Name: 阻断外瓦萨血管灌注对腹主动脉瘤鼠模型的建立 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-08T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 37 s
Description: 学习通过聚氨酯导管插入和缝合结扎技术在大鼠体内诱导主动脉组织缺氧，建立与人类病理特征相似的腹主动脉瘤动物模型。该方法有助于研究动脉瘤发展和破裂机制。

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本研究得到了日本学术振兴会科学研究费补助金（B）（20291958）对 N.U. 的资助；以及青年科学家研究费补助金（A）（25713024）对 N.Z. 的资助。

动物饲养和实验均按照滨松医科大学动物饲养中心动物护理委员会的指南进行。
1. 建立模型的手术操作步骤
注意：术前将手术器械放入玻璃珠灭菌器中灭菌10秒。术中使用无菌手套。
<ol>
	<li>使用体重为300 - 400 g的雄性大鼠。允许大鼠自由摄食和饮水 随意摄取.</li>
	<li>使用异氟烷吸入麻醉大鼠（2.0 - 3.0 mL/L）。通过夹捏足趾确认麻醉效果。</li>
	<li>用电剃刀剃除腹部毛发，并用酒精和聚维酮碘溶液擦拭腹部。</li>
	<li>将大鼠仰卧位固定于手术台上。在麻醉期间，使用兽用眼膏涂抹大鼠眼睛，以防角膜干燥。</li>
	<li>使用剪刀沿腹中线作腹正中切口进行剖腹手术。为确保术野清晰，使用伤口牵开器并以无菌纱布将腹腔内容物包裹后推入腹腔内。</li>
	<li>使用镊子轻轻提起并撕开腹膜后组织，以暴露主动脉壁，并在腹膜后间隙中从左侧肾静脉水平至主动脉分叉处，将肾下主动脉从周围血管组织中剥离图1A).</li>
	<li>用5-0丝线结扎腹主动脉分支的血管，阻断血流供应，结扎位置应远离主动脉主干，避免造成主动脉管腔狭窄。</li>
	<li>为阻断主动脉血流，将血管夹置于肾动脉下方和主动脉分叉上方。 
	注意：夹子的尺寸应大于主动脉直径，以完全阻断血流。也可使用临时的5-0丝线结扎来阻断血流，替代夹子。</li>
	<li>类似于在主动脉壁表面制造点状出血，使用显微剪刀剪开主动脉前壁&#160;在主动脉夹远端5 mm处，靠近肾动脉分支的位置，插入一根聚氨酯导管。</li>
	<li>使用24号留置针将聚氨酯导管（外径0.55 mm，内径0.37 mm）经切口浅插入，注入清水冲洗主动脉内的血液。用1 mL注射器盛清水注入聚氨酯导管，冲洗主动脉中残留的血液。灌注完成后，将导管从主动脉中取出。</li>
	<li>在使用18号留置针插入聚氨酯导管（外径1.20 mm，内径0.94 mm）之前，将聚氨酯导管剪至10 mm长图1B).
	<ol>
		<li>将剪下的聚氨酯导管片段从第1.9步制作的切口插入主动脉管腔内。将10 mm导管完全置入主动脉管腔，并调整导管中点位置，使其与切口位置对齐即用导管覆盖切口。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用间断缝合修复切口&#160;使用8-0单丝线缝合（图1C).</li>
	<li>使用5-0丝线和聚氨酯导管结扎腹主动脉图1D). 
	注意：留置导管可维持主动脉管腔通畅。应牢固结扎主动脉，以防止导管位置移位。建议使用外科结，因为在打第一个结扣时增加了一次扭转，形成双叠结，额外的缠绕可提供更大摩擦力，减少结的松脱。</li>
	<li>结扎后，移除腹主动脉分叉处的血管夹，然后移除肾动脉下方的血管夹以恢复顺行血流。确认腹主动脉明显的搏动。</li>
	<li>用4-0聚丙烯缝线将腹部切口分两层缝合，即腹膜层及其他各层。应严密缝合切口，以防器官脱出。</li>
	<li>在腹部切口处涂抹利多卡因。将大鼠置于加热垫上，直至其意识恢复。在大鼠恢复足够意识以维持胸卧位之前，不得无人看管。大鼠在手术后未完全恢复前，不得放回与其他大鼠同笼饲养。</li>
	<li>术后密切观察大鼠状态。若大鼠出现痛苦迹象或体重下降，应皮下注射无菌生理盐水（1.0 - 2.0 mL）一次。</li>
	<li>术后通过超声心动图观察扩张主动脉的时间进程变化。按照所述方法，测量腹主动脉从内侧缘至外侧缘的最大直径。5.</li>
</ol>
2. 收集、固定及弹性-范吉森（Elastica-van Gieson，EVG）染色
<ol>
	<li>术后28天，通过腹腔注射戊巴比妥钠 ≥ 100 mg/kg 以处死大鼠。</li>
	<li>沿腹壁正中切开大鼠腹腔，先用手术刀进行初始切口。使用剪刀取下动脉瘤，并将取出的主动脉置于10%中性缓冲福尔马林溶液中固定24–48小时。 
	注意：手术过程中必须小心操作，避免损伤主动脉及其他器官。若观察到腹部器官隆起，则提示腹主动脉瘤（AAA）已形成。图2展示了体内（in vivo）和体外（ex vivo）图像；该代表性AAA样本未发生破裂。</li>
	<li>EVG染色9
	<ol>
		<li>溶液配制
		<ol>
			<li>按以下顺序配制Verhoeff苏木精染液：20 mL 酒精性苏木精、8.0 mL 10% 氯化铁溶液和8 mL 碘-碘化钾溶液（Lugol's碘液），每次加入后充分混匀。该溶液可根据需要新鲜配制。</li>
			<li>配制Van Gieson溶液：将1%酸性品红溶液1 mL与饱和苦味酸溶液45 mL混合，静置过夜后充分混匀。该溶液可稳定保存2周。</li>
			<li>配制分化液（2%氯化铁）：将10 mL 10% FeCl3溶液加入40 mL蒸馏水中混匀。该溶液可根据需要新鲜配制。</li>
			<li>配制5%硫代硫酸钠溶液（5% hypo）：将5.0 g硫代硫酸钠溶解于100 mL蒸馏水中。该溶液可稳定保存1年。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>染色步骤 
		注意：详细步骤参见参考文献9。
		<ol>
			<li>将固定后的主动脉石蜡切片用蒸馏水短暂水化10分钟。将切片浸入Verhoeff苏木精染液中染色25分钟。水洗后，在分化液（2% FeCl3）中浸蘸10–30次。再次水洗，随后置于5% hypo溶液中1分钟。水洗后，再放入Van Gieson溶液中染色5分钟。</li>
			<li>依次以以下浓度酒精脱水：75%、90%、95%、100%和100%酒精，每级30秒。然后用二甲苯透明两次，每次5分钟。最后用树脂封片剂封片。 
			注意：弹性纤维呈蓝黑色至黑色；细胞核呈蓝色至黑色；胶原纤维呈红色；其他组织成分呈黄色。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Wolinsky, H., Glagov, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+abdominal+and+thoracic+aortic+medial+structure+in+mammals.+Deviation+of+man+from+the+usual+pattern%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Comparison of abdominal and thoracic aortic medial structure in mammals. Deviation of man from the usual pattern.</a> Circ Res. 25 (6), 677-686 (1969).</li>
<li>Sano, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphangiogenesis+and+angiogenesis+in+abdominal+aortic+aneurysm%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Lymphangiogenesis and angiogenesis in abdominal aortic aneurysm.</a> PLoS One. 9 (3), e89830(2014).</li>
<li>Vorp, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Association+of+intraluminal+thrombus+in+abdominal+aortic+aneurysm+with+local+hypoxia+and+wall+weakening%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vasc+Surg%22%5BJournal%5D)">Association of intraluminal thrombus in abdominal aortic aneurysm with local hypoxia and wall weakening.</a> J Vasc Surg. 34 (2), 291-299 (2001).</li>
