Name: 转换纳米粒子介导的激酶活化远程触发细胞内信号转导的集成系统 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 20 s
Description: 了解利用上转换纳米粒子在近红外光照射下远程激活笼状蛋白激酶A的方法。该技术可减少紫外光毒性，用于研究活细胞中的信号转导通路和肿瘤发生机制。

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感谢中国台湾“中央研究院”纳米科学与技术计划以及中国台湾科技部提供的经费支持（101-2113-M-001-001-MY2；103-2113-M-001-028-MY2）。

注意：本实验方案详细描述了上转换辅助光激活的仪器改装步骤、笼锁型PKA-UCNP的合成方法、二氧化硅包覆的UCNP及笼锁型PKA-UCNP样品的透射电子显微镜（TEM）检测、紫外光与近红外光解装置、细胞准备、PKA-UCNP的显微注射、光激活研究，以及REF52细胞的应力纤维染色方法。
1. 上转换光谱测量用荧光仪的设置
<ol>
	<li>在荧光光谱仪的比色皿支架旁安装一个4倍物镜，使激光聚焦在比色皿的中心位置。</li>
	<li>将一个可调功率为0.5至8 W、波长为980 nm的激光二极管以90°角置于物镜旁。 
	注意：操作人员需具备激光安全知识，并佩戴近红外（NIR）激光防护眼镜。</li>
	<li>在物镜与激光光路交汇处安装一个全反射镜。放置一块黑色阳极氧化金属板，以遮挡光谱仪的激发窗口，保护内部组件。</li>
	<li>将装有二氧化硅包覆上转换纳米粒子（UCNP）溶液（0.2–0.6 mg/mL）的比色皿放入比色皿支架中，以便观察到明亮的上转换发光光束，并利用该光束调整反射镜的最佳光路对准位置。</li>
	<li>将光谱仪切换至发光模式，并将光电倍增管（PMT）电压设为最低（若信号过弱，可适当调高）。调节反射镜至最佳对准状态，使光束位于比色皿中心，且PMT接收到最强信号。</li>
	<li>完成对准后，使用设定的激光功率测量上转换发光光谱。使用热电堆功率计建立激光功率与激光电源电流读数之间的校准曲线。持续监测激光器性能，确保其工作状态处于校准范围内。</li>
</ol>
2. 显微镜设置
注意：以下设置适用于配备双层光路的显微镜。如果用户计划在后端口安装激发光源切换装置，使近红外激光器与卤素灯共用同一端口，则后端口中的准直透镜会显著阻挡近红外光，因为该透镜的设计目的是减少样品加热。用户必须做出艰难选择：保留准直透镜会导致上转换效率极低，或移除准直透镜则会牺牲落射荧光激发光的强度。
注意：图中展示了改装后光谱荧光仪的光路示意图、上转换发光和近红外光解模式下的显微成像、落射荧光和紫外光解模式，以及本实验所用的实验装置。 图2.
<ol>
	<li>在荧光显微镜的后端口安装金属卤化物光源导管。 
	注意：在此上层光路中，若存在滤光片转轮，则必须留出一个空位，以允许来自下层光路的近红外光通过。</li>
	<li>在右侧端口安装可调谐的980 nm激光二极管（输出功率0.5至8.0 W），并保持侧端口准直器开启。 
	注意：当使用10倍物镜时，此设置可使激光光斑直径扩大至约500 µm。若移除该准直器，光斑将缩小至微米量级，导致近红外光照射细胞变得不切实际。该准直器对近红外光透明。</li>
	<li>在下层光路中安装二向色镜（850 nm短通）和激发滤光片（950 nm长通）。</li>
	<li>使用上转换纳米颗粒（UCNP）溶液以观察近红外光斑。调节激光位置，使近红外光束中心位于视野中央，完成光路校准。</li>
</ol>
3. 笼锁型PKA-UCNP复合物的制备与表征
<ol>
	<li>将重组PKA（9 µM）与0.5 mM 2-硝基苄基溴（NBB）在笼蔽缓冲液（20 mM Tris-HCl、100 mM NaCl和10 mM MgCl₂）中孵育2；pH 8.5）中，25 °C 下反应 1–2 小时。用 10 mM 二硫苏糖醇（DTT）淬灭过量的 NBB，然后对 4-(2-羟乙基)哌嗪-1-乙磺酸（HEPES）缓冲液（10 mM，pH 7.5）透析，以去除过量试剂和盐分。 
	注意：在使用 HEPES（pH 7.5）进行透析时，笼锁溶液的 pH 值从 8.5 降至 7.5，以用于后续的固定化反应。</li>
