小鼠乳腺组织中缝隙连接、紧密连接和黏附连接组分间蛋白质相互作用及共定位分析

本方法的总体目标是确定两种或多种细胞间连接蛋白是否在细胞内共定位，并通过共免疫沉淀进一步评估它们之间的物理相互作用。该方法有助于解答乳腺生物学领域中的一些关键问题，包括连接结构在正常发育以及乳腺癌等疾病中的作用。该技术的主要优势在于能够以相对较低的成本提供有关体内蛋白质-蛋白质相互作用的重要信息。

进行共免疫荧光染色时，从冰箱中取出相应的显微切片。立即将切片浸入4%多聚甲醛中，在室温下固定15分钟。随后，将切片浸入磷酸盐缓冲液中，于室温下处理。

将切片留在原处，直至进行下一步操作。使用市售的疏水屏障或防水记号笔在切片周围画圈。立即向组织上滴加 PBS 液滴，并将切片置于人体组织学染色缸中，完成后续步骤。

每个组织切片用 100 至 200 微升含 3% 牛血清白蛋白的 Tris 缓冲盐水（含 0.1% 吐温-20）在室温下封闭 30 分钟。在样本封闭的同时，将一抗和二抗用含 0.1% 吐温-20 的 Tris 缓冲盐水稀释，配制抗体溶液。吸除封闭液后，将切片与 100 至 200 微升稀释后的一抗溶液在室温下孵育 60 分钟。

然后用抽吸法移除一抗溶液，加入250至500微升含0.1%吐温-20的TBS缓冲液，洗涤5分钟。抽吸弃去洗涤液，重复洗涤两次。最后一次抽吸除去洗涤液后，加入100至200微升相应的Fluoro-4标记的二抗溶液，在室温下孵育60分钟。

吸去二抗溶液后，用 250 至 500 微升含 0.1% 吐温-20 的 TBS 缓冲液洗涤切片 5 分钟。移除洗涤液，并重复此步骤两次。针对其他目标蛋白，使用相应的一抗和二抗组合，重复上述步骤。

最后一次洗涤去除后，将切片与100至200微升浓度为每毫升1毫克的DAPI溶于含0.1%聚山梨酯-20的TBS中，在室温下孵育5分钟，进行细胞核染色。吸除DAPI溶液，使用水溶性、非荧光封片剂及盖玻片封片。将载玻片平放于4°C冰箱中至少8小时。

按照文本方案中所述进行荧光显微成像。收集 500 至 1000 微克裂解液，用 PBS 稀释，使每个 1.5 毫升离心管中的终体积为 200 微升。向第一管裂解液中加入针对目标抗原的抗体，并置于冰上。

将试管置于四摄氏度下，在管式滚轴混合器上以低速孵育过夜。次日，向新的1.5毫升离心管中加入50微升磁珠用于预洗涤。将含有磁珠的试管置于磁力架上，使磁珠向磁铁方向迁移。

使用200微升移液器从磁珠中移除储存缓冲液。加入500微升含0.1%聚山梨酯-20的磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤磁珠，并剧烈涡旋振荡管子10秒。然后将管子放回磁力架上，使磁珠向磁铁方向迁移。

使用200微升移液器吸除多余的洗涤缓冲液。将裂解液-抗体反应复合物加入珠粒中，在室温下于滚轴混合器上孵育90分钟。孵育结束后，将试管置于磁力架上，使珠粒向磁铁方向迁移。

使用200微升移液器吸取并弃去裂解液，将离心管置于冰上。通过加入500微升PBS洗涤磁珠两次，每次将离心管放在磁力架上，按前述方法移除液体。在洗涤过程中，避免涡旋振荡，并始终保持样品处于冰上。

用含0.1%聚山梨酯-20的PBS缓冲液清洗磁珠一次，不要涡旋震荡，然后用200微升移液枪头弃去最后一次洗涤缓冲液。洗脱时，向各管中加入20微升0.2摩尔的酸性甘氨酸溶液，在滚轴混合器上震荡7分钟。高速离心数秒后，将上清液收集至新的预冷离心管中。

