Name: 用于维持和区分生物型的实验室技术霍乱弧菌临床和环境隔离 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 58 s
Description: 了解用于区分霍乱弧菌临床株与环境株的生化检测方法。该技术通过系统性的表型分析方案，为细菌学研究提供可靠且经济的替代方案，帮助研究人员快速鉴定菌株特性并评估其临床相关性。

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本研究由美国国立卫生研究院普通医学科学研究所通过机构发展奖（IDeA）项目New Hampshire-INBRE提供资助，项目编号P20GM103506。

注意：由于不同培养基的制备所需时间各异，每项实验的时间安排需分别考虑。例如，固体琼脂平板培养基应充分冷却并干燥（1–2天）。其他时间相关因素（即 单菌落和过夜培养生长）在每个方案下均有具体说明，并见于 表 2.
1. 培养基的制备
<ol>
	<li>1× 磷酸盐缓冲液（PBS）
	<ol>
		<li>称取 4.0 g NaCl、0.1 g KCl、0.72 g Na2HPO4 和 0.12 g KH2PO4。将上述成分加入 1 L 锥形瓶中，用去离子水定容至 500 mL，使用 pH 计并逐滴加入 HCl 将 pH 调至 7.2，然后通过高压灭菌或使用 0.22 µm 滤膜过滤除菌。1× PBS 可在室温下长期保存。 
		注意：HCl 为浓酸，应根据机构、地方、州及联邦法规进行操作。有关适当的处理指南，请参阅制造商提供的安全数据表。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>LB（Luria-Bertani）液体培养基
	<ol>
		<li>称取 5.0 g 胰蛋白胨、2.5 g 酵母提取物和 2.5 g NaCl。将上述成分加入 1 L 瓶中，用去离子水定容至 500 mL，高压灭菌后于室温保存，最长可保存 6 个月。若需诱导古典生物型毒力，应在高压灭菌前用 HCl 将 pH 调至 6.5。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>含 0.03%（w/v）NaHCO3 的 AKI 培养基
	<ol>
		<li>成分 1（AKI 培养基）：称取 7.5 g 蛋白胨、2.0 g 酵母提取物和 2.5 g NaCl。将上述成分加入 1 L 瓶中，用去离子水定容至 450 mL，高压灭菌。AKI 培养基可在室温下保存最长 6 个月。</li>
		<li>成分 2（NaHCO3）：称取 1.5 g NaHCO3，在无菌容器中用去离子水定容至 50 mL。使用 0.22 µm 滤膜对 NaHCO3 进行过滤除菌。NaHCO3 必须在使用前立即配制。</li>
		<li>使用前，通过将成分 2 过滤至成分 1 中，以 1:10 的比例无菌混合两种成分。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>LB（Luria-Bertani）琼脂平板
	<ol>
		<li>称取 5.0 g 胰蛋白胨、2.5 g 酵母提取物、2.5 g NaCl 和 7.5 g 琼脂。将上述成分加入 1 L 锥形瓶中，用去离子水定容至 500 mL，高压灭菌后倒入标准尺寸（100 mm × 15 mm）无菌培养皿中。制备好的平板可用塑料包裹，于 4 °C 正置保存最长 6 个月。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>添加多粘菌素 B 的 LB 琼脂平板
	<ol>
		<li>成分 1（LB 琼脂）：称取 5.0 g 胰蛋白胨、2.5 g 酵母提取物、2.5 g NaCl 和 7.5 g 琼脂。将上述成分加入 1 L 锥形瓶中，用去离子水定容至 500 mL，高压灭菌。</li>
		<li>成分 2（多粘菌素 B）：在无菌 2 mL 微量离心管中，将多粘菌素 B 溶于去离子水中，配制成浓度为 50,000 IU/µL 的溶液，并使用 0.22 µm 滤膜过滤除菌。</li>
		<li>待成分 1 冷却至手触不烫但尚未凝固时，无菌加入 500 µL 成分 2，使终浓度为 50 IU/µL，并充分混匀。将混合后的琼脂培养基倒入标准尺寸（100 mm × 15 mm）无菌培养皿中。制备好的平板可用塑料包裹，于 4 °C 正置保存最长 3 个月。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>最小柠檬酸盐培养基琼脂平板
	<ol>
		<li>成分 1（含溴百里酚蓝的琼脂）：称取 7.5 g 琼脂和 0.02 g 溴百里酚蓝。将上述成分加入 1 L 锥形瓶中，用去离子水定容至 450 mL，高压灭菌。</li>
		<li>成分 2（10× VBMM）：称取 1.0 g MgSO4·7H2O、10.0 g 柠檬酸·H2O、50.0 g 无水 K2HPO4 和 17.5 g NaNH4HPO4·4H2O。将上述成分加入 1 L 锥形瓶中，用去离子水定容至 500 mL，高压灭菌或使用 0.22 µm 滤膜过滤除菌。10× VBMM 可在室温下保存最长 6 个月。</li>
		<li>将 50 mL 成分 2 加入成分 1 中，混匀后倒入标准尺寸（100 mm × 15 mm）无菌培养皿中。制备好的平板可用塑料包裹，于 4 °C 正置保存最长 6 个月。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>脱脂乳琼脂平板
	<ol>
		<li>成分 1（脱脂乳）：在 1 L 锥形瓶中称取 8.0 g 即溶脱脂奶粉，用去离子水定容至 200 mL，高压灭菌。</li>