	<li>混合镧系盐-Y(CH3一氧化碳2)3 水合物（99.9%，0.4527 g，1.38 mmol），Yb(CH3CO2)3 水合物（99.9%，0.2533 g，0.60 mmol）和 Tm(CH3CO2)3 水合物（99.9%，0.0168 g，0.02 mmol）溶于十八烯（30 mL）和油酸（12 mL）中，将混合物加热至115 °C并保持30分钟，随后冷却至50 °C。接着，将反应混合物溶于甲醇溶液（20 mL）中，加入0.2 g（5.0 mmol）NaOH颗粒和0.2964 g（8 mmol）氟化铵，超声处理15分钟使其溶解。随后将反应温度升至300 °C，以获得UCNP核（β-NaYF₄）41.0% Tm3+/30% Yb3+）纳米颗粒。</li>
	<li>将核纳米颗粒（25 mg）溶于环己烷（10 mL）中，并加入CO-520（0.5 mL）。随后加入氨水（质量分数30%，v/v，0.08 mL）和正硅酸乙酯（TEOS，0.04 mL），在室温下持续搅拌反应12 h，得到二氧化硅包覆的β-NaYF₄纳米颗粒。41.0% Tm3+/30%Yb3+ 核心纳米颗粒</li>
	<li>将PKA（6 nmol）或笼锁型PKA（6 nmol）与UCNP（1 mg）共同孵育15 在4 °C下，用HEPES缓冲液（10 mM，pH 7.5）孵育3小时，以将PKA固定在二氧化硅包覆的UCNP上 通过 静电相互作用。</li>
	<li>使用 PVDF 滤膜（0.45 µm）过滤混合物，在 4 °C 条件下以 17,000 × g 离心 10 分钟，将沉淀重悬于含 0.1% 蛋白稳定剂的 HEPES 缓冲液（50 µL，10 mM，pH 7.5）中，得到纯化的 PKA-UCNP 复合物。在 4 °C 条件下以 17,000 × g 再次离心 10 分钟，收集上清液，转移至 1.5 mL 离心管中进行 Bradford 法蛋白定量。</li>
	<li>分析步骤 3.5 保存的上清液中未结合的 PKA，使用 Bradford 法测定，以反推 UCNP 颗粒上的 PKA 偶联水平。UCNP 颗粒的 PKA 偶联水平通常约为每毫克颗粒 4.5 nmol。 
	注意：Bradford 法检测显示沉淀呈现明显的蓝色，表明蛋白质固定化程度高且稳定，无脱附现象；而包封 PKA-UCNP 溶液的上清部分颜色与 HEPES 缓冲液相似图4c-4e).</li>
</ol>
4. 表征
注意：激酶活性检测用于定量丙酮酸激酶的特异性活性。简而言之，该检测利用与丙酮酸激酶和乳酸脱氢酶偶联的肽段发生磷酸化反应，导致NADH被氧化。通过测定NADH在340 nm处吸光度的下降，可监测NADH的消耗情况。
<ol>
	<li>在总体积为 60 µL 的测定混合液中测定 PKA 和 PKA-UCNP 的活性，该混合液包含 4-吗啉丙磺酸（MOPS，100 mM，pH 7.5）、KCl（100 mM）、磷酸烯醇式丙酮酸（PEP，1 mM）、三磷酸腺苷（ATP，1 mM）、还原型β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH，0.8 mM）、氯化镁（MgCl2，1 mM）、kemptide（0.4 mM）以及丙酮酸激酶/乳酸脱氢酶混合物（PK/LDH，30/40 单位）。</li>
	<li>向测定混合液中加入 PKA 溶液（2 µL）后，测定 NADH 吸光度随时间的降低情况。通过计算直线斜率来直接反映所测激酶的活性。</li>
	<li>测定 PKA-UCNP15 的活性及其总活性，其结果应与天然 PKA 特异性活性与计算所得表面包被 PKA 量的乘积高度一致。</li>
</ol>
5. 光解装置
<ol>
	<li>使用热电堆传感器测量所有光源的功率，并计算功率密度（PD = 功率（W）/面积（cm²））2))18 基于光斑面积。</li>
	<li>执行 体外 在配备365 nm LED（200 mW/cm²）的商用系统上进行紫外光解实验2)15.</li>
	<li>在显微镜载物台上进行紫外光激活时，使用商用滤光立方体过滤激发光后照射PKA-UCNP溶液15. 
	注意：功率密度约为 15 mW/cm²2，无需物镜聚焦。</li>
