
	<li>吸弃上清液，注意不要扰动细胞沉淀，然后将细胞重悬于1 mL适合使用自动细胞计数仪计数的培养基中。按照后续实验方案部分所述方法接种细胞。</li>
</ol>
2. 原代大鼠心肌细胞-间充质干细胞共培养体系的制备
<ol>
	<li>获取心脏组织用于原代心肌细胞的分离。
	<ol>
		<li>使用 CO₂ 处死新生 5-6 天的大鼠幼崽2 窒息。设置CO2 将腔室气体置换至20%（流速 = 0.2 倍腔室体积/分钟）。通过捏夹反射消失确认动物死亡。</li>
		<li>使用无菌器械切除与主要血管相连的心房（即， 镊子和弯剪41将心脏转移至含有含1%青霉素-链霉素的无菌磷酸盐缓冲液（PBS-P/S）的50 mL离心管中，置于冰上。</li>
		<li>将心室沿中线切开，在冰上含有10 mL PBS-P/S的10 cm培养皿中冲洗出血。使用弯头剪刀将心室壁剪成小块（直径 = 2–3 mm）。</li>
		<li>使用血清移液管将10至12只动物的心脏组织块转移至50 mL离心管中，静置沉降。</li>
		<li>尽可能去除 PBS-P/S，但不要移除任何心脏组织块。加入 10 mL 新的 PBS-P/S。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>消化心脏组织以分离心肌细胞。
	<ol>
		<li>让心肌组织碎片自然沉降。弃去PBS-P/S，加入10 mL含0.15%胰蛋白酶的PBS溶液，于37 °C振荡消化10分钟。</li>
		<li>弃去上清液。重复步骤2.2.1中所述的消化过程三次，但将上清液倾入含有10 mL 100% FBS的50 mL收集管中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>离心细胞（400 × g，5 分钟），吸除上清液。用含 10% FBS 和 1% P/S 的 DMEM-F12 重悬细胞，接种至 6 孔板（1 × 10⁶ 细胞/孔）5 细胞/厘米²2，每孔2 mL培养基。</li>
	<li>孵育1小时后，将含有未贴壁细胞的培养基转移至50 mL离心管中，弃去已贴壁的细胞。计数悬浮细胞，并将它们重新接种至新的6孔板中（1 × 10⁶ cells/well）。5 细胞/厘米²2，每孔加入2 mL含10% FBS和1% P/S的DMEM-F12培养基。</li>
	<li>用溴脱氧尿苷（BrdU）抑制细胞增殖。 
	注意：BrdU 是一种强致畸剂，且为疑似致突变剂。使用前请确保已接受适当培训，并查阅安全数据表。
	<ol>
		<li>细胞贴壁后，将6孔板中的培养基更换为含10% FBS、1% P/S（每孔2 mL培养基）和5 µM BrdU的DMEM-F12培养基，于37 °C、5% CO₂条件下孵育16 h。2).</li>
		<li>移除含 BrdU 的培养基，更换为含 10% FBS 和 1% P/S 的 DMEM-F12 培养基（每孔 2 mL）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>制备预染色的间充质干细胞（MSCs）。
	<ol>
		<li>当10 cm培养皿中的MSC培养物达到70–80%融合度时，移除培养基，加入3 mL细胞解离溶液。将培养皿置于37 °C、5% CO₂条件下孵育。2 5 分钟。</li>
		<li>将解离的细胞转移至15 mL离心管中，在400 x g下离心5分钟。</li>
		<li>吸弃上清液，避免扰动细胞沉淀，然后将细胞重悬于1 mL含10% FBS和1% P/S的DMEM-F12培养基中，使用自动细胞计数仪进行细胞计数。</li>
		<li>将细胞稀释至浓度为 1 x 106 含10% FBS和1% P/S的DMEM-F12培养基中的MSC/mL</li>
		<li>将MSCs与可存活但不可转移的荧光染料（5 µM，30分钟，37 °C，5% CO₂）共同孵育2在1.5 mL离心管中孵育1小时。</li>
		<li>将离心管在400 × g下离心5分钟。吸除上清液，并将沉淀重悬于含10% FBS和1% P/S的DMEM-F12中，调整细胞浓度至1 × 106 MSC/mL。重复此步骤共3次。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将MSCs以10 × 10的浓度接种至心肌细胞（步骤2.5.2）上4 每孔细胞数（6 孔板）</li>
</ol>
3. 聚集体共培养物的制备
<ol>
	<li>在补充有10% FBS和1% P/S的α-MEM培养基中制备MSCs单细胞悬液（2 × 104 个细胞/mL，传代次数 ≤ 6）（见步骤2.6）。 
	注意：有关细胞传代操作，请参见本方案第1节。或者，可按照步骤2.6对MSCs进行预染色。</li>
	<li>将25 µL细胞悬液（含500个细胞）滴加至10 cm组织培养皿盖内表面，以启动聚集体形成（每盖最多可加50滴）。将皿盖倒置放在底部含有PBS-P/S的培养皿上，在37 °C、5% CO2条件下孵育。 
	注意：在悬挂液滴下方的培养皿中加入5–7 mL PBS-P/S，以防止液滴蒸发。</li>
	<li>3天后使用体视显微镜观察液滴中聚集体的形成情况。若50滴中有超过40滴形成聚集体，则用1 mL微量移液器从皿盖上收集液滴，并将聚集体直接转移至原代大鼠心肌细胞单层（按步骤2.1–2.7制备；每孔10滴）。操作时避免剧烈吹打，以保持聚集体完整性。</li>
	<li>将聚集体共培养物置于培养箱中最多培养2周，每隔72小时更换一次完全培养基（每孔加入2 mL含10% FBS和1% P/S的DMEM-F12培养基）。