		<li>成分 2（含脑心浸液的琼脂）：称取 3.68 g 脑心浸液和 6.0 g 琼脂。将上述成分加入 500 mL 锥形瓶中，用去离子水定容至 200 mL，高压灭菌。</li>
		<li>高压灭菌后，将成分 2 倒入成分 1 中，充分混匀。将混合物倒入 150 mm × 15 mm 无菌培养皿中。脱脂乳平板可用塑料包裹，于 4 °C 倒置保存最长一周。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>运动性琼脂平板
	<ol>
		<li>成分 1（LB 琼脂）：称取 5.0 g 胰蛋白胨、2.5 g 酵母提取物、2.5 g NaCl 和 2.0 g 琼脂。将上述成分加入 1 L 锥形瓶中，用去离子水定容至 500 mL，高压灭菌。</li>
		<li>成分 2（1%（w/v）三苯基四氮唑氯化物；TTC）：称取 0.25 g TTC，在无菌容器中用去离子水定容至 25 mL，使用 0.22 µm 滤膜过滤除菌。避光包裹铝箔，于室温保存最长 6 个月，以减少光照影响。</li>
		<li>向高压灭菌后的培养基中加入 2.5 mL 1%（w/v）无菌 TTC 溶液。</li>
		<li>将培养基尽可能厚地倒入大尺寸（150 mm × 15 mm）无菌培养皿中（每板 ≥50 mL）。制备好的平板可用塑料包裹，于 4 °C 正置保存最长一周。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Voges-Proskauer（VP）试验试剂
	<ol>
		<li>成分 1（甲基红–Voges-Proskauer 肉汤；MR–VP）：在 500 mL 锥形瓶中称取 1.7 g MR-VP 培养基，用去离子水定容至 100 mL，高压灭菌。灭菌后的 MR-VP 肉汤可在室温下保存最长 6 个月。</li>
		<li>成分 2（5%（w/v）α-萘酚）：在无菌容器中称取 1.0 g α-萘酚，用 95% 乙醇定容至 20 mL。避光包裹铝箔，于室温保存最长 1 周，以减少光照影响。</li>
		<li>成分 3（40%（w/v）氢氧化钾；KOH）：在无菌容器中称取 20.0 g KOH，用无菌去离子水定容至 50 mL。KOH 溶液可在室温下塑料容器中保存最长 6 个月。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. V. cholerae 菌株的维持与培养
<ol>
	<li>冻存菌种的制备与使用
	<ol>
		<li>取1.8 mL过夜培养的液体培养物，在无菌的2 mL微量离心管中，以离心力≥8,600 × g离心2分钟，弃上清液，用移液器将菌体沉淀重悬于900 µL新鲜LB液体培养基中。</li>
		<li>向培养物中加入900 µL无菌的60%（v/v）甘油，涡旋混匀。</li>
		<li>将混合液转移至无菌的2 mL冻存管中，于-80 °C长期保存。</li>
		<li>使用时，用无菌接种环取少量冻存菌液，在LB琼脂平板上划线以获得单菌落。使用后立即将冻存菌液放回-80 °C，防止完全融化。将平板倒置，于37 °C培养12至16小时。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>液体培养基中过夜培养物的生长
	<ol>
		<li>从冻存菌种中（按第2.1.4节方法）在LB琼脂平板上划线获得单菌落。将平板倒置，于37 °C培养12至16小时。</li>
		<li>用无菌涂布棒接触单菌落表面，将菌落转移至含4 mL液体LB培养基的无菌10 mL培养管中，接种单菌落。</li>
		<li>在摇床培养箱中，于37 °C、225 rpm条件下振荡培养12至16小时。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>生长曲线测定
	<ol>
		<li>按照前述2.2节方法，在液体LB培养基中制备过夜培养物。</li>
		<li>将250 µL过夜培养物转移至25 mL新鲜LB液体培养基（置于无菌250 mL锥形瓶中），制备1:100稀释的培养物。</li>
		<li>从接种时刻（T0）开始，每隔一小时测定一次液体培养物在600 nm处的光密度（OD600）。</li>
		<li>将1:100稀释的过夜培养物置于摇床培养箱中，于37 °C、225 rpm条件下振荡培养，最长持续30小时，或直至培养物达到最大密度。</li>
		<li>绘制OD600随时间变化的曲线，采用线性回归法计算各菌株的近似倍增时间。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>埃尔托生物型毒力诱导条件
	<ol>
		<li>从冻存菌种中在LB琼脂平板上划线获得单菌落。将平板倒置，于37 °C培养12至16小时。</li>
		<li>用单菌落接种含0.03%（w/v）NaHCO3的10 mL AKI培养基。</li>
		<li>于37 °C静置培养3.5小时（不振荡）。</li>
		<li>取出7 mL培养物，将剩余3 mL培养物在摇床培养箱中，于37 °C、225 rpm条件下振荡培养额外4小时。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>古典生物型毒力诱导条件
	<ol>
		<li>从冻存菌种中在LB琼脂平板上划线获得单菌落。将平板倒置，于37 °C培养12至16小时。</li>
		<li>用单菌落接种4 mL pH为6.5的液体LB培养基。</li>
		<li>在摇床培养箱中，于30 °C、225 rpm条件下振荡培养12至16小时。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用1×PBS洗涤菌体沉淀
	<ol>