	<li>对于 体外 在显微镜载物台上进行近红外光激活，使用980 nm激光照射PKA-UCNP溶液，激光光路中安装定制的上转换滤光片/反射镜设置，搭配二向色镜（850 nm短通）和激发滤光片（950 nm长通）。 
	注意：输出功率密度为 5 W/cm2 在使用4倍物镜聚焦前，功率密度估计约为 ~ 68 W/cm2 4倍物镜聚焦后。</li>
</ol>
6. 细胞样品制备及PKA-UCNP复合物的显微注射
<ol>
	<li>在PKA固定化后（步骤3.5），通过0.45 µm滤膜对样品进行预过滤。</li>
	<li>在显微注射期间，将细胞孵育于含10%胎牛血清（FBS）的L-15培养基中，以在培养箱外实现稳定的pH控制。 
	注意：为确认显微注射完成，可将天然PKA-UCNP、笼锁型PKA-UCNP或聚乙二醇化UCNP（7.5 mg/mL）15 与5(6)-羧基四甲基罗丹明（TAMRA）（10 µM）共注射入细胞中。</li>
	<li>调整PKA-UCNP颗粒的浓度，使得显微注射后细胞质中PKA的浓度达到1–3 μM——此为细胞内PKA的生理浓度范围，假设注射体积为细胞体积的1/10。</li>
	<li>使用与单轴液压显微操作器耦合的显微注射仪对细胞进行显微注射（步骤6.2）（图3）。</li>
	<li>使用数字压力计监测显微注射仪施加的压力是否处于工作范围（约50–200 hPa），并将分配阀密封于定制的加压室中，以提供显微注射所需的补偿压力。使用拉针仪回拉注射针。</li>
	<li>维持注射压力在50–75 hPa之间，注射时间为200–300 ms，补偿压力设为15 hPa，以防止培养基因毛细作用倒流进入针头。</li>
	<li>检查注射针尖端开口，确保其外径在1.3–1.5 µm之间，可通过使用40倍物镜拍摄图像进行确认。</li>
	<li>显微注射后，用2 mL含10% FBS的L-15培养基洗涤细胞。观察来自5(6)-羧基四甲基罗丹明（TAMRA）的细胞荧光成像，以确认显微注射完成。</li>
</ol>
7. 在活细胞中使用紫外光或近红外光解笼激活PKA-UCNP
<ol>
	<li>在PKA-UCNP显微注射后进行紫外光激活时，将REF52细胞培养于3.5 µm培养皿中，置于显微镜载物台上，使用滤光立方体过滤后的紫外光照射3分钟，无需物镜聚焦。 
	注意：REF52细胞在含10%胎牛血清（FBS）的DMEM培养基中，于37 °C、5% CO2培养箱中培养，每2-3天当细胞融合度达到90%时进行传代。</li>
	<li>在PKA-UCNP显微注射后进行近红外光激活时，根据步骤5.4所述，从下层滤光片/反射镜设置处用980 nm激光照射细胞。 
	注意：在10X物镜聚焦前，激光功率密度为5 W/cm2，经10X物镜聚焦后估计可达300 W/cm2。上转换过程需要高光子密度，尤其是在需要较大反斯托克斯位移时，因此光激活过程中需要聚焦。</li>
	<li>当需要较大光斑（650 µm × 520 µm）时，使用配备准直器的10X物镜聚焦近红外光照射细胞15分钟。每照射5分钟，需间隔5分钟暗期，以避免过热。 
	注意：当需要高空间分辨率（亚细胞级光斑）时，可在导光管出口端安装针孔，并使用40X物镜产生亚细胞尺度的光斑（5 µm × 4 µm）。在此情况下，由于光子通量高，仅需1秒照射即可完成近红外光激活。</li>
	<li>紫外或近红外光解后，将细胞在37 °C、5% CO2培养箱中，于完全培养基中恢复1小时，以诱导细胞响应。随后用1 mL 4%多聚甲醛/磷酸盐缓冲液（PBS）固定20分钟，再进行后续染色。 
	警告：多聚甲醛具有高度毒性，避免接触皮肤、眼睛或黏膜；在称量和配制过程中避免吸入粉末。</li>
</ol>
8. 近红外光激活导致的应力纤维解聚的可视化
<ol>
	<li>固定后，使用 Alexa 594-鬼笔环肽（将 5 µL 的 6.6 µM 储存液加入 200 µL PBS 中用于染色；室温孵育 25 分钟）对细胞中的张力纤维进行染色和可视化。使用滤光片组在激发波长 581 nm、发射波长 609 nm 条件下观察 Alexa 594-鬼笔环肽的荧光图像。</li>
	<li>将细胞在室温下用 4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）孵育 5 分钟。染色完成后，用 PBS 洗涤样品，并分别采集张力纤维和细胞核的荧光图像。</li>
</ol>