<li>Tanaka, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adventitial+vasa+vasorum+arteriosclerosis+in+abdominal+aortic+aneurysm%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Adventitial vasa vasorum arteriosclerosis in abdominal aortic aneurysm.</a> PLoS One. 8 (2), e57398(2013).</li>
<li>Tanaka, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoperfusion+of+the+Adventitial+Vasa+Vasorum+Develops+an+Abdominal+Aortic+Aneurysm%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Hypoperfusion of the Adventitial Vasa Vasorum Develops an Abdominal Aortic Aneurysm.</a> PLoS One. 10 (8), e0134386(2015).</li>
<li>Tanaka, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+Mass+Spectrometry+Reveals+a+Unique+Distribution+of+Triglycerides+in+the+Abdominal+Aortic+Aneurysmal+Wall%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vasc+Res%22%5BJournal%5D)">Imaging Mass Spectrometry Reveals a Unique Distribution of Triglycerides in the Abdominal Aortic Aneurysmal Wall.</a> J Vasc Res. 52 (2), 127-135 (2015).</li>
<li>Kugo, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+preventive+effect+of+fish+oil+on+abdominal+aortic+aneurysm+development%5BTitle%5D)+AND+%22Biosci+Biotechnol+Biochem%22%5BJournal%5D)">The preventive effect of fish oil on abdominal aortic aneurysm development.</a> Biosci Biotechnol Biochem. 80 (6), 1186-1191 (2016).</li>
<li>Kugo, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipocyte+in+vascular+wall+can+induce+the+rupture+of+abdominal+aortic+aneurysm%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Adipocyte in vascular wall can induce the rupture of abdominal aortic aneurysm.</a> Sci Rep. 6, 31268(2016).</li>
<li>Lichtenberg, A., Cebotari, S., Tudorache, I., Hilfiker, A., Haverich, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+scaffolds+for+heart+valve+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Biological scaffolds for heart valve tissue engineering.</a> Methods Mol Med. 140, 309-317 (2007).</li>
<li>Heistad, D. D., Marcus, M. L., Larsen, G. E., Armstrong, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+vasa+vasorum+in+nourishment+of+the+aortic+wall%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Role of vasa vasorum in nourishment of the aortic wall.</a> Am J Physiol. 240 (5), H781-H787 (1981).</li>
<li>Yoshimura, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regression+of+abdominal+aortic+aneurysm+by+inhibition+of+c-Jun+N-terminal+kinase%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Regression of abdominal aortic aneurysm by inhibition of c-Jun N-terminal kinase.</a> Nat Med. 11 (12), 1330-1338 (2005).</li>
<li>Azuma, J., Asagami, T., Dalman, R., Tsao, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Creation+of+murine+experimental+abdominal+aortic+aneurysms+with+elastase%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Creation of murine experimental abdominal aortic aneurysms with elastase.</a> J Vis Exp. (29), (2009).</li>
<li>Lu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subcutaneous+Angiotensin+II+Infusion+using+Osmotic+Pumps+Induces+Aortic+Aneurysms+in+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Subcutaneous Angiotensin II Infusion using Osmotic Pumps Induces Aortic Aneurysms in Mice.</a> J Vis Exp. (103), (2015).</li>
<li>United Kingdom, E. T. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.nejm.org/doi/full/10.1056/NEJMoa0909305#t=article">Endovascular versus open repair of abdominal aortic aneurysm.</a> N Engl J Med. 362 (20), 1863-1871 (2010).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

