Name: 使用Cpf1的C-Brick DNA标准装配的方案 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 3 s
Description: 学习使用Cpf1和C-Brick标准进行DNA组装的方案，该方法不依赖特定序列并支持迭代组装，适用于合成生物学中构建复杂遗传回路的研究。

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我们感谢上海兆维生物技术有限公司在C-Brick标准开发过程中提供的技术协助。本工作得到了中国科学院战略性先导科技专项（项目编号：XDB19040200）的资助。

1. crRNA 的制备
<ol>
	<li>crRNA模板的制备
	<ol>
		<li>将各个寡核苷酸（表1）用无RNase的水重悬，配制成10 µM的浓度。</li>
		<li>在0.2 mL的PCR管中加入22.5 µL的上链寡核苷酸（表1中的T7-F）、22.5 µL的下链寡核苷酸（表1）以及5 µL的10×退火缓冲液，总体积应为50 µL。 
		注：在表1中列出了六种不同的下链寡核苷酸，每种均应与上链T7-F单独配对使用。表1中的小写字母代表将被转录为crRNA引导序列的序列。可使用10×Taq PCR缓冲液替代10×退火缓冲液。</li>
		<li>将PCR管放入热循环仪中。</li>
		<li>运行退火程序：95 °C初始变性5分钟，随后以每分钟降低1 °C的速率从95 °C降温至20 °C。 
		注：退火完成后应立即用于步骤1.2.1。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>crRNA的转录与纯化
	<ol>
		<li>在1.5 mL微量离心管中加入38 µL无RNase的水、8 µL步骤1.1.4中的模板、20 µL的5×T7转录缓冲液、20 µL的NTP混合物（10 µM）、4 µL的重组RNase抑制剂（RRI）以及10 µL的T7 RNA聚合酶，总体积应为100 µL。</li>
		<li>将微量离心管置于37 °C水浴中过夜（约16小时）。</li>
		<li>使用RNA纯化与浓缩试剂盒对转录产物进行纯化，操作步骤遵循制造商的说明书。</li>
		<li>使用紫外-可见分光光度计对RNA进行定量，并将RNA稀释至10 µM的浓度。样品应立即使用或储存于-80 °C。 
		注：crRNA序列列于表2中。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. C-Brick 片段的构建（即 将生物片段插入 C-Brick 标准载体）
注意：此步骤包含三个子步骤。对于较短的生物元件（例如启动子和终止子），最好采用直接PCR方法将生物元件插入C-Brick标准载体4。完整载体序列见补充数据，前缀和后缀序列见图1（如下步骤2.1）。对于可通过PCR轻松获得的生物元件（例如以基因组DNA、质粒或从头合成的DNA序列为模板），最好采用无缝克隆方法将生物元件插入C-Brick标准载体（如下步骤2.2）。对于来源于BioBrick和BglBrick标准的元件，可使用限制性内切酶介导的消化和T4 DNA连接酶介导的连接方法，将生物元件插入C-Brick标准载体（如下步骤2.3）。
<ol>
	<li>通过直接PCR扩增构建
	<ol>
		<li>设计并订购用于PCR扩增的寡核苷酸。 
		注意：寡核苷酸的5'-端包含目标DNA片段的序列，而3'-端包含载体序列（即，正向链3'-端为&#34;GGATCCACTAGTCTCTAGCTCG&#34;，反向链为&#34;GGATCCTTTCTCCTCTTTCTAG&#34;）。寡核苷酸5'-端可设计为无突出端或约20 bp的突出端。具体示例可参见先前的研究4。</li>
		<li>将各寡核苷酸用超纯水重悬至10 µM的浓度。</li>
		<li>在冰上于0.2 mL PCR管中配制PCR反应体系：加入18 µL超纯水、25 µL 2x PCR缓冲液、1 µL dNTPs（10 µM）、各2.5 µL步骤2.1.2中的正向和反向引物（10 µM）、0.5 µL C-Brick标准载体（50 ng）作为模板，以及0.5 µL高保真DNA聚合酶。确保总体积为50 µL。</li>
		<li>将PCR管直接放入热循环仪中并启动程序。样品可立即使用，或冻存于-20 °C备用。</li>
		<li>热循环程序：98 °C预变性3 min，1个循环；随后进行30个循环：98 °C变性10 s、55 °C退火20 s、72 °C延伸2 min；最后72 °C延伸10 min，1个循环。反应结束后将样品保持在16 °C。</li>
		<li>取步骤2.1.4中的混合物9 µL加入1.5 mL微量离心管中。</li>
		<li>加入1 µL DpnI，于37 °C水浴中孵育1 h。 
		注意：若引物无重叠序列，则需额外加入0.5 µL T4多核苷酸激酶（PNK）和0.5 µL T4 DNA连接酶，并于22 °C水浴中孵育1 h。若引物含有约20 nt的重叠序列，则可将DpnI处理后的产物直接转化至E. coli（DH10B）感受态细胞中（步骤2.4）。线性PCR产物将在宿主细胞的重组系统作用下环化。</li>