对每个试管重复洗涤和洗脱步骤。然后，向40微升的洗脱样品中加入10微升4x缓冲液。立即向洗脱样品中逐滴加入一摩尔Tris，直至其颜色变为蓝色，随后继续处理下一个试管。

将洗脱的样品在 70 至 90 摄氏度下煮沸 10 分钟。将制备好的裂解液和沉淀样品并排上样至 SDS-PAGE 聚丙烯酰胺凝胶中。以 100 伏电压在电泳缓冲液中运行约 95 分钟，或直至迁移的蛋白质前沿到达凝胶底部。

随后，使用标准方案将凝胶转移至硝酸纤维素膜或PVDF膜。然后，在摇床上用含5%脱脂奶粉的TTBS溶液低速孵育一小时以封闭膜。为确定沉淀是否成功，使用针对沉淀蛋白的一抗对膜进行孵育探测。

按照制造商推荐的浓度，用含5%脱脂奶粉的TTBS稀释。在摇床上以缓慢振荡的方式于4摄氏度孵育膜过夜。次日，在摇床上以剧烈振荡的方式用TTBS洗涤膜三次，每次五分钟。

然后，将膜置于含有辣根过氧化物酶标记的适当二抗的 TTBS 溶液中，在室温下于摇床上缓慢振荡孵育一小时。在摇床上剧烈振荡条件下，用 TTBS 洗涤三至六次，每次五分钟。使用 commercially-available 的鲁米诺溶液孵育膜，并按照制造商说明操作，以检测二抗的信号。

使用化学发光成像系统检测信号。为了鉴定相互作用的蛋白质，需在同一次印迹实验中使用相应的抗体重复上述步骤。为了确定缝隙连接、黏附连接和紧密连接组分是否能够在乳腺中相互作用，进行了共免疫荧光实验。

共免疫荧光实验显示，在乳汁分泌第7天的小鼠乳腺组织中，黏附连接的关键蛋白β-catenin与间隙连接蛋白Connexin 26在细胞膜上共定位，表现为黄色信号。细胞核通过蓝色DAPI染色显示。取妊娠第18天小鼠乳腺组织的冷冻切片，分别对紧密连接蛋白Claudin 7（绿色显示）、黏附连接蛋白E-Cadherin（红色显示）以及间隙连接蛋白Connexin 26（珊瑚蓝色显示）进行免疫荧光染色。

细胞核用蓝色 DAPI 染色。E-钙黏蛋白与 Claudin 7 的共定位显示为黄色至浅橙色，而连接蛋白 26 与 E-钙黏蛋白和 Claudin 7 的共定位则呈现为白色点状染色。为了确定哪些连接蛋白在细胞膜上相互混合并发生物理性连接，使用来自哺乳期小鼠的乳腺组织进行了共免疫沉淀实验。

结果显示，间隙连接的一个组分——连接蛋白43（Connexin 43）与E-钙黏蛋白（E-Cadherin）和Claudin 7相互作用，但不与Claudin 3相互作用。通过反向免疫共沉淀实验验证了这些结果。当对E-钙黏蛋白进行免疫共沉淀时，它与连接蛋白43和Claudin 7发生了相互作用。

掌握该技术后，可在两天内完成四至八张切片的免疫共荧光实验，若操作得当，次日即可进行切片成像。在进行免疫共荧光实验时，需注意选择由不同宿主产生的、偶联不同荧光染料（其发射波长无重叠）的抗体，并为免疫共沉淀实验所用抗体选择合适的蛋白A或蛋白G磁珠。该技术建立后，为细胞生物学领域的研究人员探索小鼠乳腺组织中细胞间连接结构的相互作用提供了重要途径。

请务必注意，操作具有极高危险性，在执行此步骤时应始终采取预防措施。