Name: 一个协议来使用基因集富集分析以确定合适的动物模型转化型研究 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-16T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 35 s
Description: 学习使用基因集富集分析（GSEA）方法，通过比较动物模型与人类疾病研究的转录组数据，为转化医学研究选择合适的小鼠模型。该标准化方案可减少单基因比较带来的偏差，提高模型选择的准确性。

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本工作由德国联邦风险评估研究所（BfR）资助。

<ol><li>Seok, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+responses+in+mouse+models+poorly+mimic+human+inflammatory+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Genomic responses in mouse models poorly mimic human inflammatory diseases.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (9), 3507-3512 (2013).</li>
<li>Takao, K., Miyakawa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+responses+in+mouse+models+greatly+mimic+human+inflammatory+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Genomic responses in mouse models greatly mimic human inflammatory diseases.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (4), 1167-1172 (2015).</li>
<li>Weidner, C., Steinfath, M., Opitz, E., Oelgeschläger, M., Schönfelder, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+the+optimal+animal+model+for+translational+research+using+gene+set+enrichment+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Defining the optimal animal model for translational research using gene set enrichment analysis.</a> EMBO Mol Med. 8 (8), 831-838 (2016).</li>
<li>Subramanian, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+set+enrichment+analysis%3A+a+knowledge-based+approach+for+interpreting+genome-wide+expression+profiles%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Gene set enrichment analysis: a knowledge-based approach for interpreting genome-wide expression profiles.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (43), 15545-15550 (2005).</li>
<li>Kanehisa, M., Sato, Y., Kawashima, M., Furumichi, M., Tanabe, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((KEGG+as+a+reference+resource+for+gene+and+protein+annotation%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">KEGG as a reference resource for gene and protein annotation.</a> Nucleic Acids Res. 44 (D1), D457-D462 (2016).</li>
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<li>Croft, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Reactome+pathway+knowledgebase%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">The Reactome pathway knowledgebase.</a> Nucleic Acids Res. 42 (Database issue), D472-D477 (2014).</li>
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<li>Edgar, R., Domrachev, M., Lash, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+Expression+Omnibus%3A+NCBI+gene+expression+and+hybridization+array+data+repository%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Gene Expression Omnibus: NCBI gene expression and hybridization array data repository.</a> Nucleic Acids Res. 30 (1), 207-210 (2002).</li>
<li>Kolesnikov, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ArrayExpress+update--simplifying+data+submissions%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">ArrayExpress update--simplifying data submissions.</a> Nucleic Acids Res. 43 (Database issue), D1113-D1116 (2015).</li>
<li>Cohen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sepsis%3A+a+roadmap+for+future+research%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Sepsis: a roadmap for future research.</a> Lancet Infect Dis. 15 (5), 581-614 (2015).</li>
<li>Spinelli, L., Carpentier, S., Montanana Sanchis, F., Dalod, M., Vu Manh, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BubbleGUM%3A+automatic+extraction+of+phenotype+molecular+signatures+and+comprehensive+visualization+of+multiple+Gene+Set+Enrichment+Analyses%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">BubbleGUM: automatic extraction of phenotype molecular signatures and comprehensive visualization of multiple Gene Set Enrichment Analyses.</a> BMC Genomics. 16 (1), 814(2015).</li>
</ol>

作者声明不存在任何竞争性财务利益。

动物模型长期以来被用于研究疾病机制以及开发新的治疗策略。然而，由于一些临床试验的失败，人们对动物模型的预测性开始产生质疑12。此外，针对如何分析和解释临床前试验中产生的大规模组学数据，也出现了争议性讨论：对同一数据集采用不同的数据分析方法，得出了截然相反的结论1,2。因此，迫切需要更可靠的生物信息学技术来系统分析复杂的组学数据，以确定特定人类疾病的最优动物模型。采用目前最合适的模型不仅有助于提升转化医学研究的质量，还能通过避免与人类情况不相关的动物实验，进一步促进动物福利。
本文所述方案提供了一种标准化方法，用于系统比较不同物种的组学数据，旨在为特定人类疾病确定最佳动物模型和治疗方案。通过采用基因集富集分析（GSEA）而非单基因分析，该方案避免了与主观设定基因表达阈值及基因筛选相关的各种问题。聚焦于特定通路还可针对性地探讨所研究疾病或状况的（病理）生理过程。例如，炎症）。当然，GSEA结果的准确性取决...