		<li>取1.8 mL过夜培养物，在无菌2 mL微量离心管中以离心力≥8,600 × g离心2分钟，用移液器吸除上清液，再用移液器将菌体沉淀重悬于1.8 mL 1×PBS中。</li>
		<li>重复洗涤步骤三次，最后将菌体重悬于1.8 mL 1×PBS中。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 表征V. cholerae 生物型
<ol>
	<li>基于PCR的基因筛查使用 ctxB 和 tcpA 
	<ol>
		<li>设计一组引物，使其分别在翻译起始位点和终止位点的上游和下游约50-70 bp处退火 ctxB 和 tcpA分别。</li>
		<li>按照第2.2节所述，于液体LB肉汤中制备过夜培养物。</li>
		<li>使用专为革兰氏阴性菌设计的市售试剂盒提取染色体DNA。纯化的染色体DNA可在-20℃长期保存 &#176;C. 使用市售试剂盒分离染色体DNA通常需要约4小时。</li>
		<li>使用微量分光光度计检测染色体DNA样本，确保其具有高质量（A260/280 &#62;1.8).</li>
		<li>对于每个染色体DNA样本，在冰上用无菌200 μL离心管准备聚合酶链式反应（PCR） &#956;L PCR管并扩增特定区域 ctxB 和 tcpA 使用标准的PCR组分： Taq 聚合酶和缓冲液（或等效产品）、dNTP 溶液以及上下游引物。采用标准 PCR 参数（约 3 小时）。例如，使用以下程序：
		<ol>
			<li>初始变性：95℃ &#176;C，120 秒。</li>
			<li>95℃ 变性 &#176;60 秒，C</li>
			<li>在 60 ℃ 下退火引物 &#176;C，45 秒。</li>
			<li>72℃ 延伸 &#176;90 秒，温度为 C</li>
			<li>重复步骤 3.1.5.2 至 3.1.5.4，共 34 个循环。</li>
			<li>终末延伸 72 &#176;C，600 秒。</li>
			<li>4 ℃ 无限期保存 &#176;C.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>染料 5 &#956;使用标准的6x DNA凝胶上样染料混合相应PCR产物的L，并上样约10 &#956;1 千碱基对 ladders 和 10 &#956;将1 μL PCR产物上样至含1×Tris-硼酸-EDTA（TBE）缓冲液的1%琼脂糖凝胶中。</li>
		<li>以130 V电压进行凝胶电泳，直至染料前沿到达凝胶末端但未跑出（约90分钟）。由于电压和电泳时间可能因设备而异，建议持续监测。</li>
		<li>在确认PCR扩增产物达到预期大小后，纯化剩余的45 μL反应产物。 &#956;L PCR产物，使用市售DNA纯化试剂盒 &amp;#38; 浓缩试剂盒</li>
		<li>使用PCR扩增所用的相同引物对PCR产物进行测序前纯化，并根据本地测序机构的指南进行准备。</li>
		<li>将每个分离株的基因序列FASTA格式与NCBI网站（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/）上公布的序列进行比对，方法是在搜索框中输入以下登录号进行查询。</li>
		<li>ctxB：（古典生物型）VC0395_A1059 与 VC0395_A1060 之间区域（埃尔托生物型）VC_1456</li>
		<li>tcpA：（古典生物型）VC0395_A0353（埃尔托生物型）VC_0828</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用于通过点种法进行生物型分类的表型检测
	<ol>
		<li>按照第2.2节所述，制备LB液体培养基过夜培养物。</li>
		<li>按照方案 2.6 中的规定洗涤细胞沉淀。</li>
		<li>使用移液器点样 1 &#956;相应培养基上接种1 L洗涤后的菌液。培养基选择及培养条件详见表2。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>运动性检测
	<ol>
		<li>按照第2.2节所述，制备LB液体培养基中的过夜培养物。</li>
		<li>按照方案 2.6 中的规定洗涤细胞沉淀。</li>
		<li>通过将接种针插入经洗涤的液体培养物中，接种于运动性琼脂平板 &#34;穿刺接种&#34; 垂直插入培养基中。每次接种之间，使用本生灯对金属接种针进行灭菌；插入琼脂时，确保接种针不发生弯曲，以免影响实验结果。</li>
		<li>将平板倒置（盖子朝上）于37℃孵育14至24小时 &#176;C. 培养14小时后，密切观察运动性平板，以防止菌液过度生长。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Voges-Proskauer（VP）试验
	<ol>
		<li>按照第2.2节所述，制备LB液体培养基中的过夜培养物。</li>
		<li>用移液器吸取10 μL菌液接种于4 mL甲基红-伏-普（MR-VP）培养基中&#160;&#956;L&#160;将预先准备的过夜培养物接种至无菌培养管中的4 mL MR-VP肉汤&#160;并在37℃下以225 rpm振荡培养12至16小时&#160;&#176;C.</li>
		<li>加入150 &#956;5%（w/v）的 L &#945;-萘酚和50 &#956;向无菌培养管中分别加入1 mL MR-VP过夜培养物和40%（w/v）KOH溶液。</li>
		<li>短暂涡旋，室温静置最多4小时，直至颜色发生变化。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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作者无任何利益冲突需要披露。

