蛋白质 - 蛋白质相互作用的分析和鼠乳腺中间隙，紧密和粘附连接部位之间的共定位
May 30th, 2017
细胞间连接是乳腺阶段特异性功能和发育的必需条件。该手稿提供了一个详细的方法，用于研究蛋白质 - 蛋白质相互作用（PPI）和使用鼠乳腺的共定位。这些技术允许调查不同发育阶段的细胞间连接之间的物理联系的动力学。
该方法的总体目标是确定两个或多个细胞间连接蛋白是否在细胞内共定位，并通过免疫共沉淀进一步评估它们的物理相互作用。这种方法可以帮助回答乳腺领域生物学中的关键问题，包括连接在正常发育和乳腺癌等疾病中的作用。该技术的主要优点是它可以以相对较低的成本提供有关体内蛋白质-蛋白质相互作用的重要信息。
要进行免疫荧光染色，请从冰箱中取出适当的显微镜载玻片。立即将切片在室温下浸入 4% 的甲醛中 15 分钟，以固定切片。然后，在室温下将载玻片浸入磷酸盐缓冲盐水中。
将载玻片留在那里，直到继续下一步。使用市售的疏水屏障或防水实验室笔圈出载玻片的每个部分。立即向组织中加入 PBS 滴剂，并将载玻片放入人组织学室中以完成剩余的手术。
在室温下，用 100 至 200 微升 3% 牛血清白蛋白-Tris-缓冲盐水、0.1% 聚山梨酯-20 封闭每个组织切片 30 分钟。当样品封闭时，通过在 TBS 0.1% 聚山梨酯-20 中稀释抗体来制备一抗和二抗溶液。通过抽吸去除封闭溶液后，在室温下将切片放入 100 至 200 μL 稀释的一抗中孵育 60 分钟。
然后通过抽吸去除一抗溶液，并用 250 至 500 μL TBS 0.1% 聚山梨酯-20 洗涤切片 5 分钟。通过抽吸去除洗涤液，然后重复洗涤两次。吸出洗涤液，并在室温下将切片与 100 至 200 μL 适当的 Fluoro-4 偶联二抗孵育 60 分钟。
通过抽吸去除二抗溶液后，用 250 至 500 μL TBS 0.1% 聚山梨酯-20 洗涤切片 5 分钟。取出洗涤液并重复两次。对于任何后续感兴趣的蛋白质，使用适当的原体和二体组合重复这些步骤。
去除最终洗涤液后，将切片与 100 至 200 μL（每毫升 1 毫克）DAPI 和 TBS 0.1%聚山梨醇酯-20 在室温下孵育 5 分钟，进行细胞核染色。吸出 DAPI 溶液，并使用水溶性、非荧光封固剂和盖玻片封固载玻片。将玻片平放在 4 摄氏度的冰箱中至少 8 小时。
按照文本协议中的说明进行荧光显微镜成像。收集 500 至 1000 μg 裂解物，并在 PBS 中稀释至每个 1.5 mL试管中的最终体积为 200 μL。将针对目标抗原的抗体添加到第一管裂解物中，并保持在冰上。
将试管在 4 摄氏度下在试管辊混合器上低速孵育过夜。第二天，将 50 μL 磁珠添加到新的 1.5 mL 试管中进行预洗。将含有磁珠的试管放在磁力架上，让磁珠向磁体迁移。
使用 200 微升移液器从珠子中取出储存缓冲液。加入 500 微升 PBS 0.1% 聚山梨酯-20 洗涤珠子，并剧烈涡旋试管 10 秒。然后，将试管放回磁力架上，让磁珠向磁力架迁移。
用 200 微升移液管移液去除多余的洗涤缓冲液。将裂解物抗体反应复合物添加到磁珠中，并在室温下在滚轮混合器上孵育 90 分钟。孵育后，将试管放在磁力架上，让磁珠向磁体迁移。
使用 200 微升移液器吸出并丢弃裂解物，然后将试管置于冰上。加入 500 微升 PBS，将试管放在磁力架上，然后像以前一样去除液体，洗涤珠子两次。在洗涤步骤中，避免涡旋，并将样品保存在冰上。
用 PBS 0.1% 聚山梨酯-20 洗涤珠子一次，不要涡旋，并使用 200 微升移液器吸头丢弃最后的洗涤缓冲液。洗脱时，向试管中加入 20 微升 0.2 摩尔酸性甘氨酸，并在滚轮混合器上摇动 7 分钟。高速离心几秒钟后，将上清液收集在新鲜的冰冷试管中。
对每个试管重复洗涤和洗脱步骤。然后，向 40 μL 洗脱样品中加入 10 μL 4x 缓冲液。立即向洗脱的样品中加入 1 摩尔 Tris，一次一滴，直到其颜色变为蓝色，然后继续进行下一个试管。
将洗脱的样品在 70 至 90 摄氏度下煮沸 10 分钟。将制备的裂解物和沉淀的样品并排加载到 SDS-PAGE 丙烯酰胺凝胶中。在 100 伏特电泳缓冲液中电泳凝胶约 95 分钟，或直到迁移蛋白的边缘到达凝胶底部。
随后，使用标准方案将凝胶转移到硝酸纤维素或 PVDF 膜上。然后，在摇杆上以 5% 的奶粉 TTBS 低速封闭膜 1 小时。为了确定沉淀是否成功，使用针对沉淀蛋白的第一抗体探测膜。
用 5% 的奶粉 TTBS 按制造商推荐的浓度稀释。将膜在 4 摄氏度下在摇摆平台上孵育过夜，并缓慢搅拌。第二天，在高度搅拌的摇床上用 TTBS 洗涤膜 3 次，每次 5 分钟。
然后，将膜与适当的辣根过氧化物酶偶联的二抗（用 TTBS 稀释）在室温下在摇动平台上孵育 1 小时。在 TTBS 上以高度搅拌的摇床进行 3 到 6 次洗涤，每次 5 分钟。通过将膜与市售的鲁米诺溶液一起孵育来分析二抗的信号，并按照制造商的说明进行作。
使用化学发光成像系统检测信号。要鉴定相互作用的蛋白质，请在同一印迹上使用适当的抗体重复这些步骤。为了确定间隙连接、粘附连接和紧密连接成分是否可以在乳腺中相互作用，进行了免疫共荧光测定。
免疫共荧光测定显示，β-catenin（粘附连接的整合蛋白）和 Connexin 26（一种间隙连接蛋白）在哺乳期第 7 天共定位于小鼠乳腺的细胞膜，如黄色所示。细胞核用蓝色 DAPI 染色可视化。在怀孕第 18 天切割乳腺的冷冻切片，并进行免疫荧光染色，以检测 Claudin 7（一种紧密连接蛋白，以绿色显示）、E-Cadherin（一种粘附连接蛋白，以红色显示）和 Connexin 26（一种间隙连接蛋白，以珊瑚蓝色显示）。