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</ol>

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

此前，Hofmann 及其同事发现，在将游离的 PKA 显微注射到 REF52 细胞后，可观察到显著的形态学变化19在另一项研究中，Lawrence 团队证明了笼锁型 PKA 可被激活 体内，导致在紫外线光解作用下发生形态学改变及应力纤维解体20早期关于利用上转换紫外光进行光活化的报道表明，可通过上转换纳米粒子辅助实现多种笼锁小分子生物效应物的活化21,22,23然而，利用上转换纳米颗粒（UCNP）辅助的光激活技术作用于最重要的一类生物效应分子——酶——的实验方案仍有待建立。因此，本研究中，我们描述了一种包含利用UCNPs实现近红外光激活笼锁型蛋白激酶A（PKA）的细胞实验方案。在此近红外光激活平台中，笼锁型PKA20 固定在二氧化硅包覆的上转换纳米颗粒（UCNPs）表面的物质被用于验证利用近...

已开发出可光激活的化学修饰蛋白（例如，PKA 笼锁蛋白），作为化学生物学中的新兴领域，用于非侵入性地调控细胞内生化过程1,2,3。利用光作为刺激手段，在激活这些笼锁蛋白时可实现优异的空间和时间分辨率。然而，紫外光可能引起细胞不必要的形态变化、凋亡以及DNA损伤4,5。因此，近年来在光笼基团的设计中，研究重点集中在实现长波长或双光子激发下的光裂解，以降低光毒性并增强在深层组织中的穿透能力6,7。响应长波长的笼锁基团使我们能够在存在两种或多种笼锁基团时，选择合适的解笼波长（即，通道），从而选择性地激活生物效应分子7。鉴于这些有益特性，开发新型红光响应光笼基团是光化学方法学中一项重要的前期工作，广泛应用于从反应机制探究到细胞活动调控等各类生物学研究8。然而，双光子笼锁基团通常因稠合芳香环结构而过于疏水，而可见光响应的笼锁基团通常为有机金属化合物，含有芳香配体。这种疏水性/芳香性特征在生物效应分子为蛋白质或酶时不适用，因为它会导致酶/蛋白质的活性位点变性，进而造成功能丧失，即使在化学层面上偶联和光解反应仍能进行2,9。
上转换纳米颗粒（UCNPs）是有效的能量转换器，可将近红外（NIR）激发光转化为紫外光。UCNPs 这一独特而引人注目的特性，为解决与光激活及小分子可控释放相关的挑战提供了切实可行的方案，这些小分子包括叶酸10、顺铂衍生物11、DNA/siRNA12、共聚物囊泡13和中空颗粒14。然而，据我们所知，目前尚未有研究测试 UCNP 辅助的酶或蛋白质光激活。由于尚无成功利用红光或近红外光实现酶光激活的先例，我们尝试开展近红外触发的蛋白/酶结构激活研究，该结构由化学修饰的笼锁型酶复合物与二氧化硅包覆的镧系掺杂上转换纳米颗粒（UCNP）组成15。在本研究中，UCNP 与一种快速反应的信号转导激酶——笼锁型蛋白激酶 A（PKA）相偶联。PKA 通过细胞质中环磷酸腺苷（cAMP）的调控，控制糖原合成和细胞骨架调节，从而响应外界刺激16。我们研究了在近红外照射后，通过细胞实验实现酶在时间和空间上的可控激活的可行性。该 UCNP 辅助的光激活平台是一种利用近红外光激活酶的新方法，避免了传统紫外照射引起的细胞非特异性信号转导反应2,4。
大分子生物效应物的转位非常困难 例如， 蛋白质）穿过细胞膜以调控细胞活动。尽管固定在颗粒上的蛋白质可能更易于通过内吞作用转运至细胞质，但内吞作用可能导致蛋白质被内体捕获，进而遭受溶酶体降解而受损或破坏2,4即使笼锁蛋白在跨膜转运后仍具有功能，其转运量可能不足以引发细胞反应2,17与之形成鲜明对比的是，显微注射是一种将大分子生物效应物直接且定量递送至细胞质的有效方法。此外，固定在上转换纳米颗粒（UCNP）上的生物效应物需要上转换光来激活，因此光学仪器需进一步改造，以实现对上转换光的检测、成像和利用。本文将详细描述利用显微注射技术将笼锁型PKA-UCNP复合物递送至细胞内，并介绍实现近红外光激活所必需的光谱学与显微镜系统的改造步骤。

