在体外人骨髓间充质干细胞分化为心肌样细胞功能
August 9th, 2017
在这里，我们提出一种方法，有效地利用的心肌细胞分化潜力，年轻的人骨髓间充质干细胞的来源以生成功能、 订约、 心肌样细胞体外。
该实验程序的总体目标是诱导和观察间充质干细胞的心肌诱导。这种方法可以帮助回答间充质干细胞领域的关键问题，例如，环境信号可以诱导哪些补救措施来产生功能性心肌细胞。这种技术的主要优点是它应用聚集体形成和心脏胎儿层，而不是药物或遗传物质。
这项技术的影响延伸到心血管疾病的治疗，因为它详细阐述了间充质干细胞的心肌潜力。与我一起演示该程序的是我们实验室的博士生 Farwah Iqbal 小姐、我们实验室的实习生 Max Librach 和 Nadav Gasner。根据文本方案分离大鼠幼崽部分后，将脑室切成两半，并将它们转移到一个 10 厘米长的培养皿中，加入 10 毫升 PBS 和冰上的细条纹，让血液洗掉。
然后用弯曲的剪刀将心室壁切成直径为 2 到 3 毫米的小块。使用血清移液管，将 10 至 12 只动物的心脏块转移到 50 毫升试管中，让它们沉淀。尽可能多地去除 PBS P/S，不要去除任何心脏碎片。
然后加入 10 毫米新鲜的 PBS P/S。为了分离心肌细胞，在心脏碎片沉淀后，使用 PBS 中的 0.15% 胰蛋白酶代替 PBS P/S，并在 37 摄氏度下摇动孵育组织 10 分钟。丢弃上清液。
然后，再重复胰蛋白酶消化 3 次，除了将上清液倒入含有 10 毫升 100% FBS 的 50 毫升收集管中。接下来，离心细胞管并吸出上清液。然后使用含 10% FBS 和 1%P/S 的 DMEM-F12 重悬细胞并将它们接种到六孔板上。
细胞附着后，用 2 mL 新鲜培养基替换培养基。为了制备预染的 MSC，从 10 厘米培养皿中已达到 70% 至 80% 汇合的 MSC 培养物中去除培养基，并加入 3 毫升细胞解离溶液。将培养皿在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳下孵育 5 分钟。
将解离的细胞转移至 15 mL 试管中，并以 400 x G 离心 5 分钟。吸出上清液而不破坏细胞沉淀并重新悬浮细胞。然后使用自动细胞计数仪对细胞进行计数。
在含有 10% FBS 和 1%P/S 的 DMEM-F12 中，将细胞稀释至每毫升 1 x 10 至第六个 MSC 的浓度。然后，向 1.5 mL离心管中的细胞中，加入活的、不可转移的荧光染料，并将MSC孵育半小时。以 400 x G 离心试管 5 分钟后，吸出上清液，并以 1 x 10 的浓度重悬沉淀至每毫升第六个 MSC。
然后将 MSC 以 10 x 10 的浓度转移到心肌细胞上，转移到 6 孔板中每孔的第四个细胞中。为了进行聚集体共培养物，在 α MEM 中制备 MSC 的单细胞悬液，补充有 10% FBS 和 1%P/S。通过将 25 微升细胞悬液滴在 10 厘米组织培养皿的盖子内表面来启动聚集体形成。
将盖子放在含有 PBS P/S 的底部上。在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳下孵育培养皿。在立体显微镜下，观察三天后液滴中的聚集体形成。
如果超过 80% 的液滴含有形成的聚集体，请使用 1 毫升微量移液器从盖子收集液滴，并将聚集体直接转移到原代大鼠心肌细胞单层上。将聚集体共培养物孵育长达两周。每 72 小时更换一次介质的全部体积。
每天使用明场显微镜观察附着在胎儿细胞层上的聚集体。在观察到时记录合同聚合。活性聚集体以同步方式收缩，我们建议它们在整个胎儿层之间保持电导，没有物理活动。
吸出培养基，并在 6 孔培养皿中每孔加入 2 毫升 PBS。然后去除 PBS 并在每孔中加入 2 毫升解离溶液。将培养皿在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳下孵育 3 分钟。
如图所示，三种不同类型的 HMSC 在直接共培养中表现出相似的丰度和外观。在聚集体共培养物中将悬滴转移到心肌细胞上后 2 到 3 天，与 BMSC 相比，FTM 和足月哈克 PBC 出现在更大的聚集体中。在本实验中，未分化 MSC 中 CD49F 表达的流式细胞术分析显示，96% 的 FTM huck PBC，称为 89% 的 huck PBCs 和 53% 的 BMSC，细胞表面 CD49F 呈阳性。
TRA 上的流式细胞术赢得了 85 个细胞，显示心肌细胞相关标志物 SIRPA 在 FTM huck PBCs 和足月哈克 PBC 中上调，但在来自直接心肌细胞共培养物的 BMSCs 中未上调。如图所示，与直接共培养中的术语 huck PBC 或 BMSCs 相比，FTM huck PBCs 中的 cx43 上调显着升高。荧光显微镜分析显示，区分 FTM 和 term huck PBCs 均上调 cx43。
足月哈克 PBC 的比例高于 FTM。然而，荧光显微镜显示，在 FTM huck PBCs 的细胞膜中观察到 cx43 阳性点，并且它们主要存在于足月细胞中的细胞质中。最后，如图所示，共培养后对分选的人类细胞进行高倍率荧光显微镜检查，并确认质膜中 cx43 的高丰度。
一旦掌握，如果执行得当，该程序的关键步骤可以在一小时内完成。尝试此程序时，保持无菌预防措施很重要。涉及的原代动物组织，如果处理不当，可能会造成污染。
按照此程序，可以执行其他方法，例如进一步培养收缩聚集体，以回答其他问题，例如这些结构的寿命。开发后，该技术使 MSC 领域的研究人员能够探索间充质干细胞的年轻来源（例如胚胎外组织）的分化潜力。观看本视频后，您应该对如何制备 MSC 聚集体并将其与直接初级组织胎儿层相结合，从而为心肌生成性分化提供适当的诱导。
不要忘记，使用 BRDU 可能非常危险，在执行此程序时应始终采取预防措施，例如正确处理细胞毒性废物。
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概述
本文介绍了一种诱导间充质干细胞心肌发生分化的方法，重点是在体外生成功能性心肌细胞样细胞。该技术强调使用环境信号而非药理学手段或基因操作。
关键研究组成部分
科学领域
- 心肌发生分化
- 间充质干细胞
- 心血管疾病治疗
背景
- 间充质干细胞具有心脏修复潜力。
- 了解环境信号可以增强心肌细胞的生成。
- 当前的方法通常依赖于药理学或基因学方法。
- 本研究探索了一种使用集合形成的新技术。
研究目的
- 诱导间充质干细胞心肌发生分化。
- 研究环境信号对干细胞分化的影响。
- 为心血管疾病的潜在治疗提供见解。
使用的方法
- 大鼠幼仔心脏组织的分离。
- 心室组织的实验准备。
- 应用环境信号以诱导分化。
- 观察心肌细胞样细胞的形成。
主要结果
- 成功从间充质干细胞中诱导心肌细胞样细胞。
- 证明了环境信号在分化中的作用。
- 对心血管疾病治疗的潜在影响。
- 与实验室学员合作进行实践演示。
结论
- 该方法为传统分化技术提供了一种可行的替代方案。
- 研究结果有助于理解干细胞生物学。
- 未来的研究可能扩展到心脏病的治疗应用。
常见问题
Executive Industry Relevance
