一种通过上转换纳米粒子介导的激酶光激活远端触发细胞内信号转导的集成系统

本实验的目的是证明利用近红外辐照光激活酶的可行性。将笼锁型蛋白激酶A固定在上转换纳米颗粒表面，并将该颗粒显微注射入细胞内，随后通过近红外辐照观察活细胞中激酶诱导的响应。传统的光激活需要具有光毒性的紫外光，不可避免地会同时引发不必要的化学反应和类似响应；然而，像近红外辐照这样的温和手段因其能量较低，通常无法触发此类反应。

上转换纳米颗粒可有效将生物友好的低能量近红外光子上转换为高能量紫外光子，从而在颗粒表面触发化学反应，而无需直接的紫外光照射。激酶在肿瘤发生中起关键作用，该技术可帮助我们在显著降低紫外光毒性及其副反应带来的干扰噪声的情况下，获取更丰富的信号转导信息。通常，初涉此领域的研究人员在为上转换应用改装仪器和光学装置时会遇到困难。

首先，在荧光分光光度计的比色皿架旁安装一个4倍物镜，以便将激光聚焦于比色皿的中心位置。将一个可调谐的980纳米激光二极管以90度角置于物镜一侧。安装一个全反射镜，并使物镜与激光的光路在一点相交。

切记放置一块阳极氧化金属板，以遮挡光谱仪的激发窗口，从而保护仪器内部组件。然后将装有二氧化硅包覆上转换纳米粒子溶液的比色皿放入样品 holder 中。当激光开启时，即可观察到明亮的上转换光束。

将光谱仪切换至发光模式，并在调整过程中使用最低的光电倍增管（PMT）电压。调节反射镜和激光器平台，使光束穿过比色皿中心，以便光电倍增管接收到最强信号。安装二向色镜和激发滤光片后，在下层光路中安装一个980纳米的激光二极管。

在激光器和反射镜之间添加一个准直器，以帮助扩散并扩大近红外光在焦平面上的照射区域。然后使用上转换纳米粒子溶液来可视化近红外光束。调节激光器载物台的位置，使近红外光束居中，完成光路对准。

按照文本方案所述，进行笼锁型PKA的合成并解除笼锁型PKA/UCNP的固定，以生成笼锁型PKA/UCNP。在紫外光解前，为测定两种构建物的活性，向检测体系中加入两微升PKA溶液后，随时间测量反应混合物中NADH吸光度的减少。对PKA/UCNP重复进行该检测。

接下来，在冰水浴中对笼锁型PKA和笼锁型PKA/UCNP以每平方厘米200毫瓦的紫外光进行光解，以确保PKA能够被激活。PKA活性通过丙酮酸激酶-乳酸脱氢酶偶联酶法测定。加入PKA溶液后，随时间推移测定NADH吸光度的降低情况。

在显微注射期间，将细胞孵育于含有10%胎牛血清的L15培养基中，以在培养箱外实现稳定的pH控制。将拉针仪设置为拉制出锥形针尖，直径约为1.5微米，以便后续打开针尖。打开针尖时，将玻璃微针安装至显微注射仪，移动针尖使其接触载玻片边缘，随后轻敲显微镜载物台完成开尖。

这种振动作用力足以轻微折断针尖并扩大开口。检查针头开口，确保其外径在1.3至1.5微米之间，可通过使用40倍物镜的显微镜图像进行确认。接下来，将注射压力设定为50至75百帕，加压时间间隔为200至300毫秒，并将恒定补偿压力设定为15至30百帕，以防止培养基倒流进入针头。

将TAMRA染料标记的笼锁型PKA/UCNP复合物装载至移液针的后端位置。将装载好的移液针安装在单轴液压显微操作器上，角度保持在30度至45度之间。使用显微镜检查移液针，确保样品装载后无气泡产生。

将针头浸入培养基后，切换至荧光模式，以确认在施加注射压力时染料出现爆发式释放，而在持续施加补偿压力时染料呈缓慢释放。随后切换至相差明场模式，开始进行细胞显微注射。在成功注射过程中，可观察到细胞膜冲击波现象。

将细胞洗涤两次，并检测共注射的 TAMRA 荧光以定位成功显微注射的细胞。具有上转换纳米颗粒（UCNP）摄入但无共注射染料信号的细胞，表明细胞膜在注射过程中破裂，应从后续实验中剔除。使用980纳米激光二极管通过物镜（10倍）聚焦，在下层光路中照射细胞15分钟。

每照射五分钟，需间隔五分钟的暗期，以避免加热。如果需要更短的激活时间，例如数秒甚至亚秒级，可直接切换至40倍物镜，以获得更高的聚焦光子密度。光解及细胞恢复后，用1毫升4%多聚甲醛PBS溶液固定细胞20分钟，随后进行Alexa 594染色。

最后，观察近红外光诱导的应力纤维解聚现象。在近红外光照射后，显微注射了笼锁型PKA/UCNP的细胞（如白色箭头所示）显示出上转换发光。由于PKA成功实现了近红外光激活，导致应力纤维解聚，暴露出更多的F-肌动蛋白，从而在UCNP附近产生强烈的绿色荧光染色。

作为阴性对照，细胞经显微注射后始终保持在避光条件下，结果显示应力纤维未发生解聚。近红外光激活后，F-肌动蛋白的暴露水平可用Alexa 594染色，并通过ImageJ进行追踪和定量。沿红色箭头方向绘制F-肌动蛋白染色的强度曲线，可提供应力纤维解聚的定量信息，该信息可与近红外诱导的PKA活性相关联。一旦掌握显微注射技术，包括笼锁型PKA/UCNP的制备和质量控制在内，该方法可在一天内完成。

通过我们的仪器改装说明和实验步骤，可以利用近红外光触发所需的反应，实现与传统紫外光滴定方法相当的高时空分辨率，但避免了光毒性，且不具传染性。观看本视频后，希望您能够充分理解如何通过显微注射将酶-纳米颗粒复合物递送至细胞内，并使用与铃兼容的近红外光对酶进行光激活。该技术为化学生物学领域的研究人员铺平了道路，使其能够在活细胞中利用光触发所需的酶促反应，实现精确的时空控制，尤其适用于细胞无法耐受紫外光毒性的实验条件。

通过该方法，可将其他生物效应分子与上转换纳米颗粒相结合，以实现对需要时空特异性光激活的其他科学问题进行探究。如果生物效应分子在细胞外发挥作用，则甚至无需进行显微注射。近红外光激活平台还可实现更深的组织穿透深度，因此可用于小型动物，在特定时间和特定位置触发期望的生物学反应。