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;试剂&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>三（羟甲基）氨基甲烷</td><td>Sigma</td><td>154563</td><td></td></tr><tr><td>六水合氯化镁</td><td>Sigma</td><td>M9272</td><td></td></tr><tr><td>MOPS</td><td>Sigma</td><td>M1254</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>氯化钠&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>31434</td><td></td></tr><tr><td>氯化钾</td><td>Sigma</td><td>12636</td><td></td></tr><tr><td>乙酸钇&amp;nbsp;水合物</td><td>Sigma</td><td>326046</td><td>Y(C&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;H&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;)&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt; &amp;middot; xH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td></tr><tr><td>三水合乙酸铥</td><td>Alfa Aesar</td><td>14582</td><td>Tm(CH&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;)&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt; &amp;middot; xH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td></tr><tr><td>四水合三水合乙酸镱</td><td>Sigma</td><td>326011</td><td>Yb(C&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;H&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;O&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;)&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt; &amp;middot; 4H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td></tr><tr><td>1-十八碳烯</td><td>Sigma</td><td>O806</td><td></td></tr><tr><td>油酸</td><td>Sigma</td><td>364525</td><td></td></tr><tr><td>甲醇&amp;nbsp;</td><td>macron</td><td>304168</td><td></td></tr><tr><td>氢氧化钠</td><td>Sigma</td><td>30620</td><td></td></tr><tr><td>氟化铵</td><td>J.T.Baker</td><td>69804</td><td></td></tr><tr><td>IGEPAL&amp;nbsp;CO-520</td><td>Sigma</td><td>238643</td><td></td></tr><tr><td>环己烷</td><td>J.T.Baker</td><td>920601</td><td></td></tr><tr><td>氢氧化铵（28% - 30%）</td><td>J.T.Baker</td><td>972101</td><td>氨</td></tr><tr><td>正硅酸四乙酯（TEOS）</td><td>Sigma</td><td>8658</td><td></td></tr><tr><td>二硫苏糖醇（DTT）</td><td>Sigma</td><td>D0632</td><td></td></tr><tr><td>N-羟基马来酰亚胺（NHM）</td><td>Sigma</td><td>226351</td><td>PKA 活性阻断试剂</td></tr><tr><td>猪胶原蛋白来源的 Prionex 蛋白稳定剂溶液</td><td>Sigma</td><td>81662</td><td>蛋白稳定剂溶液</td></tr><tr><td>2-硝基苄基溴（NBB）</td><td>Sigma</td><td>107794</td><td>PKA 笼锁试剂</td></tr><tr><td>8-(4-氯苯基硫代)腺苷 3&amp;prime;,5&amp;prime;-环磷酸单钠盐</td><td>Sigma</td><td>C3912</td><td>8-CPT-cAMP</td></tr><tr><td>兔骨骼肌来源的丙酮酸激酶/乳酸脱氢酶酶</td><td>Sigma</td><td>P0294</td><td>PK/LDH</td></tr><tr><td>腺苷 5'-三磷酸二钠</td><td>Sigma</td><td>A2387</td><td>ATP</td></tr><tr><td>&amp;beta;-NADH 二钾盐还原型</td><td>Sigma</td><td>N4505</td><td></td></tr><tr><td>磷酸烯醇式丙酮酸</td><td>Sigma</td><td>P7127</td><td>PEP</td></tr><tr><td>考马斯亮蓝蛋白检测试剂，950 mL</td><td>Thermo Scientific</td><td>23200</td><td>Bradford 检测试剂</td></tr><tr><td>cAMP 依赖性蛋白激酶</td><td>Promega</td><td>V5161</td><td>PKA 活性对照</td></tr><tr><td>pET15b-PKACAT 质粒</td><td>Addgene</td><td>#14921</td><td></td></tr><tr><td>pKaede-MC1 质粒</td><td>CoralHue</td><td>AM-V0012</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液（PBS），pH 7.4</td><td>Thermo Scientific</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>DMEM，高糖，含丙酮酸</td><td>Gibco</td><td>12800-017</td><td>细胞培养基</td></tr><tr><td>Leibovitz L-15 培养基</td><td>Biological Industries</td><td>01-115-1A</td><td>细胞培养基</td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Biological Industries</td><td>04-001-1A</td><td></td></tr><tr><td>多聚甲醛</td><td>ACROS</td><td>416785000</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>D1306</td><td>细胞核染色染料</td></tr><tr><td>Alexa 594-鬼笔环肽</td><td>Invitrogen</td><td>A12381</td><td>F-肌动蛋白染色染料</td></tr><tr><td>5(6)-羧基四甲基罗丹明&amp;nbsp;</td><td>Novabiochem</td><td>8.51030.9999</td><td></td></tr><tr><td>Pierce 考马斯亮蓝（Bradford）蛋白检测试剂盒</td><td>Thermo Scientific</td><td>23200</td><td></td></tr><tr><td>CelluSep T4 透析管/标称滤膜截留分子量 12,000 - 14,000 Da</td><td>Membrane Filtration Products, Inc.</td><td>1430-33</td><td>透析膜</td></tr><tr><td>Millex-HV 注射器滤器，0.45 &amp;micro;m，PVDF，13 mm，γ 射线灭菌</td><td>EMD Milipore</td><td>SLHVX13NL</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;设备&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>动态光散射/ζ电位 Zetasizer nano-ZS</td><td>Malvern</td><td>M104</td><td></td></tr><tr><td>透射电子显微镜</td><td>JEOL</td><td>JEM-1400</td><td></td></tr><tr><td>荧光分光光度计</td><td>Agilent Technologies</td><td>10075200</td><td>Cary Eclipse&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>紫外-可见分光光度计</td><td>Agilent Technologies</td><td>10068900</td><td>Cary 50&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>荧光显微镜</td><td>Olympus</td><td>IX-71</td><td></td></tr><tr><td>950 nm 长通滤光片&amp;nbsp;</td><td>Thorlabs</td><td>FEL0950</td><td></td></tr><tr><td>850 nm 短通二向色镜</td><td>Chroma</td><td>NC265609</td><td></td></tr><tr><td>RT3 彩色 CCD 系统</td><td>SPOT</td><td>RT2520</td><td></td></tr><tr><td>荧光照明系统</td><td>PRIOR</td><td>Lumen 200</td><td></td></tr><tr><td>980 nm 红外二极管激光器</td><td>CNI</td><td>MDL-N-980-8W</td><td></td></tr><tr><td>UV LED 点光源</td><td>UVATA</td><td>UVATA-UPS412</td><td>配备 365 nm UPH-056 LED，输出功率 200 mW/cm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>热电堆传感器</td><td>OPHIR</td><td>12A-V1-ROHS</td><td></td></tr><tr><td>Picospritzer III</td><td>Parker Hannifin</td><td>052-0500-900</td><td>细胞内微量注射分配系统</td></tr><tr><td>PC-10 玻璃毛细管拉制仪</td><td>Narishige</td><td>PC-10</td><td></td></tr><tr><td>MANOMETER 数字压力计</td><td>Lutron</td><td>PM-9100</td><td></td></tr><tr><td>单轴液压显微操作器</td><td>Narishige</td><td>MMO-220A</td><td></td></tr><tr><td>Heraeus Fresco 17 制冷离心机</td><td>Thermo Scientific</td><td>75002421</td><td></td></tr></tbody></table>