Cardiomyogenic differentiation of human mesenchymal stem cells (MSCs) addresses a critical bottleneck in regenerative cardiac research by enabling the generation of functional cardiomyocyte-like cells in vitro. This aggregate-based, feeder layer-driven protocol provides a physiologically relevant alternative to pharmacological or genetic induction, supporting predictive confidence in early-stage target validation. The approach enhances translational continuity for cell therapy pipelines targeting myocardial repair and heart failure.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of MSC cardiomyogenic potential using physiologically relevant environmental cues.
- Supports functional target validation by quantifying expression of cardiomyocyte markers and contractile behavior.
- Facilitates mechanistic de-risking by comparing differentiation efficiency across MSC sources.
- Provides a platform for hypothesis-driven evaluation of cell source immunogenicity and regenerative potential.
Screening & Assay Development
- Establishes validated co-culture systems for reproducible assessment of MSC differentiation.
- Delivers quantitative outputs via flow cytometry and fluorescence microscopy for marker expression.
- Enables screening of MSC sources for aggregate formation and contractile cluster generation.
- Supports assay standardization for downstream compound or genetic modulator evaluation.
Translational & Preclinical Research
- Aligns in vitro differentiation with disease-relevant cardiac phenotypes for translational biomarker development.
- Provides continuity from discovery to preclinical validation by enabling functional assessment of MSC-derived cardiomyocytes.
- Reduces translational risk by demonstrating immunoprivileged properties of early-stage MSC sources.
- Supports risk-adjusted advancement of cell therapy candidates for cardiac repair.
Pipeline & Workflow Integration
This aggregate-based differentiation protocol integrates into the discovery-to-preclinical continuum, enabling early functional screening and mechanistic de-risking of MSC sources for cardiac applications.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on MSC differentiation capacity and immunogenicity.
- Screening: Provides reproducible, quantitative readouts for comparing MSC sources and differentiation efficiency.
- Analytics: Utilizes flow cytometry and microscopy to deliver marker-based and functional outputs for decision-making.
- Translational Research: Bridges in vitro findings to preclinical models by demonstrating contractile function and immunological properties.
- Enterprise Reuse: Offers a standardized, scalable protocol adaptable to various MSC sources and cardiac research programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in MSC-based cardiac repair strategies and reduces mechanistic ambiguity.
- Operational Value: Enhances reproducibility and standardization of differentiation assays across teams.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions for cell therapy candidates and optimizes resource allocation.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of MSC sources and differentiation protocols for advancement.
Implementation Considerations
- Requires expertise in stem cell culture, aggregate formation, and co-culture techniques.
- Demands access to flow cytometry, fluorescence microscopy, and primary cardiac tissue preparation infrastructure.
- Necessitates rigorous aseptic technique and cross-team standardization to minimize contamination risk.
- Adaptation may be needed for different MSC sources or cardiac feeder layers.
- Handling of cytotoxic reagents (e.g., BRDU) and animal tissues requires strict safety protocols.