	<ol>
		<li>每日使用明场显微镜观察聚集体在饲养层细胞上的贴附情况。当观察到聚集体出现收缩时，进行记录。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>准备用于分析的聚集体。
	<ol>
		<li>吸除培养基，向6孔组织培养板每孔加入2 mL PBS。吸除PBS后，每孔加入2 mL解离溶液。在37 °C、5% CO2条件下孵育3分钟。</li>
		<li>以400 × g离心5分钟，获得细胞沉淀。根据后续步骤中所述应用的具体要求，将细胞重悬于相应培养基中（见步骤4.1、5.1和6.1），并通过70 µm细胞筛网过滤。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 流式细胞术（FC）和荧光激活细胞分选（FACS）
<ol>
	<li>孵育细胞悬液（1 × 105 在含有3% FBS的200 µL PBS中，使用荧光染料标记的一抗（FITC或APC标记）孵育细胞即， CD49f、Cx43、TRA-1-85、HLA-A、HLA-G 和 SIRPA（用于 FC）或 TRA-1-85（用于 FACS）；1:40，4 °C 避光孵育 30 分钟。</li>
	<li>离心（400 × g，5 分钟），用 1 mL 含 3% FBS 的 PBS 重悬细胞用于 FC，或用含 0.5% FBS 的 PBS 重悬用于 FACS。 
	注意：MSCs 的 FC 由 Hong 优化 等41.</li>
	<li>将细胞置于 4 °C 避光保存，直至准备进行流式细胞术分析（至少 1 x 104 事件）或流式细胞分选（FACS）。按所述方法分选细胞41将TRA-1-85高阳性分选细胞重新接种至6孔板中（1 × 10⁶细胞/孔）4 每孔细胞数、含10% FBS和1% P/S的2 mL DMEM-F12培养基，在1小时内完成接种。 
	注意：有关 TRA-1-85 人细胞表面抗原的设门策略，请参见 补充图.</li>
</ol>
5. 免疫细胞化学（ICC）与显微镜检查
<ol>
	<li>将来自共培养（步骤 3.5.2）或 FACS（第 4 节）获得的细胞悬液重新接种至腔室载玻片（1 × 10⁵ 细胞/孔）4 细胞/孔，每孔加入2 mL含10% FBS和1% P/S的DMEM-F12培养基）。置于组织培养孵箱中过夜，使细胞贴壁（培养条件见第1部分）。</li>
	<li>使用 3 mL 含 4% 多聚甲醛（PFA）的 PBS 溶液在室温下固定细胞 15 分钟。随后用含 1% 牛血清白蛋白（BSA）的 PBS（PBS-BSA）溶液洗涤 3 次，每次 3 mL，每次洗涤 5 分钟。 
	注意：操作PFA时请佩戴适当的个人防护装备。</li>
	<li>用含 0.1% Triton X-100 的 3 mL PBS-BSA 溶液对细胞进行透化处理。室温孵育 10 分钟，用于检测细胞内抗原（即， α-肌节肌动蛋白（aSarc）和连接蛋白43（Cx43），或25分钟用于核内抗原即， Mef2c 和人核抗原（HuNu）。用 3 mL PBS-BSA 洗涤 3 次，每次 5 分钟。</li>
	<li>用含有5%正常山羊血清（NGS）和1% BSA的3 mL PBS溶液在室温下封闭样本15分钟，以阻断非特异性抗体反应。随后用3 mL PBS-BSA溶液洗涤3次，每次5分钟。</li>
	<li>将细胞与一抗孵育即， Mef2c、aSarc、Cx43 和 HuNu) 以 PBS-BSA 按 1:200 稀释，4 °C 下孵育过夜。</li>
	<li>用 3 mL PBS-BSA 洗涤 3 次，每次 5 分钟，室温下与二抗孵育 30 分钟。再用 3 mL PBS-BSA 洗涤 3 次，每次 5 分钟。</li>
	<li>将染色后的标本置于3 mL封片剂中保存。</li>
	<li>使用荧光显微镜采集图像。低倍成像时采用10倍物镜（NA = 0.3）和20倍物镜（NA = 0.45）。针对所用的二抗，选择适用于GFP（激发波长 = 470/22 nm，发射波长 = 525/50 nm）和RFP（激发波长 = 531/40 nm，发射波长 = 593/40 nm）的荧光滤光片组和波长设置（参见 材料与设备表).</li>
	<li>使用成像软件对图像进行定量分析（参见 材料与设备表 （针对推荐的软件）将荧光强度读数归一化至相应的阴性对照采集数据。</li>
</ol>
6. RNA 提取与定量 RT-PCR
<ol>
	<li>根据试剂盒制造商的说明，使用基于柱的RNA提取法从未分化的MSC培养物或从共培养体系中分选得到的MSC中制备RNA样品。每个样品使用0.7 mL裂解缓冲液（随RNA提取试剂盒提供）处理1 × 104 至 1 × 106 个细胞。</li>
	<li>每100 µL反转录反应体系中，使用最多2 µg RNA制备cDNA。</li>
	<li>每个qPCR反应使用10 ng cDNA进行扩增（共40个循环，退火/延伸温度为60 °C）。
	<ol>
		<li>使用人源MY6H和cTnT的引物，终浓度为500 nM，每个反应加入1–100 ng cDNA（参见材料与设备表）。以GAPDH、ACTB和HPRT作为内参管家基因进行标准化。采用市售的人诱导性多能干细胞来源的心肌细胞作为阳性对照。 
		注意：相对于未分化MSC来源的cDNA样品，计算目标基因表达量的倍数变化。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