		<li>样品可立即使用，或于-20 °C保存。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过无缝连接构建
	<ol>
		<li>设计并订购用于PCR扩增的寡核苷酸。 
		注意：寡核苷酸的3'-端包含目标DNA片段的末端序列，5'-端则包含线性化C-Brick标准载体的末端序列（即，正向链5'-端为&#34;CTAGAAAGAGGAGAAAGGATCC&#34;，反向链5'-端为&#34;CGAGCTAGAGACTAGTGGATCC&#34;）。具体示例可参见先前的研究4。</li>
		<li>将各寡核苷酸用超纯水重悬至10 µM的浓度。</li>
		<li>在冰上于0.2 mL PCR管中配制PCR反应体系：加入18 µL超纯水、25 µL 2x PCR缓冲液、1 µL dNTPs（10 µM）、各2.5 µL步骤2.2.2中的正向和反向引物（10 µM）、0.5 µL模板（20–500 ng）以及0.5 µL高保真DNA聚合酶。确保总体积为50 µL。</li>
		<li>将PCR管直接放入热循环仪中并运行程序。样品可立即使用，或冻存于-20 °C备用。 
		注意：热循环程序设置为：98 °C预变性3 min，1个循环；随后进行30个循环：98 °C变性10 s、55 °C退火20 s（根据引物的退火温度调整）、72 °C延伸1 min（根据生物元件长度调整）；最后72 °C延伸10 min，1个循环。反应结束后将样品保持在16 °C。</li>
		<li>使用PCR纯化试剂盒对PCR产物进行纯化；操作遵循制造商说明书。</li>
		<li>用BamHI酶切C-Brick标准载体：在微量离心管中加入34 µL超纯水、10 µL质粒（1 µg）、5 µL 10x缓冲液和1 µL BamHI。于37 °C水浴中孵育最多2 h。</li>
		<li>使用凝胶纯化试剂盒对上述产物进行纯化；操作遵循制造商说明书。</li>
		<li>在1.5 mL微量离心管中加入步骤2.2.7所得的线性化载体2 µL（50 ng）、步骤2.2.4所得的片段5 µL（200 ng）、5x无缝连接缓冲液2 µL，以及无缝连接试剂盒中的无缝连接酶1 µL。确保总体积为10 µL。</li>
		<li>将反应体系置于37 °C水浴中孵育30 min。样品可立即使用，或冻存于-20 °C备用。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过限制性内切酶消化与T4 DNA连接酶介导的连接构建。 
	注意：对于来源于BioBrick标准（步骤2.3.4–2.3.7）和BglBrick标准（步骤2.3.1–2.3.3）的元件，可通过限制性内切酶消化与T4 DNA连接酶介导的连接，将生物元件插入C-Brick标准载体中。
	<ol>
		<li>用BamHI和BglII酶切BglBrick标准元件：在微量离心管中加入34 µL超纯水、10 µL质粒（2 µg）、5 µL 10x缓冲液3、0.5 µL BamHI和0.5 µL BglII。于37 °C水浴中孵育2 h。</li>
		<li>进行1%琼脂糖凝胶电泳，并使用凝胶纯化试剂盒回收目标片段。</li>
		<li>将片段与C-Brick标准载体连接：在1.5 mL微量离心管中加入步骤2.1.12所得的线性化载体2 µL（50 ng）和步骤2.3.3所得的片段6 µL（200 ng）。加入1 µL 10x T4 DNA连接酶缓冲液和1 µL T4 DNA连接酶。于22 °C孵育2 h。样品可立即使用，或冻存于-20 °C备用。</li>
		<li>用XbaI和SpeI酶切BioBrick标准元件：在微量离心管中加入34 µL超纯水、10 µL质粒（2 µg）、5 µL 10x缓冲液、0.5 µL XbaI和0.5 µL SpeI。于37 °C水浴中孵育2 h。</li>
		<li>用XbaI和SpeI酶切C-Brick标准载体：在微量离心管中加入34 µL超纯水、10 µL质粒（1 µg）、5 µL 10x缓冲液、0.5 µL XbaI和0.5 µL SpeI。于37 °C水浴中孵育2 h。</li>
		<li>进行1%琼脂糖凝胶电泳，并使用凝胶纯化试剂盒分别回收步骤2.3.4中的片段和步骤2.3.5中的线性化载体；操作遵循制造商说明书。</li>
		<li>将片段与C-Brick载体连接：在1.5 mL微量离心管中加入步骤2.3.5所得的线性化载体2 µL（50 ng）和步骤2.3.4所得的片段6 µL（200 ng）。加入1 µL 10x T4 DNA连接酶缓冲液和1 µL T4 DNA连接酶。于22 °C孵育2 h。样品可立即使用，或冻存于-20 °C备用。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>取步骤2.1.8、2.2.9、2.3.3或2.3.7所得产物各10 µL，用于化学转化E. coli（DH10B）感受态细胞。</li>
	<li>挑取数个克隆接种至5 mL液体LB培养基中，于37 °C摇床（220 rpm）中过夜培养。</li>
	<li>使用质粒提取试剂盒提取质粒；操作遵循制造商说明书。</li>
	<li>通过Sanger测序鉴定正确克隆11。</li>
</ol>
3. C-Brick 组装（图 2）
<ol>
	<li>C-Brick 载体的 Cpf1 消化
	<ol>