动物模型因其在遗传学、解剖学和生理学方面与人类具有相似性，被广泛用于研究人类疾病。此外，动物模型通常作为临床治疗的门槛，在转化医学研究的成功中发挥着巨大影响。谨慎选择最合适的动物模型可减少误导性动物实验的数量。近年来，动物模型在转化研究中的相关性引发了争议，特别是对人类炎症性疾病及其相应小鼠模型所获得的相同数据集进行分析时，得出了相互矛盾的结论1,2。这一讨论揭示了在分析组学数据时存在一个根本性问题：需要建立标准化的系统性数据分析方法，以减少基因选择的偏倚，并提高跨物种比较的稳健性3。
传统上，转录组学数据（及其他组学数据）的分析是在单基因水平上进行的，通常包括基于严格截断参数的初始基因筛选步骤（例如，倍数变化 &#62;2.0，p 值 &#60;0.05）。然而，初始截断参数的设定往往具有主观性、随意性，且缺乏生物学依据，甚至可能导致相反的结论1,2。此外，初始基因筛选通常将分析局限于少数显著上调或下调的基因，因此敏感性不足，无法纳入大多数表达差异较小的基因。
随着21世纪初基因组学时代的兴起以及对生物通路和生物学背景的深入了解，人们开发出了一些替代性的统计学方法，以克服单基因水平分析的局限性。基因集富集分析（Gene set enrichment analysis, GSEA）4 是转录组学数据分析中广泛接受的方法之一，其利用预先定义的基因分组（例如，信号通路、染色体上的邻近位置等）。GSEA首先将所有检测到的未经筛选的基因映射到目标基因集（例如，通路）中，而不论这些基因在表达水平上的个体变化情况。因此，该方法也包含了那些表达变化幅度中等、在单基因水平分析中容易被遗漏的基因。随后，通过运行累计统计法（running sum statistics）来评估基因集内表达变化的累积效应。
尽管GSEA及相关集合富集方法在医学研究中被广泛使用，但在分析复杂的组学数据时，这些方法并非显而易见地被纳入考虑。本文介绍了一种将人类样本的组学数据与小鼠模型数据进行比较的实验方案，旨在为转化医学研究筛选出最合适的动物模型。我们以一系列用于模拟人类炎症性疾病的小鼠模型为例，展示了该方案的适用性。然而，这一分析流程并不局限于人-鼠之间的比较，也可适用于其他研究问题。

<table><tbody><tr><td>Excel</td><td>Microsoft Corporation</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

使用基因集富集分析确定转化研究中合适动物模型的方案

A Protocol for Using Gene Set Enrichment Analysis to Identify the Appropriate Animal Model for Translational Research

最近的研究通过传统基因对基因比较技术，将人类疾病的转录组数据集与小鼠模型的数据集进行对比，得出了关于动物模型在转化研究中相关性的相互矛盾的结论。不同基因表达分析之间存在差异的一个主要原因是差异表达基因的任意筛选。此外，跨物种和跨平台的单个基因比较常受到技术变异的限制，导致对人类与动物模型数据之间一致或不一致性的误判。因此，亟需标准化的系统性数据分析方法。为了克服主观的基因筛选和低效的基因对基因比较，我们近期证明了基因集富集分析（GSEA）具有避免这些问题的潜力。基于此，我们开发了一套使用GSEA的标准化操作流程，用于区分适用于或不适用于转化研究的动物模型。该流程不适用于预测如何设计新的模型系统-先验方法，因为它需要已有的实验组学数据。然而，本方案描述了如何以标准化的方式解读已有数据，从而选择最合适的动物模型，避免不必要的动物实验和误导性的转化研究。

本文展示了GSEA工作流程及示例数据的截图。图1显示了包含目标转录组数据的基因表达数据文件。每个研究都需要一个描述性表型文件，如图2所示。注释的基因集（例如，通路）在基因集数据库文件中定义（图3）。图4展示了使用GSEA软件工具的逐步操作流程。图5提供了一份示例结果报告。详细的GSEA富集分析结果汇总于图6。为了比较不同的基因表达研究，特别是人与小鼠研究之间的比较，需要使用列联表（图7）。为了可视化分析结果，图8展示了人和小鼠研究之间通路比较的相关性矩阵。
<p class=...

我们提供了一种标准化的转录组数据基因集富集分析方案，用于确定适用于转化研究的理想小鼠模型。 
该方案可用于DNA微阵列和RNA测序数据，若有相应数据，亦可进一步扩展至其他组学数据。