Clifford L. Librach 博士是以下专利的共同持有人：从妊娠早期脐带组织中分离和使用衍生细胞的方法，该专利已在加拿大和澳大利亚获得授权。

干细胞向心肌细胞的分化研究已持续二十余年，目前已有多种不同策略用于从间充质干细胞来源生成类似心肌细胞的细胞。然而，这些策略中的许多效率较低，且所采用的培养条件往往不能代表移植细胞在体内所遇到的实际微环境。 体内.
与现有方法相比，本研究中介绍的方案利用了原代心肌饲养层与间充质干细胞（MSC）聚集体形成的组合。原代心肌饲养层提供了一种类似于人源间充质干细胞（hMSCs）移植后所处的分化环境。聚集体则形成了具有氧气和营养物质梯度的微环境，这种梯度可诱导细胞启动谱系定向分化。基于多能干细胞（PSC）和胚胎干细胞（ESC）的心肌分化策略已证实，低氧预处理和聚集体形成对干细胞具有此类诱导作用5,52,53。此外，三维结构更接近体内（in vivo）的细胞间连接方式。采用该方法，我们成功获得了同步收缩的人源间充质干细胞（hMSC）聚集体——据我们所知，这是首次实现此类hMS...

充血性心力衰竭（CHF）仍是全球范围内导致发病和死亡的主要原因之一。CHF 常在心肌梗死（MI）后大量心肌细胞丢失并形成无细胞的瘢痕组织这一病理过程中发生1。尽管心脏是一种具有部分自我更新能力的器官，但负责组织再生的内源性干细胞和祖细胞库在老年患者中数量显著减少，功能也明显下降，通常不足以支持损伤后的充分修复。因此，人们高度关注开发涉及将健康供体细胞移植到受损心肌中的实验性治疗方法。至关重要的是，供体细胞不仅需要恢复心肌组织的结构，还必须实现受累心肌的功能性恢复。
天然心脏利用心脏组织驻留的以及内源性骨髓来源的干细胞进行损伤后的修复2,3,4。无论是宿主来源还是供体来源的再生细胞，都必须能够在心肌重塑的微环境中获得适当的表型和功能，并具备高效且安全地替代丢失细胞的能力。体外分化方法已被广泛用于实现高效、基于干细胞的心肌细胞生成5,6。通过心脏谱系标志物的表达谱来定义干细胞向心脏谱系的分化过程7。早期分化标志物，如NKX2.5、肌细胞增强因子2C（Mef2c）和GATA48,9，可作为心肌发生过程启动的指标。常用于评估分化效率的成熟心肌细胞标志物包括信号调节蛋白α（SIRPA）10、心肌肌钙蛋白T（cTnT）11、重链心肌肌球蛋白（MYH6）8,12,13以及连接蛋白43（Cx43）14,15,16。利用胚胎干细胞（ESCs）和多能干细胞（PSCs）的方法已在诱导因子、氧和营养梯度以及作用时间点等细节方面进行了充分优化和讨论5,6,7,17,18。然而，基于ESC和PSC的技术仍存在多种伦理和安全问题，并伴有电生理和免疫学特性欠佳的情况19,20。接受这些细胞移植的宿主常出现免疫排斥反应，需要长期免疫抑制治疗。这主要是由于宿主与供体之间主要组织相容性复合体（MHC）分子不匹配，进而引发T细胞反应21。尽管个体MHC I类分子匹配是一种可能的解决方案，但更易于临床实施的做法是寻找一种具有普遍免疫豁免特性的细胞来源，以克服排斥反应的担忧。