细胞核用蓝色 DAPI 染色。E-钙粘蛋白和 Claudin 7 共定位显示为黄色至浅橙色，而连接蛋白 26 与 E-钙粘蛋白和 Claudin 7 共定位导致白色点状染色。为了找出哪些连接蛋白在细胞膜上混合并物理连接在一起，使用哺乳小鼠的乳腺组织进行了免疫共沉淀。
结果显示，间隙连接蛋白 43 是间隙连接的一个组成部分，与 E-钙粘蛋白和 Claudin 7 相互作用，但不与 Claudin 3 相互作用。这些结果通过相互免疫沉淀得到证实。当 E-Cadherin 被免疫沉淀时，它与 Connexin 43 和 Claudin 7 相互作用。
一旦掌握，这项技术可以在两天内完成，用于 4 到 8 张玻片的免疫共荧光，如果作得当，可以在第二天对玻片进行成像。在尝试免疫共荧光程序时，重要的是要记住选择在不同空间产生且波长不重叠的不同 Fluoro 4 偶联抗体，并选择与用于免疫共沉淀的抗体相容的适当蛋白 A 或 G 磁珠。开发后，这项技术为细胞生物学领域的研究人员探索小鼠乳腺中细胞间连接的相互作用铺平了道路。
不要忘记工作非常危险，在执行此程序时应始终采取预防措施。
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概述
本研究聚焦于乳腺中的细胞间连接及其在发育和疾病中的作用。它详细介绍了一种用于研究小鼠乳腺组织中蛋白质-蛋白质相互作用和共定位的协议。
研究的关键组成部分
科学领域
- 神经科学
- 细胞生物学
- 发育生物学
背景
- 细胞间连接对于乳腺功能至关重要。
- 了解蛋白质-蛋白质相互作用可以揭示正常发育和乳腺癌的机制。
- 共免疫沉淀是研究这些相互作用的关键技术。
- 该研究提供了一种用于体内分析的成本效益高的方法。
研究目的
- 确定乳腺细胞中连接蛋白的共定位。
- 评估这些蛋白质之间的物理相互作用。
- 探索对乳腺生物学和疾病的影响。
使用的方法
- 共免疫沉淀用于评估蛋白质相互作用。
- 共免疫荧光染色用于可视化蛋白质定位。
- 使用小鼠乳腺组织进行实验分析。
- 显微镜下检查染色切片。
主要结果
- 确定关键的细胞间连接蛋白。
- 在不同发育阶段发现共定位现象。
- 洞察蛋白质相互作用的动态。
- 可能与乳腺癌病理相关的发现。
结论
- 细胞间连接在乳腺生物学中起着至关重要的作用。
- 共免疫沉淀对于体内研究蛋白质-蛋白质相互作用是有效的。
- 研究结果可能为未来的乳腺癌机制研究提供信息。
常见问题
Executive Industry Relevance
Understanding protein-protein interactions and co-localization among junctional proteins in mammary tissue is critical for de-risking early discovery and target validation in epithelial biology. This workflow enables precise mapping of molecular nexuses that underpin tissue integrity, supporting predictive confidence in disease modeling and mechanistic studies. The approach is directly relevant for biopharma teams seeking to elucidate junctional mechanisms implicated in developmental disorders and oncology portfolios.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of junctional protein networks to clarify functional pathways in tissue homeostasis.
- Supports biological de-risking by revealing physical associations and mislocalization events relevant to disease progression.
- Facilitates predictive confidence in selecting and validating targets involved in cell-cell adhesion and barrier function.
Screening & Assay Development
- Prepares validated tissue sections and lysates for downstream quantitative imaging and biochemical assays.
- Standardizes co-immunofluorescence and co-immunoprecipitation protocols for reproducible detection of protein interactions.
- Enables robust assessment of compound effects on junctional integrity in screening campaigns.
Translational & Preclinical Research