		<li>向一个1.5 mL微量离心管中加入22.5 µL无RN酶水、4 µL 10x Cpf1缓冲液、10 µL步骤2.6的质粒（1 µg）、0.5 µL RRI和1 µL Cpf1（5 µM）。 
		注意：Cpf1 可从商业渠道购买，或根据先前研究中的方案进行纯化4.</li>
		<li>为了将外源DNA片段插入T1和T2位点，加入1 µL crRNA-T2（10 µM），在37 °C水浴中孵育30分钟。 A加入1 µL crRNA-T1（10 µM）和Cpf1（5 µM），继续孵育30分钟。 
		注意：或者，若要将外源DNA片段插入T3和T4位点，可加入1 µL crRNA-T3（10 µM），在37 °C水浴中孵育30分钟；再加入1 µL crRNA-T4（10 µM），继续孵育30分钟。</li>
		<li>加入1 µL热敏碱性磷酸酶，将试管置于37 °C水浴中再孵育1小时。</li>
		<li>进行琼脂糖凝胶电泳，并使用凝胶回收试剂盒纯化载体。样品可立即使用，或于 -20 °C 冻存备用。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Cpf1 对 DNA 片段的消化
	<ol>
		<li>向一个1.5 mL微量离心管中加入21.5 µL无RN酶水、4 µL 10x Cpf1缓冲液、步骤2.6中的质粒10 µL（2 µg）、0.5 µL RRI和2 µL Cpf1（5 µM）。</li>
		<li>为了将外源DNA片段插入T1和T2位点，加入1 µL crRNA-T1（10 µM）和1 µL crRNA-T3（10 µM），在37 °C水浴中孵育2小时。 
		注意：也可加入1 µL crRNA-T2（10 µM）和1 µL crRNA-T4（10 µM），在37 °C水浴中孵育2小时。</li>
		<li>进行琼脂糖凝胶电泳，并使用胶回收试剂盒纯化片段。样品可立即使用，或冷冻后于 -20 °C 保存。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>C-Brick 连接组装及进一步验证
	<ol>
		<li>将外源DNA片段与C-Brick载体连接：取2 µL第3.1.4步中线性化的载体（50 ng）和6 µL第3.2.3步中的DNA片段（200 ng），加入1.5 mL微量离心管中。加入1 µL 10x T4 DNA连接酶缓冲液和1 µL T4 DNA连接酶。22 °C孵育2 h。样品可立即使用，或于-20 °C冻存备用。</li>
		<li>加入10 µL连接产物（步骤3.3.1）用于化学转化 E. coli (DH10B) 感受态细胞</li>
		<li>将多个克隆加入5 mL液体LB培养基中，置于摇床于37 °C、220 rpm条件下过夜培养。</li>
		<li>使用质粒提取试剂盒提取质粒；按照生产商提供的说明书操作。</li>
		<li>通过Sanger测序鉴定正确克隆11.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>进行新一轮的C-Brick组装。第3.3.4步中筛选出的正确克隆可作为新的C-Brick载体或DNA片段，按照3.1–3.3步骤的相同方案进行后续迭代的C-Brick组装。 
	注意：T2' 和 T3' 位点是作为 T2 和 T3 位点的备用设计图1a对于从步骤 2.3.7 获得的质粒，仅可使用 T2' 和 T3' 进行 C-Brick 标准组装。</li>
</ol>

<ol><li>Canton, B., Labno, A., Endy, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Refinement+and+standardization+of+synthetic+biological+parts+and+devices%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Refinement and standardization of synthetic biological parts and devices.</a> Nat Biotechnol. 26 (7), 787-793 (2008).</li>
<li>Shetty, R. P., Endy, D., Knight, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+BioBrick+vectors+from+BioBrick+parts%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Eng%22%5BJournal%5D)">Engineering BioBrick vectors from BioBrick parts.</a> J Biol Eng. 2, (2008).</li>
<li>Knight, T. <a target="_blank" href="https://dspace.mit.edu/handle/1721.1/21168">Idempotent Vector Design for Standard Assembly of Biobricks</a>. , MIT Artificial Intelligence Laboratory; MIT Synthetic Biology Working Group. 1-11 (2003).</li>
