异基因富血小板血浆（PRP）对大鼠离断跟腱愈合过程的影响：方法学描述

本实验的总体目标是观察单次注射富血小板血浆（PRP）对不同时间点大鼠手术切断的跟腱抵抗能力及愈合过程的影响。该方法有助于快速解答肌肉骨骼领域关于肌腱损伤的相关问题。该技术的主要优势在于手术操作、生物力学检测以及PRP处理流程均已实现良好的标准化。

这些技术的应用前景可延伸至人类中血小板富集 plasma（PRP）的使用，因为大鼠与人类的此类损伤类型及肌腱愈合过程相似。尽管该方法可为肌肉骨骼损伤的PRP制备提供参考，但此注射技术也可应用于其他系统，如心脏或皮肤疾病。该方法的可视化演示极为重要，因为手术和生物力学操作步骤必须具备高度的一致性和可重复性，才能获得最佳结果。

首先对大鼠进行称重并佩戴耳标。通过脚趾夹捏确认麻醉程度适当后，向动物角膜滴加水滴，并去除左侧后肢的毛发。用1:10稀释的等渗聚维酮碘溶液对暴露的皮肤进行消毒，然后将动物置于解剖显微镜下，侧卧位放置在温度为20摄氏度的加热垫上，使左侧后肢处于上方位置。

用镊子夹住左后肢足掌，于跟腱周围做一长度为20至25毫米的侧方皮肤切口。使用精细剪刀分离筋膜，暴露跟腱复合体，并切除趾长屈肌腱。在跟腱止点近端5毫米处横向切断跟腱，并切除一段长约5毫米的跟腱组织。

然后使用可吸收缝线继续缝合筋膜和皮肤，并将大鼠置于热源下监测直至完全恢复。在受体动物恢复的同时，从每只实验动物对应的单个供体大鼠心脏采集20毫升全血，分别收集到含有3.2%缓冲柠檬酸钠的试管中。为获得富血小板血浆，将血液离心，并用塑料移液管小心吸取上层含PRP的组分至第二个塑料试管中。

确定采集的PRP体积，并使用血液学分析仪测量血小板计数。再次离心PRP，小心地将上清液转移至新的塑料管中。PRP管中剩余的体积应约为达到每微升2.5 × 10⁶个血小板所需体积的2/3。

接下来，用移液器轻轻重悬血小板沉淀。测定此浓缩富血小板血浆的血小板计数，必要时加入适量自体乏血小板血浆，以达到目标浓度。在室温下，每毫升PRP加入50 µL氯化钙激活血小板，作用约1小时。

然后将血小板加载到一支配有21号针头的1毫升注射器中，将50微升血小板直接注射至每只动物的缝合部位。在适当的实验终点，剃除麻醉实验动物的左后肢毛发，并如刚才所示将大鼠置于解剖显微镜下。用手固定足部，在手术部位做一处10毫米的切口，以暴露腓肠肌三头肌。

为去除跟腱，需在跟骨附着点远端5至10毫米处横向切断跟骨，并切取足够大的一块腓肠肌复合体组织，以适配冷冻夹具的上钳口。使用镊子立即将样本放入冷冻夹具的上钳口中，并闭合仪器。将冷冻夹具垂直置于万能试验机中，并将跟骨固定在下部夹具之间。

为计算横截面积，需将相机相互垂直放置。向上下颌盆中加入液氮，使肌肉冻结至比肌腱刚性高一个数量级的程度，从而在拉伸测试过程中不发生变形。当冻结区域到达金属夹具边缘时，将机器的位移速率设定为每秒一毫米的恒定速度，直至样品断裂，并开始拉伸测试，同时使用计算机记录以牛顿为单位的最大抗拉强度。

为了消除愈合肌腱横截面积差异的影响，需将最大抗拉强度归一化为单位面积，以反映组织所承受的机械应力。当肌腱发生断裂后，立即将断裂的肌腱样本用液氮速冻，并于-80°C保存，直至进行RNA提取和RT-PCR分析。在此项代表性实验中，在各个检测时间点，与对照组（生理盐水处理组）相比，PRP注射组需要更大的力才能诱导肌腱断裂，提示PRP处理动物的肌腱愈合过程更为充分或具有更优的力学性能。

尽管PRP组的组内离散程度高于生理盐水组，但在损伤诱导后第15天和第30天，PRP注射组的肌腱横截面积被确定为更大。此外，Masson三色染色显示，在注射后第5天和第15天，PRP治疗组动物的肌腱中纤维状胶原（肌腱形态和强度的关键组分）含量更高；到注射后第30天，两组间的染色强度相似。观看本视频后，您应能够充分掌握如何诱导大鼠标准损伤，以及如何取样肌腱以评估PRP注射后的愈合过程。