在已鉴定的 200 多个 V. cholerae 血清群中，仅有 O1 和 O139 具有流行潜力。O1 血清群可分为两种生物型：古典生物型和埃尔托生物型。然而，近年来出现了一类被称为埃尔托变异株的杂交菌株13,17，其背景为埃尔托生物型，但携带古典生物型的特征8,9,10,11,12,13,14,15,<sup class="xref...

霍乱是一种由摄入被水生革兰氏阴性菌Vibrio cholerae污染的食物或水引起的远端小肠疾病。 霍乱的症状包括呕吐和无法控制的水样腹泻，导致严重脱水，若未得到适当治疗，将导致死亡。V. cholerae可根据细胞表面脂多糖O抗原的结构分为200多个血清群。然而，只有两个血清群（O1和O139）显示出流行或大流行的潜力1,2。此外，O139血清群主要分离自东南亚地区3,4，而O1血清群则在全球范围内分布。此外，O1血清群可进一步分为两个主要生物型：古典生物型和埃尔托生物型。古典生物型导致了1817年至1923年间的前六次霍乱大流行。当前的第七次大流行由埃尔托生物型引起，该生物型已在环境中全球性地取代了古典生物型5,6,7。近年来，出现了一些兼具古典和埃尔托生物型特征的菌株8,9,10,11,12,13,14,15,16,17，这些菌株被称为埃尔托变异株13,17。一些埃尔托变异株表现出增强的毒力，疾病进展更为迅速且严重，较以往观察到的情况更为突出，这凸显了对病原体识别以及疾病预防和治疗采取更全面方法的必要性8,9,18。尽管生物型鉴定并不直接决定治疗方案，但在疫苗开发和未来治疗药物方面的进一步进展可能受益于对生物型的区分。
此处列出的第一系列实验方案将使研究人员能够在实验室环境中正确地保藏V. cholerae菌株。为确保实验的一致性和后续分析，需要制备菌种保存液并培养分离株，该过程不依赖于生物型。然而，为了最佳地诱导毒力基因的表达，需采用针对不同生物型的独立培养技术19。此外，本文还概述了进行多种遗传学和生物化学检测的准备工作。
霍乱毒素（CT）和毒素共调节菌毛（TCP）是两种主要的毒力因子，在两种生物型中均由主调控因子 ToxT 控制 V. 霍乱弧菌 O1 群20. CT 是一种由五个 CtxB 组成的双组分毒素 围绕单个 CtxA 亚基的亚基，负责霍乱相关的快速电解质流失。TCP 是由 tcp 操纵子tcpABQCRDSTEF，并参与小肠远端的附着和定植。 tcpA 是第一个基因 tcp 编码构成菌毛所必需的单个菌毛蛋白亚基的操纵子8基因序列用于 ctxA 在古典生物型和埃尔托生物型之间完全保守，而 ctxB 和 tcpA 在两种生物型之间存在差异，但在各生物型内部保持保守8. ctxB 在两种生物型之间完全保守，仅在第115和203位碱基位置存在差异。在埃尔托生物型中，第115和203位碱基为胸腺嘧啶，而古典生物型在这两个位置上为胞嘧啶。 tcpA 在每种生物型内部完全保守，但在不同生物型之间存在多个碱基差异。这些遗传差异可作为生物型鉴定的主要标志，通过对包含这些位点的聚合酶链式反应（PCR）扩增产物进行测序后，可将待测菌株的序列与野生型（WT）古典生物型O395或野生型El Tor N16961进行比对，从而分别确定其霍乱毒素（CT）和毒素协同调节菌毛（TCP）的生物型背景 V. cholerae 分离株
已开发出多种方案用于鉴定古典生物型与埃尔托生物型之间的表型差异21,22,23多粘菌素B是一种多肽类抗生素，可破坏革兰氏阴性菌外细胞膜的完整性，其抗性可通过多粘菌素B抗性实验进行观察。21柠檬酸是三羧酸循环的主要底物，可通过柠檬酸代谢试验测定其作为唯一碳源的代谢能力。22. hapR 编码一种全局调控因子和群体感应的主要调控因子 霍乱弧菌， HapR，可结合多种启动子区域并调控基因和操纵子的表达24. 某些致病性菌株 V. cholerae 存在一个天然发生的移码突变 hapR 导致这种密度依赖性毒力基因表达调控功能丧失的基因24,25. 利用脱脂牛奶琼脂培养基检测HapR调控的蛋白酶活性，可帮助研究人员判断某一特定分离株是否含有功能性的HapR23溶血试验用于检测菌株分泌可裂解红细胞的溶血酶的能力；溶血程度可在血琼脂平板上直观观察。23运动性通常与毒力相关 霍乱弧菌 可使用运动性琼脂平板进行分析23Voges-Proskauer 试验用于检测菌株利用葡萄糖作为唯一碳源进行发酵并产生副产物乙酰甲基甲醇的能力21随着埃尔托变体的出现，在未进行广泛基因型筛查的情况下，难以预测任何特定表型实验的结果，也无法推断其生物型背景 霍乱弧菌. 霍乱弧菌 分离株时，建议进行这一系列检测的组合23 并与参考菌株的结果进行比较，如 表 2.
本文改进了一系列实验方案，综合运用上述基因型和表型检测方法，以更全面地对V. cholerae 生物型进行鉴定。此外，我们还描述了已知的V. cholerae埃尔托变异株（MQ1795和BAA-2163）与常用生物型参考菌株（经典型O395野生型、埃尔托C6706野生型和埃尔托N16961野生型；表1）在基因型和表型上的差异。埃尔托变异株的出现使得以往依赖单一检测方法进行生物型鉴定的可靠性受到挑战；然而，这一多方法联合鉴定体系将有助于更可靠地鉴定临床及环境来源的V. cholerae 分离株。