在生理条件下，主动脉壁的内层由管腔内血流通过扩散作用提供营养，而外层和中层则由滋养血管（VV）供血，这些血管从外膜穿透至中膜的滋养血管1。进入腹主动脉壁的滋养血管血流可来源于以下三个方向/区域：（1）通过主动脉壁近端方向，（2）通过主动脉壁远端方向，以及（3）周围血管外组织10。既往我们对人类组织的组织学分析发现，腹主动脉瘤（AAA）壁中的滋养血管存在显著狭窄或闭塞，提示进入腹主动脉壁的滋养血管血流可能减少4。本实验方案中一个极为关键的要点是，肾下腹主动脉瘤是通过聚氨酯导管插入联合肾下腹主动脉结扎共同诱导形成的。为了精细剥离组织层次，外科操作必须将聚氨酯导管顺利插入主动脉，并牢固结扎主动脉，从而导致外膜滋养血管灌注不足，引发慢性缺氧及动脉瘤形成。采用这些技术后，主动脉壁内的血流随之减少，并诱导形成局部缺氧环境。血流减少及缺氧诱导的动脉瘤形成表明，滋养血管向腹主动脉壁的供血在AAA发病机制中具有重要作用。
具体而言，主动脉瘤模型必须满足以下条件：与基线相比，血管直径增加1.5倍，中膜发生退变，以及主动脉壁出现炎症。目前最常用的动物模型是通过使用某些物质诱导炎症反应构建的，例如CaCl211、弹性蛋白酶12和血管紧张素II13。这些模型具有较高的可重复性，并能明显引起病理改变，因此在研究中被广泛使用。在本模型中，我们从手术前开始至术后第28天，每隔7天通过超声成像评估一次主动脉直径（图3）。结果显示，在28天内主动脉直径呈中度增加，表明该直径变化与既往啮齿类动物模型中的变化相似。对血管形态的大体观察显示为光滑的梭形结构（图2）。术后第28天，处死大鼠并取主动脉组织进行组织病理学分析。结果显示中膜和外膜的弹性纤维与胶原纤维出现撕裂和消失现象（图4）。此外，在外膜至中膜区域可见包括巨噬细胞在内的炎性细胞浸润。
目前，腹主动脉瘤（AAA）的治疗选择仅限于手术修复和血管内支架移植物植入，对于发生AAA破裂的患者，其死亡率高达30–50%14。然而，尚无任何药物被批准用于AAA的临床治疗。在AAA研究中，人类与常用动物模型之间的病理学表现是否存在差异，目前仍存在争议。人类AAA与动物AAA模型在发病机制上的相似性，对于开发药理学治疗方法至关重要。就啮齿类动物模型的有效性而言，本研究中的大鼠模型在管腔内血栓形成5和脂肪生成8方面在形态学上与人类具有相似性。此外，本研究中约20%的大鼠在手术后28天内发生了AAA破裂并死亡。尽管主动脉瘤破裂是该疾病最关键的事件，但在现有的实验性AAA模型中，破裂现象并不常见，其机制尚未阐明。因此，该模型有助于理解主动脉直径扩张及动脉瘤破裂的机制。
该模型的建立对于某些外科手术是必需的。因此，研究人员必须练习建立此模型，而这正是该模型的一个局限性。未来，我们希望创建一种啮齿类动物模型，通过逐渐增厚VV管壁以减少血流，从而导致自发性主动脉瘤的形成。

