用于维持和区分霍乱弧菌生物型的实验室技术 霍乱弧菌 临床与环境分离株

该技术的总体目标是提供一套操作简便的实验方案，帮助研究人员对任意霍乱弧菌的临床或环境分离株进行表征。该方法有助于解答细菌学领域的关键问题，例如任何霍乱弧菌分离株特有的基因型和表型特征，尤其是具有临床意义的分离株。该技术的主要优势在于，可使研究人员利用这一系列检测方法，可靠地对临床或环境来源的霍乱弧菌分离株进行表征和区分。

这些实验方法共同提供了一种系统性的策略，可作为替代方案或补充手段，用于取代成本高昂且劳动密集型的实验，以完成对霍乱弧菌临床及环境分离株的鉴定。尽管该方法有助于霍乱弧菌生物型的鉴定，但也同样适用于表征其他肠道细菌的生化与代谢能力。通常，初次使用该方法的研究人员在时间管理方面会遇到困难，因为不同的生化实验所需的孵育时间各不相同，为确保最佳结果必须精确控制。

点种和穿刺操作的可视化演示至关重要，因为飞溅常常会导致交叉污染，且需要最大程度的间距以防止不同培养物之间融合。首先，在无菌的 2 mL 微量离心管中，取 1.8 mL 过夜液体培养物，以至少 8,600 ×g 的离心力离心 2 分钟，使菌体沉淀。离心后，弃去上清液，用移液器将菌体沉淀重悬于 900 µL 新鲜的 LB 培养基（Luria-Bertani 培养基）中。

接下来，向培养物中加入 900 µL 无菌的 60%（体积比）甘油溶液，通过涡旋振荡混匀。将混合液转移至无菌的 2 mL 冻存管中，并将菌种保存于 -80 °C。使用时，用无菌接种环取少量冷冻菌种，在 LB 琼脂平板上划线以获得单菌落。

使用后立即将冻存菌种放回-80摄氏度，以防止菌种完全融化。将平板倒置培养，在37摄氏度下孵育12-16小时。取预先准备好的平板。

用无菌接种环接触单个菌落表面，将菌落转移至装有4 mL液体LB培养基的无菌10 mL培养管中进行接种。随后，在37摄氏度条件下，于摇床培养箱中以225 rpm振荡培养12–16小时。在液体LB培养基中制备过夜培养物。

第二天，离心收集菌体，用1.8 mL 1×磷酸盐缓冲液（PBS）重悬细胞沉淀以洗涤细胞。重复洗涤步骤三次。第三次洗涤后，最终用1.8 mL 1× PBS重悬细胞沉淀。

然后，使用移液器吸头将1 µL洗涤后的菌液点样至相应的培养基上。收集过夜培养物的菌体沉淀并进行洗涤。将接种环插入洗涤后的液体培养物中，然后垂直穿刺接种至动力琼脂平板中。

接种穿刺时应确保接种针不发生弯曲。每次接种之间，需使用本生灯对接种针进行灼烧灭菌。将平板倒置（皿盖朝上），于37摄氏度培养14至24小时。

14 小时后，密切观察运动性平板，以防止菌液过度生长。用移液器将 10 µL 前一天制备的过夜培养物加入到无菌培养管中含 4 mL 甲基红-伏格斯-普劳瑟（Methyl Red Voges-Proskauer，MR-VP）肉汤的培养基中，接种 4 mL MR-VP 肉汤。在 37 摄氏度、225 rpm 条件下，于摇床培养箱中振荡培养 12–16 小时。随后，分别向无菌培养管中 MR-VP 过夜培养物的 1 mL 等分试样中加入 150 µL 5%（质量/体积）的 α-萘酚溶液和 50 µL 40%（质量/体积）的氢氧化钾溶液。

然后，短暂涡旋混匀各管。将试管置于室温下静置，最长不超过四小时，直至颜色发生变化。在基于PCR的基因筛查和表型检测中，包含了生物型参考菌株及代表性埃尔托变异株，以区分霍乱弧菌临床和环境分离株的不同生物型背景。

野生型古典生物型O395表现出古典型的ctxB和tcpA序列。相反，野生型埃尔托生物型菌株N16961和C6706表现出埃尔托型的ctxB和tcpA序列。MQ1795和BAA-2163含有与O395相似的古典生物型ctxB亚基。

然而，两种埃尔托变体均含有提示埃尔托生物型背景的 tcpA 基因。在添加多粘菌素 B 的 LB 琼脂平板上培养时，野生型古典生物型菌株 0395 对多粘菌素 B 敏感，而野生型埃尔托生物型菌株则表现出抗性。代表性埃尔托变体菌株对这种抗生素也表现出类似的抗性。

观看本视频后，您应能充分理解如何利用本文所述的多重检测鉴定系统来区分霍乱弧菌的不同生物型。请注意，操作生物安全二级（BSL-2）病原体具有极高危险性，必须严格遵守机构、地方、州及联邦法规，对所有材料和废弃物进行规范处理与处置。除本文列出的实验方案外，还可通过研究其他表型特性（如生物膜形成和自凝集作用）进一步表征霍乱弧菌分离株。