作为临床应用的替代细胞来源，间充质干细胞（MSCs）尤其是骨髓间充质干细胞（BMSCs），自1995年首次被描述以来，已被广泛研究用于组织再生22。MSCs被认为是一类存在于几乎所有血管化组织中的固有再生细胞23。从目标来源分离后，MSCs可在体外易于扩增，具有强大的旁分泌能力，并通常表现出免疫豁免或免疫调节特性24,25。多项临床前研究已证实其安全性和有效性，尤其在心脏再生领域表现突出3,26。
许多间充质干细胞（MSC）分化策略利用药理学试剂，如5-azacytidine22和DMSO27，以及生长因子或形态发生因子，如BMPs5,7,28,29或血管紧张素II（angiotensin-II）30，但其效率存在差异。然而，这些策略并未基于原始再生细胞在体内归巢或被递送至损伤部位后可能遇到的障碍。in vivo。更具生理相关性的策略虽然更难界定和操控，但其前提是MSC的分化可通过组织微环境自身发出的信号诱导。先前的研究表明，在体外暴露于心肌细胞裂解物31或心室心肌组织32,33，或与原代心肌细胞直接接触in vitro15,34，均可增加MSC中心脏标志物的表达。其他研究也证明，在用MSC治疗心脏损伤后可出现自发的心肌生成35,36,37,38，尽管部分新生心肌组织的形成源于骨髓间充质干细胞（BMSCs）与心肌细胞的融合39,40。据我们所知，目前尚未见报道从任何组织来源的人类间充质干细胞（hMSCs）中获得具有功能并能自发收缩的心肌细胞。
目前的共识认为，所有间充质干细胞均起源于血管周围细胞23. 具有周细胞特性的年轻间充质干细胞可从人脐带组织的血管周围区域分离获得41,42,43与骨髓间充质干细胞（BMSCs）相比，脐带华通氏胶血管周围细胞（HUCPVCs）具有更强的分化潜能及其他多种再生优势， 体外41,44 和 体内45,46,47值得注意的是，由于HUCPVCs来源于母胎界面，其免疫原性显著低于成体来源的MSCs。我们的研究聚焦于围产期HUCPVCs（FTM HUCPVCs）的表征及其临床前应用，这是目前所研究的最年轻的MSC来源。我们此前已证实，这类细胞具有更强的增殖能力以及更高的多向分化潜能，包括心肌细胞谱系分化能力。41.
在此，我们介绍一种结合细胞聚集体形成和原代心肌细胞饲养层作为诱导力的方案，以实现间充质干细胞（MSCs）完全的心肌向分化。聚集体可提供三维环境，更真实地模拟体内条件 体内 与二维贴壁培养相比。利用心肌细胞饲养层可提供一个更接近间充质干细胞（MSCs）最终移植部位的微环境。我们证明，从产前或产后脐带中分离获得的较年轻来源的MSCs，相较于成体骨髓间充质干细胞（BMSCs），具有更强的聚集体形成能力及向心肌表型分化的潜能，同时仍可维持其免疫豁免特性。此外，这些细胞表现出心脏谱系标志基因的显著上调以及细胞内（即， cTnT 和 MYH6）以及细胞表面蛋白（即， 我们通过心肌细胞特异性标志物（SIRPA和Cx43）证实，采用该方法可利用FTM HUCPVCs的分化潜能，使其生成可自发收缩的心肌样细胞。