腹主动脉由以下三层结构组成：内层血管壁（内膜）、中层（中膜）和外层血管壁（外膜），其中外膜具有独特的血液供应系统，称为血管滋养血管（vasa vasorum，VV）。主动脉组织的氧气供应依赖于外膜血管滋养血管的灌注以及来自主动脉血流的单纯氧气扩散1。然而，从解剖位置上看，与主动脉其他部位相比，腹主动脉的血管滋养血管分布最少2。
既往一项研究报道了在具有较厚腔内血栓（ILT）的人腹主动脉瘤（AAA）壁中存在组织缺氧现象3。此外，研究还表明，动脉瘤壁中外膜血管（VV）发生动脉粥样硬化性改变而导致闭塞的比率显著升高，且与AAA壁内的组织缺氧相关4。基于这些发现，研究人员通过诱导外膜VV低灌注建立了一种新型的啮齿类动物AAA模型5。在该模型中，VV低灌注导致了组织缺氧以及肾下腹主动脉瘤的形成，其形态学和病理学特征与人类AAA相似6。典型的特征包括ILT的存在、增生性脂肪细胞的积聚6，以及发生破裂的潜在可能7,8。这些特征在以往的啮齿类动物模型中极少被观察到。因此，该模型可能极大促进对AAA发生和发展及破裂机制的深入理解。本文介绍并描述了一种通过诱导外膜VV低灌注来建立AAA的标准实验方案，并阐述了如何利用外科技术在主动脉壁内诱导缺氧状态。

<table><tbody><tr><td>大鼠</td><td>Japan SLC.Inc</td><td>Slc:SD 大鼠</td><td>Sprague&amp;ndash;Dawley 大鼠TM</td></tr><tr><td>聚维酮碘溶液</td><td>Libatape Pharmaceutical Co., Ltd.</td><td>4987335 111457</td><td></td></tr><tr><td>5-0 丝线</td><td>Akiyama Medical MFG. CO.,LTD</td><td>JIS No.1</td><td></td></tr><tr><td>血管夹</td><td>Natsume Seisakusho Co., Ltd.</td><td>C-42-S-2</td><td></td></tr><tr><td>聚氨酯导管（24 号留置针）</td><td>MEDIKIT</td><td>24G</td><td>Supercath Z4VTM, 24 号留置针</td></tr><tr><td>聚氨酯导管（18 号留置针）</td><td>MEDIKIT</td><td>18G</td><td>Supercath Z3VTM, 18 号留置针</td></tr><tr><td>8-0 单股缝线</td><td>Ethicon Suture</td><td>c-42-S-2</td><td>PROLENE 聚丙烯缝线，用于缝合切口</td></tr></tbody></table>

通过阻断外膜滋养血管灌注建立腹主动脉瘤的啮齿动物模型

Creation of a Rodent Model of Abdominal Aortic Aneurysm by Blocking Adventitial Vasa Vasorum Perfusion