<table><tbody><tr><td>1 kb DNA Ladder</td><td>New England Biolabs</td><td>N3232S</td><td>https://www.neb.com/products/n3232-1-kb-dna-ladder</td></tr><tr><td>60% 甘油</td><td>Calbiochem</td><td>356352</td><td>http://www.emdmillipore.com/US/en/product/甘油，分子生物学级---CAS 56-81-5---Calbiochem,EMD_BIO-356352</td></tr><tr><td>琼脂</td><td>Becto, Dickinson and Co.</td><td>214030</td><td>http://catalog.bd.com/nexus-ecat/getProductDetail?productId=214030&amp;和父类别=&amp;和父级分类名称=&amp;&categoryId=&amp;和分类名称=&amp;&searchUrl=%2FsearchResults%3Fkeyword%3D214030%26typeOfSearch%3DproductSearch</td></tr><tr><td>含脑心浸液的琼脂</td><td>Becto, Dickinson and Co.</td><td>237500</td><td>http://catalog.bd.com/nexus-ecat/getProductDetail?productId=237500&amp;&parentCategory=&amp;和父级分类名称=&amp;&categoryId=&amp;amp;categoryName=&amp;&searchUrl=%2FsearchResults%3Fkeyword%3D237500%26typeOfSearch%3DproductSearch</td></tr><tr><td>琼脂糖</td><td>Peqlab</td><td>732-2789</td><td>https://de.vwr.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=732-2789&amp;amp;_DARGS=/store/cms/de.vwr.com/de_DE/header_2016111711383215.jsp_AF&amp;amp;_dynSessConf=1766917479792147141&amp;&targetURL=/store/catalog/product.jsp%3Fcatalog_number%3D732-2789&amp;amp;lastLanguage=zh&amp;amp;/vwr/userprofiling/EditPersonalInfoFormHandler.updateLocale=&amp;amp;_D%3AcurrentLanguage=+&amp;&currentLanguage=zh&amp;amp;_D%3AlastLanguage=+&amp;amp;_D%3A/vwr/userprofiling/EditPersonalInfoFormHandler.updateLocale=+</td></tr><tr><td>无水 K&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;高通量筛选&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Fisher Scientific</td><td>P288-500</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/potassium-phosphate-dibasic-anhydrous-crystalline-powder-certified-acs-fisher-chemical-5/p288500?searchHijack=true&amp;amp;searchTerm=P288500&amp;&searchType=RAPID</td></tr><tr><td>血琼脂平板</td><td>雷默尔</td><td>R01200</td><td>4°C 下保存 &amp;deg;C&amp;nbsp; http://www.remel.com/Catalog/Item.aspx?name=Blood+Agar</td></tr><tr><td>硼酸</td><td>Fisher Scientific</td><td>A73-500</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/boric-acid-crystalline-certified-acs-fisher-chemical-6/a73500?searchHijack=true&amp;amp;searchTerm=A73500&amp;&searchType=RAPID</td></tr><tr><td>溴百里酚蓝</td><td>Fisher Scientific</td><td>B388-10</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/bromothymol-blue-certified-acs-fisher-chemical/b38810?searchHijack=true&amp;amp;searchTerm=B38810&amp;&searchType=RAPID</td></tr><tr><td>柠檬酸 &amp;middot;H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Fisher Scientific</td><td>S72836-3</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/柠檬酸一水合物-4/s728363#?keyword=s728363</td></tr><tr><td>脱氧核苷酸（dNTP）溶液试剂盒</td><td>New England Biolabs</td><td>N0446S</td><td>储存于 -20 &amp;deg;C&amp;nbsp; https://www.neb.com/products/n0446-deoxynucleotide-solutionset</td></tr><tr><td>乙二胺四乙酸二钠</td><td>Fisher Scientific</td><td>S311-500</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/ethylenediaminetetraacetic-acid-disodium-salt-dihydrate-crystalline-certified-acs-fisher-chemical-7/s311500?searchHijack=true&amp;&searchTerm=S311500&amp;&searchType=RAPID</td></tr><tr><td>DNA 纯化 &amp;和浓缩器&amp;trade; -25 试剂盒</td><td>Zymo Research</td><td>D4007</td><td>http://www.zymoresearch.com/dna/dna-clean-up/zymoclean-gel-dna-recovery-kit</td></tr><tr><td>GelGreen 核酸染料</td><td>Biotium</td><td>41005</td><td>https://biotium.com/product/gelgreentm-nucleic-acid-gel-stain-10,000x-in-water/</td></tr><tr><td>Genesys 10SUV-VIS 分光光度计</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>840-208100</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/840-208100?ICID=search-840-208100</td></tr><tr><td>Gentra Puregene 酵母/细菌试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>158567</td><td>https://www.qiagen.com/us/shop/sample-technologies/dna/dna-preparation/gentra-puregene-yeastbact-kit/#orderinginformation</td></tr><tr><td>HCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>A144-212</td><td>腐蚀性；&amp;nbsp; https://www.fishersci.com/shop/products/hydrochloric-acid-certified-acs-plus-fisher-chemical-10/a144212?searchHijack=true&amp;amp;searchTerm=A144212&amp;&searchType=RAPID</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>P217-500</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/potassium-chloride-crystalline-certified-acs-fisher-chemical-4/p217500?searchHijack=true&amp;amp;searchTerm=P217500&amp;&searchType=RAPID</td></tr><tr><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Fisher Scientific</td><td>P285-500</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/potassium-phosphate-monobasic-crystalline-certified-acs-fisher-chemical-5/p285500?searchHijack=true&amp;amp;searchTerm=P285500&amp;&searchType=RAPID</td></tr><tr><td>KOH</td><td>Fisher Scientific</td><td>P250-500</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/potassium-hydroxide-pellets-certified-acs-fisher-chemical-5/p250500?searchHijack=true&amp;amp;searchTerm=P250500&amp;&searchType=RAPID</td></tr><tr><td>勒·卢普</td><td>Decon Labs Inc.</td><td>MP190-25</td><td>http://deconlabs.com/products/leloop/</td></tr><tr><td>勒氏培养基</td><td>Decon Labs Inc.