<li>Li, S. Y., Zhao, G. P., Wang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C-Brick%3A+A+New+Standard+for+Assembly+of+Biological+Parts+Using+Cpf1%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synth+Biol%22%5BJournal%5D)">C-Brick: A New Standard for Assembly of Biological Parts Using Cpf1.</a> ACS Synth Biol. 5 (12), 1383-1388 (2016).</li>
<li>Anderson, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BglBricks%3A+A+flexible+standard+for+biological+part+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Eng%22%5BJournal%5D)">BglBricks: A flexible standard for biological part assembly.</a> J Biol Eng. 4 (1), (2010).</li>
<li>Liu, J. K., Chen, W. H., Ren, S. X., Zhao, G. P., Wang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((iBrick%3A+a+new+standard+for+iterative+assembly+of+biological+parts+with+homing+endonucleases%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">iBrick: a new standard for iterative assembly of biological parts with homing endonucleases.</a> PLoS One. 9 (10), e110852(2014).</li>
<li>Hsu, P. D., Lander, E. S., Zhang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+applications+of+CRISPR-Cas9+for+genome+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Development and applications of CRISPR-Cas9 for genome engineering.</a> Cell. 157 (6), 1262-1278 (2014).</li>
<li>Wright, A. V., Nunez, J. K., Doudna, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biology+and+Applications+of+CRISPR+Systems%3A+Harnessing+Nature%27s+Toolbox+for+Genome+Engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Biology and Applications of CRISPR Systems: Harnessing Nature's Toolbox for Genome Engineering.</a> Cell. 164 (1-2), 29-44 (2016).</li>
<li>Jinek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+programmable+dual-RNA-guided+DNA+endonuclease+in+adaptive+bacterial+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity.</a> Science. 337 (6096), 816-821 (2012).</li>
<li>Zetsche, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cpf1+is+a+single+RNA-guided+endonuclease+of+a+class+2+CRISPR-Cas+system%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cpf1 is a single RNA-guided endonuclease of a class 2 CRISPR-Cas system.</a> Cell. 163 (3), 759-771 (2015).</li>
