Laboratory Techniques Used to Maintain and Differentiate Biotypes of Vibrio cholerae Clinical and Environmental Isolates

该技术的总体目标是提供一系列易于执行的方案，可以帮助任何研究人员表征霍乱弧菌的给定临床或环境分离株。这种方法可以帮助回答细菌学领域的关键问题，例如任何霍乱弧菌分离株的特定基因型和表型特征，尤其是那些具有临床相关性的问题。该技术的主要优点是它允许任何研究人员使用这一系列分析来可靠地表征和区分临床或环境霍乱弧菌分离株。

总之，这些检测提供了一种系统的方法，可用作昂贵的劳动密集型实验和霍乱弧菌临床和环境分离株表征的替代或补充。虽然这种方法可以深入了解霍乱弧菌生物型的表征，但它也可以应用于表征其他肠道细菌的生化和代谢能力。通常，刚接触这种方法的人会努力进行时间管理，因为确保最佳结果所需的孵育时间在生化测定之间有所不同。

点样和刺穿方案的目视演示至关重要，因为飞溅通常会导致交叉污染，并且需要最大间距以防止培养物之间的融合。首先，在无菌 2 mL 微量离心管中以至少 8， 600 xG 的离心速度离心 1.8 mL 液体过夜培养物 2 分钟，从而沉淀 1.8 mL 液体过夜培养物 2 分钟。离心后，去除上清液，并通过移液将细胞沉淀重悬于 900 mcL 新鲜 Luria-Bertani 或 LB 肉汤中。

接下来，向培养物中加入 900 mcL 无菌 60% 体积比甘油，涡旋混合。将混合物转移到无菌的 2 mL 低温管中，并将原液培养物储存在 80 摄氏度。要使用原液，使用无菌接种环，去除少量冷冻原液并划线细菌，以在 LB 琼脂平板上获得单个菌落。

使用后立即将冷冻原液放回 80 摄氏度，以防止培养物完全解冻。将板盖朝下在 37 摄氏度下孵育 12-16 小时。获得先前准备好的板。

用消毒的定量环接触单个菌落的表面，然后将菌落转移到液体肉汤中，将 4 mL 液体 LB 肉汤接种到带有单个菌落的无菌 10 mL 培养管中。然后，将培养物在摇床培养箱中以 225 rpm 的速度在 37 摄氏度下发酵 12-16 小时。在液体 LB 肉汤中准备过夜培养物。

第二天，将细胞沉淀重悬于 1.8 mL 1x 磷酸盐缓冲盐水或 PBS 中，使培养物沉淀并洗涤细胞。重复洗涤程序 3 次。第三次洗涤后，最后重悬于 1.8 mL 1x PBS 中。

然后，使用移液器吸头在相应的培养基上点样 1 mcL 洗涤的培养物。洗涤从过夜培养中获得的细胞沉淀。通过将接种刺插入洗涤的液体培养物中并垂直刺入培养基中来接种运动琼脂平板。

确保在刺入琼脂时接种刺不会弯曲。在每次接种之间，使用本生灯对金属丝刺进行消毒。将板盖朝上在 37 摄氏度下孵育 14-24 小时。

14 小时后，密切监测运动板以防止培养物过度生长。将 10 mcL 先前制备的过夜培养物移液到 4 mL 无菌培养管中的 MR-VP 肉汤中，并在摇床培养箱中以 225 rpm 的转速在摇床培养箱中以 225 rpm 的转速通气孵育 12-16 小时，接种 37 mL 甲基红 Voges-Proskauer 或 MR-VP 肉汤。接下来，将 150 mcL 每体积重量为 5% 的 α-萘酚和 50 mcL 每体积重量为 40% 的氢氧化钾分别加入 1 mL 等分试样的 MR-VP 过夜培养物中无菌培养管中。

然后，短暂涡旋试管。让试管在室温下静置长达 4 小时，直到出现颜色变化。在 PCR 基础遗传筛选和表型测定中包括生物型参考菌株和代表性 El Tor 变体，以区分霍乱弧菌临床和环境分离株的生物型背景。

野生型经典 O395 展示了经典的 ctxB 和 tcpA 序列。相反，野生型 El Tor 菌株 N16961 和 C6706 表现出 El Tor ctxB 和 tcpA 序列。MQ1795 和 BAA-2163 包含与 0395 相当的经典生物型 ctxB 亚基。

然而，两种 El Tor 变体都包含指示 El Tor 生物型背景的 tcpA。当在补充多粘菌素 B 的 LB 琼脂平板上生长时，野生型经典生物型菌株 0395 对多粘菌素 B 表现出敏感性，而野生型 El Tor 生物型菌株表现出耐药性。代表性的 El Tor 变体菌株对抗生素表现出类似的耐药性。

观看此视频后，您应该对如何使用本手稿中概述的多重检测鉴定系统区分霍乱弧菌生物型有很好的了解。不要忘记，与 BSL-2 病原体一起工作可能非常危险，必须根据机构、地方、州和联邦法规对所有材料和废物进行适当的处理和处置。除了本手稿中列出的协议外，还可以通过研究其他表型特性（如生物膜形成和自凝集）来实现霍乱弧菌分离株的进一步表征。