一种通过上转换纳米粒子介导的激酶光激活远端触发细胞内信号转导的集成系统

An Integrated System to Remotely Trigger Intracellular Signal Transduction by Upconversion Nanoparticle-mediated Kinase Photoactivation

上转换纳米粒子（UCNP）介导的光激活是一种远程控制生物效应分子的新方法，具有更低的光毒性并可实现更深的组织穿透。然而，目前市场上的仪器尚不能直接适用于上转换应用，因此对商用仪器进行改造对该研究至关重要。本文首先介绍了对常规荧光分光光度计和荧光显微镜的改造方法，使其适用于光子上转换实验。随后描述了固定在UCNP复合物上的近红外（NIR）触发型笼锁蛋白激酶A催化亚基（PKA）的合成过程，并报道了显微注射和近红外光激活实验的操作参数。将笼锁PKA-UCNP复合物显微注射至REF52成纤维细胞后，近红外照射能高效激活活细胞内的PKA信号转导通路，其效果显著优于传统的紫外光照射。此外，通过设置阳性和阴性对照实验，证实了NIR照射特异性地触发了由PKA介导并导致应力纤维解聚的信号通路。因此，利用蛋白质修饰的UCNP为远程控制光调控细胞实验提供了一种创新性策略，尤其适用于需要避免直接紫外光暴露的研究场景。

笼状酶-上转换纳米粒子（UCNP）结构的设计如图1所示。首先将PKA酶与2-硝基苄基溴反应，生成无活性的笼状PKA，随后通过静电作用将其固定在UCNP表面。UCNP发射上转换光，进而光解Cys 199和Cys 343位点上的邻硝基苄基基团，释放出具有活性的PKA。透射电子显微镜（TEM）图像和Bradford测定证实，PKA及笼状PKA已成功固定于UCNP表面，并对紫外光激活后的笼状PKA-UCNP溶液进行了激酶活性检测（图4）。PKA固定后，动态光散射仪测得PKA-纳米粒子复合物的粒径为120 nm，zeta电位为-16.0 mV。PKA-UCNP溶液的Bradford测定显示粒子呈现明显的紫色，表明蛋白质固定水平高且稳定。
在细胞实验中，选择REF52大鼠胚胎成纤维细胞用于研究光激活效应。本实验中，蛋白激酶A（PKA）通路可通过内...

在本实验方案中，将细胞信号转导生物效应分子——笼锁型蛋白激酶A（PKA）固定于纳米颗粒表面，显微注射至细胞质中，并通过近红外光（NIR）照射产生的上转换紫外光进行激活，从而诱导细胞质内下游应力纤维的解聚。