<li>Sanger, F., Nicklen, S., Coulson, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+sequencing+with+chain-terminating+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">DNA sequencing with chain-terminating inhibitors.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 74 (12), 5463-5467 (1977).</li>
<li>Shanghai Tolo Biotechnology Company Limited. , Shanghai 200233, China. Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.tolobio.com/">http://www.tolobio.com/</a> (2017).</li>
<li>Engler, C., Kandzia, R., Marillonnet, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+one+pot%2C+one+step%2C+precision+cloning+method%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A one pot, one step, precision cloning method.</a> PLoS One. 3 (11), e3647(2008).</li>
<li>Gibson, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+assembly+of+DNA+molecules+up+to+several+hundred+kilobases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases.</a> Nat Methods. 6 (5), 343-345 (2009).</li>
<li>Casini, A., Storch, M., Baldwin, G. S., Ellis, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bricks+and+blueprints%3A+methods+and+standards+for+DNA+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Bricks and blueprints: methods and standards for DNA assembly.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 16 (9), 568-576 (2015).</li>
<li>Cameron, D. E., Bashor, C. J., Collins, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+brief+history+of+synthetic+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">A brief history of synthetic biology.</a> Nat Rev Microbiol. 12 (5), 381-390 (2014).</li>
<li>Keasling, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+biology+for+synthetic+chemistry%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Synthetic biology for synthetic chemistry.</a> ACS Chem Biol. 3 (1), 64-76 (2008).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本方案描述了C-Brick DNA组装标准的操作流程。该方案中最关键的步骤是C-Brick标准载体的线性化；若载体未完全酶切，将严重影响实验成功率。此外，尽管Cpf1主要在&#34;18-23&#34;的切割模式下切割目标DNA序列，但也有研究检测到其在临近两个碱基处发生不精确切割4，这可能导致DNA组装后产生少量突变。因此，需要通过Sanger测序验证组装产物的正确性。
C-Brick 组装的效率低于先前研究中描述的传统限制性内切酶和连接方法4。影响组装效率的主要原因可能是 Cpf1 的切割特性不够精确。未来，提高切割准确性将对标准化具有重要意义，目前相关改进工作正在探索中。
C-Brick 与 BglBrick 和 BioBrick 标准也具有部分兼容性。例如，BglBrick 部件可用 BglII 和 BamHI 切割，然后插入 C-Brick 标准载体的 BamHI 位点，从而生成一个 C-Brick 部件。然而，应验证 B...