<table><tbody><tr><td>0.25% 胰蛋白酶/EDTA</td><td>Gibco</td><td>25200056</td><td>用于细胞解离</td></tr><tr><td>Alpha-MEM</td><td>Gibco</td><td>12571071</td><td>用于HUCPVC和BMSC培养基</td></tr><tr><td>PE标记的抗人/小鼠CD49f抗体</td><td>Biolegend</td><td>313612</td><td>FC 的整合素标记物</td></tr><tr><td>APC标记的人源Cx43/GJA1抗体</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>FAB7737A</td><td>FC的连接蛋白43标记物</td></tr><tr><td>FITC标记的HLA-A2抗体</td><td>Genway Biotech Inc.</td><td>GWB-66FBD2</td><td>FC 的免疫原性标志物</td></tr><tr><td>FITC标记的抗HLA-G [MEM-G/9] 抗体</td><td>Abcam</td><td>ab7904</td><td>FC 的免疫原性标志物</td></tr><tr><td>FITC标记的小鼠抗人SIRPA/CD172a抗体</td><td>AbD Serotec/Bio-Rad</td><td>MCA2518F</td><td>心脏标志物用于FC</td></tr><tr><td>APC标记的人TRA-1-85/CD147抗体</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>FAB3195A</td><td>用于流式细胞术和荧光激活细胞分选的人类细胞标志物</td></tr><tr><td>FITC标记的人TRA-1-85/CD147抗体</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>FAB3195F</td><td>用于流式细胞术和荧光激活细胞分选的人类细胞标志物</td></tr><tr><td>抗连接蛋白43/GJA1抗体</td><td>Abcam</td><td>ab11370</td><td>Cx43。用于免疫细胞化学</td></tr><tr><td>山羊抗兔IgG（H+L）交叉吸附二抗，Alexa Fluor 555</td><td>Life Technologies</td><td>A-21428</td><td>用于免疫细胞化学</td></tr><tr><td>抗肌节α-辅肌动蛋白[EA-53]抗体</td><td>Abcam</td><td>ab9465</td><td>aSARC。用于免疫细胞化学</td></tr><tr><td>山羊抗小鼠IgM重链交叉吸附二抗，Alexa Fluor 555</td><td>Life Technologies</td><td>A-21426</td><td>用于免疫细胞化学（ICC）</td></tr><tr><td>Mef2C (D80C1) XP 兔抗体</td><td>New England BioLabs Ltd.</td><td>5030S</td><td>用于免疫细胞化学</td></tr><tr><td>驴抗兔IgG（H+L）二抗，Alexa Fluor 488标记</td><td>Life Technologies</td><td>A-21206</td><td>用于免疫细胞化学</td></tr><tr><td>抗核抗体（HuNu）（克隆 235-1）</td><td>EMD Millipore</td><td>MAB1281</td><td>用于免疫细胞化学</td></tr><tr><td>MZ9.5 体视显微镜</td><td>Leica</td><td></td><td>用于成像聚集物。</td></tr><tr><td>1.5 ml 离心微量管</td><td>Axygen</td><td>MCT-150-C</td><td>用于使用荧光染料对间充质干细胞进行染色。</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td></td><td></td><td>开源图像处理软件</td></tr><tr><td>Aria II&amp;nbsp;</td><td>BD</td><td></td><td>UHN SickKids FC 设施。用于细胞分选。</td></tr><tr><td>骨髓间充质基质细胞</td><td>Lonza</td><td>PT-2501</td><td>BMSCs</td></tr><tr><td>牛血清白蛋白</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7030-100G</td><td>BSA。用于免疫细胞化学（ICC）溶液的配制</td></tr><tr><td>BrdU</td><td>EMD Millipore</td><td>MAB3424</td><td>注意：BrdU 是一种强致畸剂，且疑似具有致突变性。使用前请确保接受过适当培训，并查阅安全数据表（SDS）。</td></tr><tr><td>第二歌</td><td>BD</td><td></td><td>UHN SickKids FC 实验室。用于流式细胞术。</td></tr><tr><td>cDNA EcoDry 预混液</td><td>Clontech/Takara</td><td>639570</td><td>用于qPCR的cDNA制备</td></tr><tr><td>CellTracker Green CMFDA 染料</td><td>Life Technologies</td><td>C7025</td><td>细胞质的荧光成像</td></tr><tr><td>Countess 自动细胞计数仪</td><td>Invitrogen 公司</td><td>C10227</td><td>用于细胞计数</td></tr><tr><td>DMEM-F12</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D6421</td><td>大鼠原代心肌细胞培养基</td></tr><tr><td>杜氏磷酸盐缓冲液</td><td>Gibco</td><td>10010023</td><td>D-PBS，不含 Ca&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;，Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>EVOS</td><td>Life Technologies</td><td></td><td>自制荧光显微镜</td></tr><tr><td>FACSCalibur</td><td>BD</td><td></td><td>内部使用。用于流式细胞术。</td></tr><tr><td>胎牛血清（Hyclone）</td><td>GE Healthcare</td><td>SH3039603</td><td>FBS。细胞培养基的组分。