上转换纳米粒子（UCNP）介导的光激活是一种远程控制生物效应分子的新方法，具有光毒性显著降低和组织穿透深度更高等优势……

本实验的目的是证明利用近红外辐照光激活酶的可行性。将笼锁型蛋白激酶A固定在上转换纳米颗粒表面，并将该颗粒显微注射入细胞内，随后通过近红外辐照观察活细胞中激酶诱导的响应。传统的光激活需要具有光毒性的紫外光，不可避免地会同时引发不必要的化学反应和类似响应；然而，像近红外辐照这样的温和手段因其能量较低，本身无法触发此类反应。上转换纳米颗粒可有效将生物友好的低能量近红外光子上转换为高能量紫外光子，从而在颗粒表面触发化学反应，而无需直接的紫外光照射。激酶在肿瘤发生过程中起关键作用，该技术可帮助我们在显著降低紫外光毒性及其副反应干扰噪声的情况下，获取更丰富的信号转导信息。通常，初涉该领域的研究人员在针对上转换应用进行仪器改装和光学系统搭建时会遇到困难。首先，在荧光光谱仪的比色皿支架旁安装一个 4 倍物镜，以便将激光聚焦于比色皿的中心位置。将一个可调谐的 980 纳米激光二极管以 90 度角置于物镜一侧。安装一个全反射镜，并使物镜与激光的光路在一点相交。切勿忘记放置一块阳极氧化金属板，以遮挡光谱仪的激发窗口，从而保护其内部部件。然后将装有二氧化硅包覆上转换纳米粒子溶液的比色皿放入样品架中。当激光开启时，即可观察到明亮的上转换光束。将光谱仪切换至发光模式，并在调整过程中使用最低的光电倍增管（PMT）电压。调节反射镜和激光器平台，使光束穿过比色皿中心，以便光电倍增管接收到最强信号。安装二向色镜和激发滤光片后，在下层光路中安装一个980纳米的激光二极管。在激光器和反射镜之间添加一个准直器，以帮助扩散并扩大近红外光在焦平面上的照射区域。然后使用上转换纳米粒子溶液来可视化近红外光束。调节激光器载物台的位置，使近红外光束居中，完成光路校准。按照文本方案中所述，进行笼锁型PKA的合成并解除笼锁型PKA/UCNP的固定，以生成笼锁型PKA/UCNP。在紫外光解前，为测定两种构建物的活性，向测定混合物中加入两微升PKA溶液后，随时间测量测定混合物中NADH吸光度的减少。对PKA/UCNP重复该测定。接下来，在冰水浴中对笼状PKA和笼状PKA/UCNP进行紫外光解，光照强度为200毫瓦每平方厘米，以确保PKA能够被激活。PKA活性通过丙酮酸激酶-乳酸脱氢酶偶联酶法测定。加入PKA溶液后，随时间推移测定NADH吸光度的降低情况。在显微注射期间，将细胞孵育于含有10%胎牛血清的L15培养基中，以在培养箱外实现稳定的pH控制。将拉针仪设置为拉制出锥形尖端，直径约为1.5微米，以便后续打开尖端。打开尖端时，将玻璃针安装在显微注射仪上，使针尖接触载玻片边缘，然后轻轻敲击显微镜载物台完成开尖。这种振动足以使针尖轻微断裂并扩大开口。检查针头开口，确保其外径在1.3至1.5微米之间，可通过使用40倍物镜的显微镜图像确认。接下来，将注射压力设定为50至75百帕，加压间隔为200至300毫秒，并将恒定补偿压力设定为15至30百帕，以防止培养基倒流进入针头。将TAMRA染料标记的笼状PKA/UCNP复合物装载至移液针的后端位置。将装载好的移液针安装在单轴液压显微操作器上，角度保持在30度至45度之间。使用显微镜检查移液针，确保样品装载后无气泡产生。将针头浸入培养基后，切换至荧光模式，以确认在施加注射压力时染料迅速释放，而在持续施加补偿压力时染料缓慢释放。随后切换至相差明场模式，开始进行细胞显微注射。在成功注射的情况下，可观察到细胞膜冲击波现象。将细胞洗涤两次，并检测共注射的TAMRA荧光以定位成功显微注射的细胞。具有UCNP进入但无共注射染料信号的细胞，表明细胞膜在注射过程中破裂，应从后续实验中剔除。使用980纳米激光二极管通过物镜（10倍）聚焦在下层光路，对细胞照射15分钟。每次照射5分钟后，留出5分钟暗期以避免过热。若需要更短的激活时间，例如数秒甚至亚秒级，可直接切换至40倍物镜以获得更高的聚焦光子密度。光解作用及细胞恢复后，用1毫升含4%多聚甲醛的PBS溶液固定细胞20分钟，随后进行Alexa 594染色。最后，观察近红外光诱导的应力纤维解聚现象。经近红外光照射后，显微注射了笼锁型PKA/UCNP的细胞（如白色箭头所示）显示出上转换发光。由成功实现的PKA近红外光激活所导致的应力纤维解聚，暴露出更多的F-肌动蛋白，从而在UCNP附近产生强烈的绿色荧光染色。作为阴性对照，细胞经显微注射后保持避光，结果显示应力纤维未发生解体。近红外光激活后，可用Alexa 594对F-肌动蛋白暴露水平进行染色，并通过ImageJ进行追踪和定量分析。沿红色箭头方向绘制F-肌动蛋白染色的强度曲线，可提供应力纤维解体的定量信息，该信息可与近红外诱导的PKA活性相关联。一旦掌握显微注射技术，包括笼锁型PKA/UCNP的制备与质量控制在内，该方法可在一天内完成。通过我们的仪器改装说明和实验步骤，可以利用近红外光触发所需的反应，实现与传统紫外光滴定方法相当的高时空分辨率，但避免了光毒性，且不具传染性。观看本视频后，希望您能够充分理解如何通过显微注射将酶-纳米颗粒复合物递送至细胞内，并使用与铃声兼容的近红外光对酶进行光激活。该技术为化学生物学领域的研究人员开辟了新途径，使其能够在活细胞中利用光触发所需的酶促反应，实现精确的时空控制，尤其适用于细胞无法耐受紫外光所致光毒性的实验条件。通过该方法，可将其他生物效应分子与上转换纳米颗粒结合，以实现对需要时空特异性光激活的其他科学问题进行探究。若该生物效应分子在细胞外发挥作用，则甚至无需进行显微注射。近红外光激活平台还可实现更深的组织穿透深度，因此可在小型动物中应用，以在特定时间和特定位置触发期望的生物学反应。