外膜滋养血管（VV）为主动脉壁提供氧气和营养。主动脉壁缺氧可导致腹主动脉瘤（AAA）增大。本文介绍并描述了一种标准实验方案，通过将聚氨酯导管插入主动脉腔并结扎肾下腹主动脉，造成外膜VV低灌注，从而诱导形成AAA。
该方案使用体重为300-400 g的雄性大鼠，自由摄取食物和水。ad libitum。通过腹正中切口开腹后，剥离腹主动脉，以阻断来自周围血管组织的血流。在肾动脉分支附近做一小切口行主动脉切开术，并使用18号留置针插入聚氨酯导管。缝合切口后，于导管上方对主动脉进行紧密结扎，从而通过主动脉壁从近端方向阻断静脉-静脉（VV）血流，同时不干扰主动脉本身的血流。该技术可诱导形成腹主动脉瘤（AAA），并伴随主动脉进行性扩张。
该模型最大的优势在于，VV 低灌注可导致组织缺氧，并引发腹主动脉瘤的形成，其形态学和病理学特征与人类腹主动脉瘤相似。

所描述的手术技术通过结合聚氨酯导管插入与肾下腹主动脉结扎，在大鼠中建立了一种由慢性主动脉缺氧诱导的动脉瘤新型动物模型。文中所述大鼠 实验方案 术后28天处死动物，取主动脉进行成像以观察动脉瘤形成情况。 图2 显示梭形腹主动脉瘤的发展。腹主动脉的上端和下端 离体 直径正常，无扩张。使用经腹超声检查测量主动脉直径（图3直径通常在手术后约14天达到最大值，此后保持不变或略有增加。 图4 显示了EVG染色后动脉瘤在最大直径处的组织病理学图像。第28天（动脉瘤）的组织图像与第0天相比，弹性纤维出现明显降解。
<img alt="手术步骤示意图：剥离、导管插入、切口修复、结扎；医学示意图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55763/55763fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图1"> 
图1：诱导腹主动脉瘤（AAA）的手术操作步骤。 
（A）将肾下腹主动脉从周围组织中剥离。（B）将一段长10 mm的聚氨酯导管通过主动脉上的小切口插入。（C）使用8-0单股缝线缝合切口，并恢复血流。（D）在插入的导管上方，用5-0丝线对主动脉进行结扎。比例尺 = 5 mm。 <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55763/55763fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="体内与体外组织对比，示意图，结构差异可视化，科学研究。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55763/55763fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图2"> 
图2：术后代表性结果。 
术后第28天的大体观显示梭形腹主动脉瘤的形成。腹膜后间隙增高的边缘对应于动脉瘤的外缘（虚线；左侧）。腹主动脉的上端和下端 离体 正常（右）。比例尺 = 3 mm。 <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55763/55763fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<img alt="显示术后28天内主动脉直径增加的柱状图；数据分析结果。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55763/55763fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图3"> 
图3：通过经腹超声测量的最大主动脉直径。 
在此大鼠模型中，主动脉直径持续增加。主动脉直径以均值 ± 标准差表示（n = 12）。<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55763/55763fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="动脉壁结构的组织学示意图，显示第0天与第28天动脉瘤，包括中膜和外膜。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55763/55763fig4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Figure 4"> 
图4：经Elastica van Gieson染色的动脉瘤组织代表性图像。 
术后28天EVG染色显示中膜弹性层退变及管腔内血栓形成（右图）。第28天可见主动脉中膜弹性纤维断裂以及主动脉外膜胶原纤维稀疏。第0天为术前（左图）。比例尺 = 500 µm。 <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55763/55763fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

将聚氨酯导管插入主动脉管腔并结扎缝合主动脉，可因外膜滋养血管灌注不足而引起慢性缺氧。本文介绍了一种新型的腹主动脉瘤（AAA）动物模型，其特征与人类腹主动脉瘤相似。