</td><td>MP186-5</td><td>http://deconlabs.com/products/lestab/</td></tr><tr><td>MgSO₄&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&amp;middot;7H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Fisher Scientific</td><td>M63-500</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/magnesium-sulfate-heptahydrate-crystalline-certified-acs-fisher-chemical-3/m63500?searchHijack=true&amp;&searchTerm=M63500&amp;&searchType=RAPID</td></tr><tr><td>Mini-Sub Cell GT 水平电泳系统</td><td>伯乐实验室</td><td>1704406</td><td>http://www.bio-rad.com/zh-cn/product/mini-sub-cell-gt-cell?WT.srch=1&amp;amp;WT.mc_id=aw-cbb-NA-sub_cell_systems_brand_gold&amp;amp;WT.knsh_id=7eb1981f-a011-42a3-aece-1236ff453373</td></tr><tr><td>MR-VP 肉汤</td><td>Difco</td><td>216300</td><td>http://catalog.bd.com/nexus-ecat/getProductDetail?productId=216300&amp;和父类别=&amp;&parentCategoryName=&amp;&categoryId=&amp;&categoryName=&amp;amp;searchUrl=%2FsearchResults%3Fkeyword%3Dmr-vp%2Bmedium%26typeOfSearch%3DproductSearch</td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Fisher Scientific</td><td>S374-500</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/sodium-phosphate-dibasic-anhydrous-granular-powder-certified-acs-fisher-chemical-5/s374500?searchHijack=true&amp;&searchTerm=S374500&amp;&searchType=RAPID</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>S271-10</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/sodium-chloride-crystalline-certified-acs-fisher-chemical-6/s27110?searchHijack=true&amp;&searchTerm=S27110&amp;&searchType=RAPID</td></tr><tr><td>NaHCO₃&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>Fisher Scientific</td><td>S233-500</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/sodium-bicarbonate-powder-certified-acs-fisher-chemical-5/s233500?searchHijack=true&amp;amp;searchTerm=S233500&amp;&searchType=RAPID</td></tr><tr><td>NaNH&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;高通量筛选&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&amp;middot;4H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Fisher Scientific</td><td>S218-500</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/sodium-ammonium-phosphate-tetrahydrate-crystalline-certified-fisher-chemical/s218500?searchHijack=true&amp;&searchTerm=S218500&amp;&searchType=RAPID</td></tr><tr><td>NanoDrop Lite 分光光度计</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>ND-LITE-PR</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/ND-LITE-PR?ICID=search-ND-LITE-PR</td></tr><tr><td>脱脂奶粉</td><td>雀巢淡奶</td><td>N/A</td><td>N/A</td></tr><tr><td>蛋白胨</td><td>Becto, Dickinson and Co.</td><td>211677</td><td>http://catalog.bd.com/nexus-ecat/getProductDetail?productId=211677&amp;&parentCategory=&amp;&parentCategoryName=&amp;&categoryId=&amp;&categoryName=&amp;&searchUrl=%2FsearchResults%3Fkeyword%3D211677%26typeOfSearch%3DproductSearch</td></tr><tr><td>培养皿（100 mm × 15 mm）</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875712</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-petri-dishes-clear-lid-12/fb0875712#?keyword=FB0875712</td></tr><tr><td>培养皿（150 mm × 15 mm）</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875714</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-petri-dishes-clear-lid-12/fb0875714?searchHijack=true&amp;amp;searchTerm=FB0875714&amp;&searchType=RAPID</td></tr><tr><td>多粘菌素B硫酸盐</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1004-10MU</td><td>2-4°C 下保存 &amp;deg;C；http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/p1004?lang=en&amp;amp;region=US</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Taq&lt;/em&gt; DNA聚合酶</td><td>New England Biolabs</td><td>M0273S</td><td>-20℃保存 &amp;deg;C；https://www.neb.com/products/m0273-taq-dna-polymerase-with-standard-taq-buffer</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Taq&lt;/em&gt; 反应缓冲液</td><td>New England Biolabs</td><td>M0273S</td><td>-20℃保存 &amp;deg;C&amp;nbsp; https://www.neb.com/products/m0273-taq-dna-polymerase-with-standard-taq-buffer</td></tr><tr><td>热循环仪 Bio-Rad C1000 Touch&amp;trade;&amp;nbsp;</td><td>伯乐实验室</td><td>1840148</td><td>http://www.bio-rad.com/evportal/evolutionPortal.portal?_nfpb=true&amp;&_pageLabel=搜索页面&amp;amp;sfMode=search&amp;amp;sfStartNumber=1&amp;amp;clearQR=true&amp;amp;js=1&amp;&searchString=1840148&amp;amp;数据库=产品SKU+产品类别+产品详情+abdProductDetails+材料安全数据表+文献+说明书+常见问题+下载+网页+检测+基因+通路+板型+促销&amp;amp;tabName=DIVISIONNAME</td></tr><tr><td>氯化三苯基四氮唑</td><td>Alfa Aesar</td><td>A10870</td><td>https://www.alfa.com/en/catalog/A10870/</td></tr><tr><td>Tris碱</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP152-1</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/tris-base-white-crystals-crystalline-powder-molecular-biology-fisher-bioreagents-7/bp1521?searchHijack=true&amp;amp;searchTerm=BP1521&amp;&searchType=RAPID</td></tr><tr><td>胰蛋白胨</td><td>Becto, Dickinson and Co.</td><td>211705</td><td>http://catalog.bd.com/nexus-ecat/getProductDetail?productId=211705&amp;&parentCategory=&amp;和父级分类名称=&amp;amp;categoryId=&amp;amp;categoryName=&amp;&searchUrl=%2FsearchResults%3Fkeyword%3D211705%26typeOfSearch%3DproductSearch</td></tr><tr><td>酵母提取物</td><td>Becto, Dickinson and Co.</td><td>212750</td><td>http://catalog.bd.com/nexus-ecat/getProductDetail?productId=212750&amp;和&amp;和父级分类名称=&amp;&categoryId=&amp;&categoryName=&amp;&searchUrl=%2FsearchResults%3Fkeyword%3D212750%26typeOfSearch%3DproductSearch</td></tr><tr><td>&amp;alpha;-萘酚</td><td>MP Biomedicals</td><td>204189</td><td>http://www.mpbio.com/product.php?pid=05204189</td></tr></tbody></table>