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科研

JoVE Journal

Bioengineering

生物工程

转换纳米粒子介导的激酶活化远程触发细胞内信号转导的集成系统

多光子显微镜能够调控低能量光子，实现深层光学穿透并降低光毒性。我们介绍了该技术在斑马鱼胚胎活细胞标记中的应用。该方案可轻松适用于多种光响应分子的光诱导实验。...

活体斑马鱼胚胎中的双光子诱导光激活

本视频介绍了BiFC-PALM技术——即光激活定位显微镜与双分子荧光互补技术的结合，用于检测蛋白质-蛋白质相互作用。双分子荧光互补（BiFC）技术涉及将两种目标相互作用蛋白分别与两个荧光蛋白片段融合。当这两个蛋白发生相互作用时，荧光蛋白片段被拉近至彼此邻近的位置，从而能够结合并重建出具有功能的完整荧光蛋白。通过PALM技术，可在单分子水平上对细胞内单个荧光分子的荧光信号进行精确定位。...

双分子荧光互补偶联光激活定位显微镜技术

我们展示了如何利用荧光光激活定位显微技术（FPALM）同时对细胞内多种荧光标记的分子 进行成像。所述技术可在单个细胞内实现数千至数十万个荧光标记蛋白的定位，精密度达到数十纳米 。...

同时多色成像生物结构的荧光光激活定位显微技术

有机染料分子和油酸包覆的上转换纳米颗粒不溶于水。本方案描述了一种“即插即用”方法，可将有机染料分子和上转换颗粒从其初始的疏水溶剂转移至水中。...

一种“即插即用”方法制备含两亲性聚合物、有机染料和上转换纳米粒子的水分散性纳米组装体

本方案描述了一种光遗传学策略，用于在细胞分化及Xenopus胚胎发育过程中调控丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）的活性。该方法可在哺乳动物细胞培养以及多细胞活体生物（如Xenopus胚胎）中以高时空分辨率可逆地激活MAPK信号通路。...

光介导的细胞分化及Xenopus胚胎发育过程中丝裂原活化蛋白激酶通路的可逆调控

本方案描述了一种基于成像的T淋巴细胞激活方法，该方法利用光激活型肽-MHC实现对T细胞激活的精确时空控制。...

利用光激活型激动剂实现T细胞活化的时空控制

本文介绍了一种通过光遗传学控制和活细胞监测基因表达来分析细胞间振荡信息传递的实验方案。该方法为在多细胞系统中检验动态基因表达程序的功能意义提供了独特的研究平台。...

一种控制和分析细胞间相互作用中基因表达模式的光遗传学方法

本文介绍了一种在头部固定的活动小鼠中可视化蛋白激酶A活性的方法。通过颅窗将改良的A激酶活性报告基因tAKARα在皮层神经元中表达并实现成像。利用双光子荧光寿命成像显微技术，在强制运动过程中体内可视化PKA活性。...

使用活体双光子荧光寿命成像显微技术在头部固定行为小鼠中可视化蛋白激酶A活性

通过与共聚焦显微镜耦合，高度聚焦的飞秒激光能够实现对细胞的精确刺激，从而实现实时观察与光刺激。该光刺激可激活细胞内的分子事件，包括ERK信号通路以及活性氧的线粒体闪光。...

飞秒激光光刺激在靶细胞中激活细胞外信号调节激酶（ERK）信号通路或线粒体事件

生物发光是指荧光素酶氧化小分子底物（荧光素）所发出的光，可用于激活光感应蛋白，从而为光刺激增加一个新的维度，并能够在时间和空间尺度上调控细胞中多种由光介导的功能。...

生物发光光遗传学2.0：利用生物发光激活光感受蛋白 体外 和 体内

本方案涉及转染cAMP传感器和一种光遗传学蛋白bPAC-nLuc，以精确追踪其在细胞内的分布及对光刺激的响应。利用点扫描系统构建cAMP响应图谱的创新方法，有望推动光遗传学蛋白在不同研究领域的应用进展。...

使用光刺激网格绘制光遗传学蛋白的细胞分布图

了解利用上转换纳米粒子在近红外光照射下远程激活笼状蛋白激酶A的方法。该技术可减少紫外光毒性，用于研究活细胞中的信号转导通路和肿瘤发生机制。

一种通过上转换纳米粒子介导的激酶光激活远端触发细胞内信号转导的集成系统

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