</td></tr><tr><td>IDT Prime Time qPCR 探针</td><td>集成数据技术</td><td>FAM 荧光团</td><td>http://www.idtdna.com/pages/products/gene-expression/primetime-qpcr-assays-and-primers</td></tr><tr><td>Lab Vision PermaFluor 水性封片介质</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>TA-030-FM</td><td>用于进行免疫细胞化学的细胞储存</td></tr><tr><td>LSR II&amp;nbsp;</td><td>BD</td><td></td><td>UHN SickKids FC 设施。用于流式细胞术。</td></tr><tr><td>MoFlo Astrios</td><td>贝克曼库尔特</td><td></td><td>UHN SickKids FC 设施。用于细胞分选。</td></tr><tr><td>正常山羊血清</td><td>细胞信号技术公司</td><td>5425S</td><td>NGS。用于免疫细胞化学封闭液中</td></tr><tr><td>Nunc Lab-Tek II 培养皿盖玻片，8 孔</td><td>赛默飞世尔科技 Nunc</td><td>155409</td><td>用于免疫细胞化学的样本制备</td></tr><tr><td>OmniPur Triton X-100 表面活性剂</td><td>EMD Millipore</td><td>9410-OP</td><td>作为制备细胞进行免疫细胞化学染色时的透化溶液组分</td></tr><tr><td>16% 甲醛溶液，电镜级</td><td>电子显微镜科学公司</td><td>15710</td><td>用于ICC细胞固定。</td></tr><tr><td>青霉素/链霉素</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td>细胞培养基组分。</td></tr><tr><td>引物</td><td>Sigma</td><td>定制标准DNA寡核苷酸，脱盐，0.2 &amp;mu;mol</td><td>&lt;强&gt;CTnT_F:&lt;/strong&gt; GGC AGC GGA AGA GGA TGC TGA A &lt;强&gt;CTnT_R:&lt;/strong&gt; GAG GCA CCA AGT TGG GCA TGA ACG A &lt;强&gt;MYH6 F:&lt;/strong&gt; GCA AAG TAC TGG ATG ACA CGC T &lt;强&gt;MYH6 R:&lt;/strong&gt; GTC ATT GCT GAA ACC GAG AAT G</td></tr><tr><td>Quorum 转盘共聚焦显微镜</td><td>Zeiss</td><td></td><td>病童医院影像中心</td></tr><tr><td>ReproCardio 人诱导多能干细胞衍生心肌细胞</td><td>ReproCell</td><td>RCD001N</td><td>qPCR 阳性对照</td></tr><tr><td>RNeasy mini试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>74106</td><td>用于qPCR的RNA提取</td></tr><tr><td>Rotor-Gene SYBR Green PCR 试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>204074</td><td>使用预混液进行qPCR</td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Gibco</td><td>A1049101</td><td>用于间充质干细胞与单核细胞共培养的培养基</td></tr><tr><td>TaqMan qPCR 引物检测</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>4444556</td><td>用于qPCR</td></tr><tr><td>台盼蓝</td><td>Life Technologies</td><td>T10282</td><td>细胞活力染色与计数</td></tr><tr><td>胰蛋白酶</td><td>Gibco</td><td>272500108</td><td>用于细胞解离</td></tr><tr><td>Volocity</td><td>Perkin-Elmer</td><td>Volocity 6.3</td><td>成像软件</td></tr><tr><td>0.2 &amp;mu;微孔滤膜</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>566-0020</td><td>用于组织培养基的灭菌</td></tr><tr><td>HERAcell 150i CO₂ 培养箱&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 培养箱</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>51026410</td><td>用于细胞孵育</td></tr><tr><td>杜氏磷酸盐缓冲液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td>PBS，1×，不含氯化钙和氯化镁</td></tr><tr><td>镊子</td><td>Almedic</td><td>7727-A10-704</td><td>用于持取大鼠心脏。可使用任何类似的镊子。</td></tr><tr><td>剪刀</td><td>精细科学工具</td><td>14059-11</td><td>用于切碎大鼠心脏。推荐使用弯头剪刀。</td></tr><tr><td>50 mL 离心管</td><td>BD Falcon</td><td>352070</td><td>用于心肌细胞收集及常规组织培养操作过程中的收集</td></tr><tr><td>15 mL 离心管</td><td>BD Falcon</td><td>352096</td><td>组织培养常规操作步骤</td></tr><tr><td>6孔板</td><td>赛默飞世尔科技 Nunc</td><td>CA73520-906</td><td>用于组织培养</td></tr><tr><td>10 cm 组织培养皿</td><td>康宁</td><td>25382-428</td><td>用于聚集体形成</td></tr><tr><td>Axiovert 40C 显微镜</td><td>Zeiss</td><td></td><td>用于整个组织培养及后续实验步骤中的明场成像</td></tr><tr><td>70 &amp;mu;m细胞滤筛</td><td>Fisherbrand</td><td>22363548</td><td>为确保流式细胞术或分选前获得单细胞悬液</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>EMD Millipore</td><td>9410-1L</td><td>用于免疫细胞化学的透化溶液中</td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>H1399</td><td>用于观察Cx43定位的染色剂</td></tr></tbody></table>