用于维持和区分霍乱弧菌生物型的实验室技术 霍乱弧菌 临床与环境分离株

Laboratory Techniques Used to Maintain and Differentiate Biotypes of Vibrio cholerae Clinical and Environmental Isolates

水生革兰氏阴性菌Vibrio cholerae是感染性胃肠道疾病霍乱的致病因子。由于该疾病在全球范围内的普遍性和严重性，V. cholerae在环境和实验室条件下均得到了广泛研究，需要采用适当的保藏和培养技术。古典生物型和埃尔托生物型是构成V. cholerae O1血清群的两种主要生物型，各自表现出独特的基因型和表型特征，这些特征为生物型鉴定提供了可靠的依据，同时也需要不同的毒力诱导培养条件。无论特定感染或疫情暴发的致病菌株属于何种生物型，该疾病的标准化治疗均包括补液疗法并辅以抗生素治疗方案。然而，生物型分类在实验室研究中可能是必要的，并可能在生物医学领域产生更广泛的影响。在21世纪初，已鉴定出一些临床分离株，其同时表现出古典生物型和埃尔托生物型的基因型与表型特征。这些新发现的杂交株被称为埃尔托变异株，使得临床和环境分离株的生物型鉴定比以往传统的单一检测鉴定方法更为复杂。本文除描述V. cholerae的一般保藏与培养技术外，还介绍了一系列基于基因特异性（ctxB和tcpA）的PCR遗传筛查方法以及表型检测方法（多粘菌素B抗性、柠檬酸盐代谢、蛋白水解活性、溶血活性、运动性，以及通过Voges-Proskauer试验检测葡萄糖代谢），这些方法联合用于对古典生物型与埃尔托生物型进行特征分析和/或区分。综合而言，这些检测方法提供了一种高效系统的策略，可作为替代方法或补充手段，用于替代成本高昂且劳动密集型的实验，以完成对V. cholerae临床（及环境）分离株的鉴定。

为了正确保藏和使用任何细菌菌株，建议了解目标菌株的倍增时间。本文通过生长曲线展示了常用V. cholerae菌株的不同生长速率，并利用线性回归计算了其近似倍增时间。野生型El Tor N16961和El Tor变异株MQ1795的倍增时间较短（分别约为1 h和1 h），短于野生型古典生物型O395（约2 h）（图1；表2）。
V. cholerae 基因操作及后续分析通常依赖于准确区分生物型的能力。基于PCR的遗传筛选与表型检测被共同应用于可靠地区分生物型背景。 V. cholerae 临床和环境分离株；为便于代表性展示，纳入了生物型参考菌株（WT 古典型 O395、WT 埃尔托型 C6706 和 WT 埃尔托型 N16961）以及代表性埃尔托变异株（MQ1795 和 B...

本文描述了正确的Vibrio cholerae保藏技术，以及一系列生化检测方法，这些方法共同用于在实验室环境中快速、可靠地区分临床和环境来源的V.cholerae生物型。

水生革兰氏阴性菌霍乱弧菌（Vibrio cholerae）是感染性胃肠道疾病霍乱的致病因子。由于该疾病在全球范围内流行且病情严重，霍乱弧菌在环境和实验室条件下均已被广泛研究，需要采用适当的保藏与培养技术。古典生物型和埃尔托生物型是构成霍乱弧菌O1血清群的两个主要生物型，各自具有独特的基因型和表型特征，这些特征为生物型鉴定提供了可靠的依据，同时也需要不同的毒力诱导培养条件。无论特定感染或疫情暴发的致病菌株属于何种生物型，该疾病的标准化治疗均包括补液疗法并辅以抗生素治疗方案。然而，生物型分类在实验室研究中可能是必要的，并可能在生物医学领域产生更广泛的影响。在21世纪初，已鉴定出一些临床分离株，其同时表现出古典生物型和埃尔托生物型的基因型与表型特征。这些新发现的杂交株被称为埃尔托变异株，使得临床和环境分离株的生物型鉴定比以往传统的单一检测方法更为复杂。本文除介绍霍乱弧菌的一般保藏与培养技术外，还描述了一系列基于基因特异性（ctxB和tcpA）的PCR遗传筛查方法以及表型检测方法（多粘菌素B抗性、柠檬酸盐代谢、蛋白水解活性、溶血活性、运动性，以及通过Voges-Proskauer试验检测葡萄糖代谢），这些方法联合使用可用于鉴定和/或区分古典生物型与埃尔托生物型。这些检测方法共同提供了一种高效系统的分析流程，可作为替代方法或补充手段，用于霍乱弧菌临床（及环境）分离株的鉴定，避免成本高昂且耗时费力的实验。