外膜血管滋养管（vasa vasorum, VV）为主动脉壁提供氧气和营养。主动脉壁缺氧可导致腹主动脉扩张……

本实验的总体目标是通过诱导大鼠主动脉组织缺氧，从而启动腹主动脉瘤（AAA）的形成，并实现主动脉的进行性扩张。该方法有助于回答主动脉瘤研究领域中关于腹主动脉瘤发生与破裂机制的关键问题。该技术的主要优势在于，大鼠模型所呈现的形态学和病理学特征与人类腹主动脉瘤的特征相似。我们在研究人类腹主动脉瘤（AAA）的另一种可能性时，首次提出了该方法的构想。由于缺氧诱导手术仅通过文字描述难以掌握，因此对该方法进行可视化演示至关重要。本次操作演示将由我实验室前任博士后、血管外科医生矢田达朗（Tatsuro Yata）以及工吾弘娜（Hirona Kugo）共同完成。通过脚趾夹捏确认达到适当的镇静水平后，使用电动剃须刀剃除300至400毫克大鼠腹部的毛发，随后依次用酒精和聚维酮碘溶液对暴露的皮肤进行消毒。将大鼠仰卧位置于手术台上，并在动物眼睛上涂抹眼膏。接着，使用剪刀做腹部正中切口，用无菌纱布和伤口牵开器将腹腔内容物保持在腹腔内。使用镊子轻轻提起并撕开腹膜后组织，以分离主动脉与周围血管外组织，暴露主动脉壁。随后，在腹膜后间隙内，从左肾静脉至分叉处剥离腹主动脉下方的血管外组织。使用5-0丝线结扎从腹主动脉分出的血管，以阻断血供，结扎位置应远离主动脉，避免造成主动脉管腔狭窄。为阻断主动脉血流，在肾动脉下方和主动脉分叉上方放置血管夹。类似于在主动脉壁表面制造点状出血，从靠近肾动脉分支的主动脉夹远端5 mm处插入显微剪刀，切开主动脉前壁，然后使用24号留置针通过切口浅插入一根聚氨酯导管。将装有1 mL水的注射器连接至聚氨酯导管，并冲洗主动脉内残留的血液。接下来，将一根新的聚氨酯导管剪裁至10 mm长度，并将其完全插入主动脉管腔的切口内。调整导管的中点位置，使其与切口位置对齐，使用8-0单股缝线以间断缝合法关闭切口。使用5-0丝线和聚氨酯导管，以外科结结扎腹主动脉。当导管固定后，移除腹主动脉分叉处及肾动脉下方的血管夹，以恢复顺行血流，并确认腹主动脉搏动明显。移除纱布后，使用4-0聚丙烯缝线将腹部切口严密缝合两层，以防器官突出。随后在腹部切口处局部应用利多卡因，并将大鼠置于加热垫上持续监测，直至完全恢复。术后通过超声心动图观察扩张主动脉随时间推移的变化情况，根据标准操作规程，测量腹主动脉从内缘至外缘的最大直径。术后28天，使用手术刀通过新的腹侧切口打开腹腔，并用剪刀取下动脉瘤。将取下的主动脉置于10%中性缓冲福尔马林溶液中固定24至48小时。将主动脉组织包埋于石蜡中并按标准操作流程制备主动脉组织切片后，将固定的石蜡切片在蒸馏水中水化10分钟，随后用Verhoeff苏木精染色液孵育。Verhoeff苏木精染色液与van Gieson溶液可用于组织学实验中锈蚀和腐蚀现象的识别。因此，这些组织染色剂的新鲜程度和孵育时间对于归档及选择性染色至关重要。25分钟后，用蒸馏水冲洗切片，每次1分钟，共冲洗3次，随后在分化液中浸洗10至30次。再次用蒸馏水冲洗切片3次，将样本置于5%硫代硫酸钠溶液中1分钟。再次用水冲洗后，将样本浸入范吉森（van Gieson）染液中5分钟。接着，将组织依次浸入乙醇中进行30秒的梯度脱水，随后用二甲苯孵育2次，每次5分钟进行透明处理。然后使用共振封片介质覆盖切片，并加盖适当大小的盖玻片。这些图像显示了导管插入后28天的代表性腹主动脉瘤。 通过经腹超声检查测量主动脉的上下端，可发现导管置入后即刻直径正常且无扩张，约在置入后14天达到最大尺寸，并在实验周期结束前保持不变或略有增加。第28天动脉瘤的组织病理学分析显示，与第0天相比，弹性纤维出现明显降解。一旦掌握该技术，若操作得当，可在约一小时内完成。通过该操作步骤，还可进行体外分析等其他方法，以进一步探究个体序列功能的相关问题。该技术建立后，为腹主动脉瘤领域的研究人员探索特定患者人群中的疾病机制铺平了道路。观看本视频后，您应能够充分掌握如何在大鼠中诱导主动脉组织缺氧，从而启动腹主动脉瘤的形成并伴随进行性主动脉扩张。请勿忘记，使用外科器械可能具有极高危险性，在进行该操作时，应始终采取预防措施以避免受伤和感染。

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