体外 人源间充质干细胞向功能性类心肌细胞的分化

In Vitro Differentiation of Human Mesenchymal Stem Cells into Functional Cardiomyocyte-like Cells

心肌梗死及其继发的缺血级联反应导致大量心肌细胞丢失，进而引发充血性心力衰竭，后者是全球死亡的首要原因。间充质干细胞（MSCs）是一种有前景的细胞治疗手段，有望替代目前的侵入性治疗技术。MSCs 可分化为间充质谱系细胞，包括心脏细胞类型，但尚未实现向功能性细胞的完全分化。以往的分化方法主要依赖药理学试剂或生长因子。然而，更具生理相关性的策略也可诱导 MSCs 发生心肌生成性转化。本文介绍一种利用 MSC 细胞聚集体在心肌细胞饲养层上共培养以生成具有收缩功能的心肌样细胞的分化方法。
人脐带血管周围细胞（HUCPVCs）已被证明具有比常被研究的间充质干细胞（MSC）类型（如骨髓间充质干细胞，BMSCs）更强的分化潜能。作为一种发育上更年轻的细胞来源，我们比较了妊娠早期（FTM）HUCPVCs与较年长来源细胞的心肌生成潜能。FTM HUCPVCs是一种新型且丰富的MSC来源，能够保持其 在子宫内 培养时的免疫豁免特性 体外采用该分化方案，FTM和足月HUCPVCs的心肌向分化程度显著高于BMSCs，表现为心肌细胞标志物的表达水平明显升高（即， 心肌细胞增强因子2C、心肌肌钙蛋白T、重链心肌肌球蛋白、信号调节蛋白α和连接蛋白43）。它们还表现出显著较低的免疫原性，表现为HLA-A表达水平较低而HLA-G表达水平较高。采用基于细胞聚集体的分化方法，FTM HUCPVCs显示出更强的聚集体形成能力，并在与心肌饲养层共培养1周内即生成可收缩的细胞簇，成为首个实现该现象的间充质干细胞类型。 
我们的结果表明，该分化策略能够有效利用年轻间充质干细胞（如FTM HUCPVCs）的心肌生成潜能，并提示 体外 预分化可能是提高其再生功效的一种潜在策略 体内.

HUCPVCs 与 BMSCs 相比表现出更强的聚集体形成能力和更高的 CD49f 表达水平：
为了诱导hMSCs的分化（即， FTM HUCPVCs、足月HUCPVCs和BMSCs）未分化的MSCs或含MSC的悬滴单细胞悬液（表1) 分别转移至大鼠原代心肌细胞单层培养物上，以建立直接共培养或聚集体共培养体系。三种不同类型的间充质干细胞在直接共培养中表现出相似的丰度和形态特征（图1A）。在将悬滴转移至心脏细胞聚集体共培养后2-3天表1），FTM 和足月 HUCPVCs 出现在较大的聚集体中（310 µm ± 30 µm 和 240 µm ± 40 µm，分别）与BMSCs所见相比180 µm ± 30 µm; <strong class="x...