该技术的总体目标是提供一系列操作简便的实验方案，帮助研究人员对任意霍乱弧菌的临床或环境分离株进行表征。该方法有助于回答细菌学领域的关键问题，例如任何霍乱弧菌分离株特有的基因型和表型特征，尤其是具有临床意义的分离株。该技术的主要优势在于，可使研究人员利用这一系列检测方法，可靠地对临床或环境来源的霍乱弧菌分离株进行特征分析和区分。这些检测方法共同提供了一种系统性的分析手段，可作为对成本较高且劳动密集型实验的替代或补充，用于霍乱弧菌临床及环境分离株的鉴定。尽管该方法可用于深入了解霍乱弧菌生物型的特征，也可推广应用于其他肠道细菌生化与代谢能力的鉴定。通常，初次使用该方法的研究人员在时间管理方面会遇到困难，因为不同生化检测所需的孵育时间各异，为确保最佳结果需精确控制各步骤的时间。点样和穿刺接种操作的可视化演示至关重要，因为飞溅常常会导致交叉污染，且需要最大程度的间距以防止菌落之间融合。首先，在无菌的 2 mL 微量离心管中，取 1.8 mL 过夜液体培养物，以至少 8,600 ×g 离心 2 分钟，使菌体沉淀。离心后，弃去上清液，用移液器将菌体沉淀重悬于 900 µL 新鲜的 LB 培养基（Luria-Bertani 培养基）中。接下来，向培养物中加入 900 µL 无菌的 60%（体积比）甘油溶液，通过涡旋振荡混匀。将混合液转移至无菌的 2 mL 冻存管中，并将菌种保存在 -80 °C 条件下。使用时，用无菌接种环取少量冷冻菌种，在 LB 琼脂平板上划线以获得单菌落。使用后立即将冻存菌种放回-80摄氏度，以防止菌种完全融化。将平板倒置（盖子朝下）于37摄氏度培养12至16小时。取预先准备好的平板。用无菌接种环接触单菌落表面，将菌落转移至装有4 mL液体LB培养基的无菌10 mL培养管中进行接种。随后，在37摄氏度下，于摇床培养箱中以225 rpm振荡培养12–16小时。在液体LB培养基中制备过夜培养物。第二天，离心收集菌体，将细胞沉淀用 1.8 mL 1× 磷酸盐缓冲液（PBS）重悬以洗涤细胞。重复洗涤步骤三次。第三次洗涤后，最终用 1.8 mL 1× PBS 重悬细胞沉淀。然后，使用移液器吸头将1 µL洗涤后的菌液点样到相应的培养基上。收集过夜培养物的菌体沉淀并进行洗涤。将接种环插入洗涤后的液体培养物中，然后垂直穿刺接种到动力性琼脂平板中。确保接种针在穿刺琼脂时不要弯曲。每次接种之间，使用本生灯灼烧金属接种针以灭菌。将平板倒置（皿盖朝上），于37摄氏度培养14至24小时。14 小时后，密切观察运动性平板，以防止菌液过度生长。用移液器将先前制备的过夜培养物 10 µL 加入装有 4 mL 甲基红-伏普（Methyl Red Voges-Proskauer，MR-VP）肉汤的无菌培养管中，接种 4 mL MR-VP 肉汤，并在 37 摄氏度下于摇床培养箱中以 225 rpm 振荡培养 12 至 16 小时。接着，分别向无菌培养管中 MR-VP 过夜培养物的 1 mL 等分试样中加入 150 µL 5%（质量/体积）的 α-萘酚溶液和 50 µL 40%（质量/体积）的氢氧化钾溶液。然后，短暂涡旋混匀各管。将试管置于室温下静置，最长不超过四小时，直至颜色发生变化。在PCR碱基遗传筛查和表型检测中，纳入了生物型参考菌株及代表性埃尔托变体，以区分霍乱弧菌临床分离株与环境分离株的生物型背景。野生型古典生物型O395表现出典型的ctxB和tcpA序列。相反，野生型埃尔托生物型菌株N16961和C6706表现出埃尔托型的ctxB和tcpA序列。MQ1795和BAA-2163含有与O395相似的古典生物型ctxB亚基。然而，两种埃尔托变异株均含有提示埃尔托生物型背景的 tcpA。在添加多粘菌素B的LB琼脂平板上培养时，野生型古典生物型菌株0395对多粘菌素B敏感，而野生型埃尔托生物型菌株则表现为耐药。代表性埃尔托变异株对这种抗生素表现出类似的耐药性。观看本视频后，您应能够充分理解如何利用本文所述的多重检测鉴定系统来区分霍乱弧菌的不同生物型。请务必注意，操作生物安全等级为BSL-2的病原体具有极高危险性，所有材料及废弃物的正确处理与处置必须严格遵守机构、地方、州以及联邦的相关法规。除本文所列实验方案外，还可通过研究其他表型特征（如生物膜形成能力和自凝集现象）对霍乱弧菌分离株进行进一步表征。

laboratory-techniques-used-to-maintain-differentiate-biotypes-vibrio

Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

用于维持和区分生物型的实验室技术<em&gt;霍乱弧菌</em&gt;临床和环境隔离

在使用用于培养微生物的培养基和试剂时，必须采用无菌技术，以确保将污染降至最低。多种平板接种方法被常规用于分离、扩增或计数细菌和噬菌体，这些方法均包含维持实验材料无菌状态的操作步骤。...

无菌实验技术：平板接种方法

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来源： Yeung, M. 等 一种用于检测的更敏感且特异的显色培养基的开发 副溶血性弧菌 及其他 弧菌 物种。 视频实验杂志...

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来源： Brumfield, K. D. 等 用于维持和区分生物型的实验室技术 霍乱弧菌 临床与环境分离株 视频实验杂志...

在液体培养基中获得纯细菌培养物

来源： Brumfield, K. D., 等用于维持和区分生物型的实验室技术 霍乱弧菌 临床与环境分离株 视频实验杂志 (2017)本视频演示了一种使用氯化三苯基四氮唑的软琼脂实验，通过观察活跃迁移细胞周围红色区域的形成来可视化代谢活性，从而评估和比较霍乱弧菌（Vibrio...

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来源： Brumfield, K. D., 等用于维持和区分不同生物型的实验室技术 Vibrio cholerae 临床与环境分离株 视频实验杂志 (2017).本视频演示了伏格斯-普罗科菲耶夫（Voges-Proskauer，VP）试验，用于区分霍乱弧菌（Vibrio...

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来源：Nag, D., 等 利用成年斑马鱼模型定量分析霍乱弧菌定植与腹泻。J. Vis. Exp. (2018)本视频演示了一种定量成年斑马鱼肠道细菌载量的实验方案，这些斑马鱼感染了耐抗生素的霍乱弧菌（Vibrio...

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快速制备电转感受态Escherichia coli和Vibrio cholerae的实验方案

检测和分离具有临床意义的Vibrio菌种需要使用选择性和鉴别性培养基。本研究评估了一种新型显色培养基在检测和鉴定V.

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本方案使读者能够采用多角度方法分析胆盐诱导的肠道病原菌生物膜形成，通过评估细菌的黏附、胞外聚合物基质形成及分散过程，揭示细菌生物膜的动态特性。...

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共培养实验用于量化Vibrio fischeri分离株之间的竞争相互作用

了解用于区分霍乱弧菌临床株与环境株的生化检测方法。该技术通过系统性的表型分析方案，为细菌学研究提供可靠且经济的替代方案，帮助研究人员快速鉴定菌株特性并评估其临床相关性。

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