DNA生物元件的标准化对于合成生物学的发展至关重要1DNA组装方法的开发可替代 特设的 实验设计，并减少在将遗传元件组装成更大系统过程中出现的许多意外结果。BioBrick 标准（BBF RFC 10）是最早提出的 DNA 组装标准之一。该标准使用前缀序列（包含 EcoRI 和 XbaI 酶切位点）和后缀序列（包含 SpeI 和 PstI 酶切位点）2,3由于 XbaI 和 SpeI 具有互补的黏性末端，因此用 XbaI 和 SpeI 切割的 BioBrick DNA 片段可以连接在一起，形成新的 BioBrick，用于进一步的迭代组装。
在使用 BioBrick 标准时已发现一些缺陷4。例如，它会在 DNA 片段之间产生一个 8 bp 的“疤痕”序列，从而无法构建融合蛋白。此外，必须从 DNA 片段中去除上述四种 6 bp 限制性酶切位点，这非常不便。BglBrick 标准的建立旨在解决第一个问题5。它产生一个 6 bp 的 &#34;GGATCT&#34; 疤痕序列，编码甘氨酸-丝氨酸（Gly-Ser），从而实现多个蛋白或蛋白结构域的融合。iBrick 则是为解决第二个问题而开发的6。它利用识别长DNA序列的归巢内切酶（homing endonucleases, HEs）。由于HE的识别位点在天然DNA序列中极为罕见，因此iBrick标准可直接用于构建iBrick元件，而无需修改其DNA序列。然而，iBrick标准在DNA片段之间会留下21 bp的疤痕序列，这可能是其未被广泛采用的原因。
近年来，成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPR）系统发展迅速7,8。在CRISPR相关蛋白（Cas蛋白）中，源自Streptococcus pyogenes的Cas9核酸内切酶目前已得到广泛应用，其主要引起具有平末端的双链DNA断裂（DSBs）9。
2015年，Zhang 及其同事首次对 Cpf1（来自 Prevotella 和 Francisella 1 的 CRISPR）进行了表征。Cpf1 属于第2类 V 型 CRISPR-Cas 系统，是一种由 CRISPR RNA（crRNA）引导的内切核酸酶10。与 Cas9 不同，Cpf1 引发的双链断裂（DSB）具有 4 或 5 个核苷酸的 5' 突出末端10。基于这一特性，研究人员开发了一种 DNA 组装标准——C-Brick4。在 C-Brick 标准载体上，生物元件两侧分别被预置的 T1/T2 和后置的 T3/T4 四个 Cpf1 靶位点所包围，这与 BioBrick 标准类似。由于 T2 和 T3 位点的切割可产生互补的黏性末端，因此可在组装 DNA 元件的同时，在元件之间生成一个 &#34;GGATCC&#34; 的短序列“疤痕”。值得注意的是，C-Brick 标准具有两个主要优势：识别较长的靶序列以及留下较短的疤痕序列。C-Brick 产生的 6 bp &#34;GGATCC&#34; 疤痕编码甘氨酸-丝氨酸（Gly-Ser），可用于构建融合蛋白。此外，C-Brick 标准还与 BglBrick 和 BioBrick 标准部分兼容。

<table><tbody><tr><td>商业寡核苷酸</td><td>Sangon Biotech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>10x Taq PCR 缓冲液</td><td>Transgen</td><td>#J40928</td><td></td></tr><tr><td>超纯蒸馏水</td><td>Invitrogen</td><td>10977-015</td><td></td></tr><tr><td>5x RNA 转录缓冲液</td><td>Thermo Scientific</td><td>K0441</td><td></td></tr><tr><td>T7 RNA 聚合酶</td><td>Thermo Scientific</td><td>#EP0111</td><td></td></tr><tr><td>NTP 混合物</td><td>Sangon</td><td>#ND0056</td><td></td></tr><tr><td>RRI（重组 RNase 抑制剂）</td><td>Takara</td><td>2313A</td><td></td></tr><tr><td>RNA Clean &amp; Concentrator-5</td><td>Zymo Research</td><td>R1015</td><td></td></tr><tr><td>UV-Vis 分光光度计</td><td>Thermo Scientific</td><td>Nano-Drop 2000c</td><td></td></tr><tr><td>2x Phanta Max 缓冲液</td><td>Vazyme</td><td>PB505</td><td>PCR 缓冲液</td></tr><tr><td>dNTPs</td><td>Transgen</td><td>AD101</td><td></td></tr><tr><td>Phanta Max 超保真 DNA 聚合酶</td><td>Vazyme</td><td>P505-d1</td><td></td></tr><tr><td>Ezmax 一步法克隆试剂</td><td>Tolobio</td><td>24303-1</td><td>无缝连接试剂盒</td></tr><tr><td>Ezmax 一步法克隆 5x 