本文介绍了一种高效利用年轻来源的人类间充质干细胞的心脏分化潜能以生成具有功能且能够收缩的心肌样细胞的方法。 体外

心肌梗死及其继发的缺血级联反应导致大量心肌细胞丢失，进而引发充血性心力衰竭，这是最主要的……

本实验方案的总体目标是诱导并观察间充质干细胞向心肌细胞的分化。该方法有助于回答间充质干细胞研究领域中的关键问题，例如，环境信号可诱导产生哪些干预手段以生成具有功能的心肌细胞。该技术的主要优势在于，它采用细胞聚集体形成和心脏胎儿层结构，而非药理学试剂或遗传物质。该技术的应用前景涉及心血管疾病的治疗，因为它进一步阐明了间充质干细胞的心肌生成潜能。与我一同演示该实验的是本实验室的博士生法尔瓦·伊克巴尔（Farwah Iqbal），以及本实验室的两位研究人员马克斯·利布勒（Max Librach）和纳达夫·加斯纳（Nadav Gasner）。根据文本方案分离新生大鼠的心脏组织后，将心室部分切成两半，并转移至含有10毫升PBS的10厘米培养皿中，置于冰上静置，以去除血液。然后使用弯头剪刀将心室壁剪成直径为2至3毫米的小块。用移液管将10到12只动物的心脏组织块转移至一个50毫升离心管中，静置使其沉降。尽可能吸除PBS P/S溶液，注意不要移走任何心脏组织块。然后加入 10 毫米的新鲜 PBS P/S。为了分离心肌细胞，在心脏组织块沉降后，用 PBS 中的 0.15% 胰蛋白酶替换 PBS P/S，并在 37°C 条件下振荡孵育组织 10 分钟。弃去上清液。然后，重复胰蛋白酶消化步骤三次，每次将上清液倾入含有10毫升100% FBS的50毫升收集管中。接着，离心细胞收集管并吸除上清液。然后用含10% FBS和1% P/S的DMEM-F12重悬细胞，并接种至六孔板中。待细胞贴壁后，更换为两毫升新鲜培养基。为制备预染色的间充质干细胞（MSCs），从直径10厘米的培养皿中吸出已达到70%至80%融合度的MSC培养物的培养基，加入三毫升细胞解离液。将培养皿置于37°C、5%二氧化碳条件下孵育五分钟。将解离的细胞转移至15毫升离心管中，在400 x G条件下离心5分钟。吸除上清液，注意不要扰动细胞沉淀，然后重新悬浮细胞。随后使用自动细胞计数仪对细胞进行计数。将细胞用含有10% FBS和1% P/S的DMEM-F12培养基稀释至浓度为每毫升1 × 10⁶个MSCs。然后，在1.5毫升离心管中加入可存活且不可转移的荧光染料，并将MSCs孵育30分钟。在400 × g离心5分钟后，吸除上清液，并将沉淀重悬于培养基中，调整浓度为每毫升1 × 10⁶个MSCs。然后将间充质干细胞以每六孔板孔10×10⁴个细胞的浓度接种到心肌细胞上。为制备聚集体共培养体系，需在含10% FBS和1% P/S的α-MEM中制备间充质干细胞的单细胞悬液。通过在10厘米组织培养皿盖内表面滴加25微升细胞悬液，诱导聚集体形成。将盖子盖在盛有PBS P/S的底部培养皿上，在37摄氏度和5%二氧化碳条件下孵育。在立体显微镜下观察3天后液滴中聚集体的形成情况。如果超过80%的液滴中含有形成的聚集体，则使用1毫升微量移液器从盖子上收集液滴，并将聚集体直接转移至原代大鼠心肌细胞单层上。将聚集体共培养物孵育长达两周，每72小时更换一次全部培养基。每天使用明场显微镜观察类器官在胎体细胞层上的附着情况。观察到收缩的类器官时进行记录。活跃的类器官会同步收缩，我们推测它们之间通过无物理活动的胎体细胞层存在传导。吸去培养基，每孔加入2毫升PBS。然后移除PBS，每孔加入2毫升解离液。将培养板置于37°C、5% CO₂条件下孵育3分钟。如图所示，三种不同类型的HMSC在直接共培养中表现出相似的丰度和形态。在将悬滴转移至心肌细胞进行聚集体共培养后的两到三天，FTM和足月huck PBC形成的细胞聚集体较BMSC形成的更大。本实验中，对未分化MSC的CD49F表达进行流式细胞分析显示，96%的FTM huck PBC、89%的huck PBC以及53%的BMSC为细胞表面CD49F阳性。对TRA赢85细胞进行流式细胞术分析，结果显示在直接心肌细胞共培养的FTM huck PBCs和足月huck PBCs中，心肌细胞相关标志物SIRPA表达上调，而在BMSCs中则无此现象。如图所示，在直接共培养条件下，FTM huck PBCs中cx43的上调水平显著高于足月huck PBCs或BMSCs。荧光显微镜分析表明，处于分化状态的FTM和足月huck PBCs均表现出cx43的上调。与足月儿相比，早产儿的huck PBCs中cx43阳性斑点在细胞膜上所占比例更高。然而，荧光显微镜显示，足月儿huck PBCs中的cx43阳性斑点位于细胞膜，而在早产儿细胞中则主要位于细胞质内。最后，如图所示，在共培养后对分选的人类细胞进行高倍荧光显微镜观察，证实了cx43在细胞质膜上的高丰度表达。一旦掌握，若操作得当，该实验流程的关键步骤每步可在一小时内完成。进行此操作时，必须严格保持无菌操作。所涉及的动物原代组织若处理不当，可能引入污染。完成此操作后，可进一步采用其他方法，例如对收缩性聚集体进行长期培养，以回答更多问题，如这些结构的长期存活能力。该技术建立后，可使间充质干细胞（MSCs）领域的研究人员探索来自更年轻来源的间充质干细胞（如胚外组织）的分化潜能。观看本视频后，您应能够充分掌握如何制备MSC聚集体，并将其与直接分离的原代胎儿组织层相结合，从而为心肌向分化提供适当的诱导环境。请注意，使用BrdU可能存在极高危险性，在进行本实验操作时，必须采取适当的预防措施，例如妥善处理细胞毒性废弃物。

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科研

JoVE Journal

Developmental Biology

发育生物学

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学习利用环境信号诱导人间充质干细胞分化为心肌样细胞的方法，无需药物或基因操作。该技术通过聚集体形成与心脏胎层共培养，为心血管疾病治疗提供新策略。

体外人源间充质干细胞向功能性类心肌细胞的分化

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