- Aligns molecular findings with disease-relevant tissue states, supporting translational biomarker discovery.
- Provides continuity from mechanistic discovery to preclinical validation of junctional targets in disease models.
- Informs risk-adjusted advancement decisions by linking protein interaction dynamics to functional tissue outcomes.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the discovery continuum from early hypothesis testing through lead identification and preclinical validation, particularly for epithelial and barrier-related targets.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on junctional protein interplay and pathway mapping in tissue context.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative readouts of protein co-localization and interaction for assay development.
- Analytics: Provides imaging and biochemical data to compare protein associations across developmental or disease states.
- Translational Research: Bridges molecular findings to tissue-level phenotypes, informing biomarker strategies.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for investigating protein networks in diverse tissue models.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Standardizes protocols for reproducibility and scalability across research teams.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions and capital-efficient portfolio management.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of targets implicated in tissue integrity and disease.
Implementation Considerations
- Requires expertise in immunofluorescence, immunoprecipitation, and quantitative imaging analysis.
- Needs access to fluorescence microscopy, chemiluminescence imaging, and protein biochemistry infrastructure.
- Demands rigorous cross-team standardization of antibody selection and detection reagents.
- Adaptable to various tissue and disease models with appropriate antibody validation.
- Dependent on careful experimental controls to distinguish direct from indirect protein interactions.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
10:21
Conclusion
8:26
Results: Interaction of Gap Junction, Adhered Junction, and Tight Junction Components in the Murine Mammary Gland
0:48
Identifying Proetin Co-localization
3:41
Studying Protein-protein Interactions (PPIs): Indirect Immunoprecipitation
6:29
Downstream Application: Gel Electrophoresis Followed by Western Blot