近期研究通过传统基因对基因的比较方法，将人类疾病的转录组数据集与小鼠模型的数据集进行比对……

本实验的总体目标是为转化医学研究问题确定合适的动物模型。该方法有助于回答转化医学研究中的一个关键问题，即：针对我想要研究的特定人类疾病，如何选择合适的动物模型？该技术的主要优势在于，能够比较动物模型与人类疾病研究之间的全基因组数据。因此，该方法避免了与单个基因比较相关的偏倚解释。尽管此方法可用于评估小鼠模型在炎症性疾病中的适用性，但也同样适用于其他疾病模型。GSEA有助于探究基因表达研究中的通路调控机制。每种动物模型和疾病研究的结果是进行进一步比较的基础。首先按照文本方案中的描述，下载软件和数据，然后进行数据处理和格式化。接着打开GSEA软件工具。单击主窗口左侧的“加载数据”按钮。将打开一个新标签页以导入所需的数据文件。在新标签页中，浏览并选择基因表达数据文件和表型文件。如果 GSEA 无法连接互联网，请加载已下载的分子特征数据库文件和 DNA 芯片注释文件。成功导入的数据将显示在数据加载部分。点击主窗口左侧的“运行 GSEA”按钮。将打开一个新标签页以设置分析参数。该标签页分为三个部分：必填字段、基本字段和高级字段。在必填字段中，首先选择表达数据集。然后选择基因集数据库，可从已连接的网站获取，或从手动导入的基因集文件中选择。编辑表型标签，以选定需要相互比较的样本组，例如疾病组与健康对照组。接下来，选择“将数据集折叠为基因符号”为“是”，以便将表达数据集中的探针标识符转换为基因集数据库中使用的官方 HUGO 基因符号。如果表达数据集已包含 HUGO 基因符号，则选择“否”。将置换次数设置为默认的 1,000 次。将置换类型更改为基因集，因为表型置换仅在每种表型包含超过七个样本时推荐使用。最后，从所连接的网站或手动导入的DNA芯片注释文件中选择用于生成基因表达数据的芯片平台。在基本参数区域，编辑分析名称以及结果保存文件夹。此外，还可以更改其他统计参数。有关参数和高级字段部分的更多详细信息，请参阅 GSEA 用户指南。如果应用了外部计算的基因表达数据分组指标，请使用 GSEA 预排序工具。该分析基于一个简单的基因列表进行，这些基因已预先分配给预先计算的分组指标，用于对基因进行排序。加载替代的基因表达文件后，转到主导航栏，点击“工具”中的“GseaPreranked”。类似地，将打开一个新标签页以设置分析参数。接下来，单击窗口右下角的“运行”按钮。在 GSEA 报告部分中，单击已成功完成的分析以打开分析结果。然后，单击 Excel 格式的详细富集结果，将分析结果导出至电子表格中。分别导出两种表型的结果。在 Excel 中将结果数据合并到一个电子表格文件中。为便于后续比较多个研究的基因表达数据，至少保留基因集名称、标准化富集评分及其 FDR 值。对第二个研究以及所有需要相互比较的后续研究重复进行基因集富集分析。应纳入尽可能多的人类临床研究和不同的小鼠模型，以确定最适合该转化研究问题的小鼠模型。为了确定最能模拟人类情况的动物模型，需将所有研究的GSEA结果相互进行比较。利用富集分数和FDR值将通路分类为激活、抑制或无显著变化。对于多个需要比较的研究，建议使用R脚本。针对每两个研究之间的比较，统计由3×3列联表所示的九种可能通路调控组合各自出现的次数。通过计算阳性预测值和阴性预测值来评估两项研究之间的相关性，其中阳性预测值和阴性预测值定义为在两项研究中显示相同调控方向的通路部分。同时，估计仅因偶然因素而预期相关的通路部分，以偶然阳性预测值（ppv chance）和偶然阴性预测值（npv chance）表示。然后计算信息增益。所有计算均可使用电子表格程序完成，但建议使用 R 函数。利用一对研究的列联表，通过卡方检验计算 P 值，例如使用 R 函数 chi-squared test 或电子表格程序。将列联表的数据存储于矩阵 X 中。随后，比较所选研究之间所有组合的 GSEA 结果。按信息增益对所有组合进行排序。对于多个数据集的比较，使用矩阵并通过彩色热图可视化结果。选择信息增益最高的动物模型。为了评估信息增益的重要性，还需考虑卡方检验。此处展示了人类与小鼠研究之间通路比较的相关性矩阵。通路调控的重叠部分表示从一项研究中获得的信息增益，可用于预测另一项研究中的效应。蓝色表示数据间相关性低，红色表示相关性高。人类与小鼠数据集的比较揭示出一组小鼠模型与人类研究具有高度相关性，因此这些小鼠模型最适合用于模拟人类情况。相比之下，第七、第八和第九项研究未显示出与人类疾病研究的相关性。一旦掌握，只要操作得当，该技术可在数天内完成。具体耗时取决于数据量及数据的可获得性。在进行该实验操作时，重要的是要牢记，实验结果的有效性取决于所选数据的质量和相关性。观看本视频后，您应能够充分理解如何根据转录组数据为特定的人类疾病选择合适的动物模型。

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使用 Gene Pulser MXcell 电穿孔系统高效转染原代细胞

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