缓冲液</td><td>Tolobio</td><td>32006</td><td></td></tr><tr><td>BamHI</td><td>NEB</td><td>#R0136L</td><td></td></tr><tr><td>BamHI-HF</td><td>NEB</td><td>#R3136L</td><td></td></tr><tr><td>BglII&amp;nbsp;</td><td>NEB</td><td>#R0144L</td><td></td></tr><tr><td>XbaI</td><td>NEB</td><td>#R0145L</td><td></td></tr><tr><td>SpeI</td><td>NEB</td><td>#R3133L</td><td></td></tr><tr><td>10x Buffer 3</td><td>NEB</td><td>#B7003S</td><td></td></tr><tr><td>10x CutSmart 缓冲液</td><td>NEB</td><td>B7204S</td><td></td></tr><tr><td>10x T4 DNA 连接酶缓冲液</td><td>Tolobio</td><td>32002</td><td></td></tr><tr><td>T4 PNK</td><td>Tolobio</td><td>32206</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA 连接酶</td><td>Tolobio</td><td>32210</td><td></td></tr><tr><td>DpnI</td><td>NEB</td><td>#R01762</td><td></td></tr><tr><td>SV 凝胶与 PCR 产物纯化系统</td><td>Promega</td><td>A9282</td><td></td></tr><tr><td>质粒小提试剂盒 I</td><td>Omega</td><td>D6943-02</td><td>质粒制备试剂盒</td></tr><tr><td>热敏感碱性磷酸酶&amp;nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>#EF0651</td><td>FastAP</td></tr><tr><td>10x Cpf1 缓冲液</td><td>Tolobio</td><td>32008</td><td></td></tr><tr><td>Cpf1</td><td>Tolobio</td><td>32105</td><td>FnCpf1</td></tr><tr><td>PCR 仪</td><td>Applied Biosystems</td><td>veriti 96 well</td><td></td></tr><tr><td>C-Brick 标准载体</td><td>Tolobio</td><td>98101</td><td></td></tr><tr><td>大肠杆菌 [DH10B]</td><td>Invitrogen</td><td>18297010</td><td></td></tr><tr><td>LB 培养基（胰蛋白胨）</td><td>Oxoid</td><td>LP0042</td><td></td></tr><tr><td>LB 培养基（酵母提取物）</td><td>Oxoid</td><td>LP0021</td><td></td></tr><tr><td>LB 培养基（NaCl）</td><td>Sangon Biotech</td><td>B126BA0007</td><td></td></tr></tbody></table>

使用cpf1进行c-brick dna标准组装的实验方案

Protocols for C-Brick DNA Standard Assembly Using Cpf1

CRISPR 相关蛋白 Cpf1 在 CRISPR RNA（crRNA）的引导下切割双链 DNA，产生黏性末端。由于这一特性，Cpf1 已被用于建立一种名为 C-Brick 的 DNA 组装标准，该标准具有识别位点长、疤痕序列短的优点。在标准的 C-Brick 载体上，生物 DNA 片段两侧包含四个 Cpf1 识别位点——前缀区（T1 和 T2 位点）和后缀区（T3 和 T4 位点）。T2 和 T3 位点的切割可产生互补的黏性末端，从而实现带有 T2 和 T3 位点的 DNA 片段的组装。同时，在片段连接后会在中间生成一个短的 &#34;GGATCC&#34; 疤痕序列。由于新形成的质粒仍包含四个 Cpf1 切割位点，因此该方法支持 DNA 片段的迭代组装，类似于 BioBrick 和 BglBrick 标准。本文描述了使用 C-Brick 标准组装 DNA 片段的操作流程。C-Brick 标准可被科研人员、研究生、本科生乃至业余爱好者广泛使用。

本方案展示了三种色素蛋白表达盒（cjBlue (BBa_K592011)、eforRed (BBa_K592012) 和 amilGFP (BBa_K592010)）的构建。首先，将上述三个基因的编码序列及其终止子分别克隆至C-Brick标准载体中。通过PCR扩增将短DNA元件（启动子和终止子）引入C-Brick载体，所用引物在5'端含有相应的短DNA元件序列，随后采用自连法完成连接。三种编码色素蛋白的序列首先被克隆 从头合成 合成后通过无缝克隆技术插入C-Brick标准载体中。引物信息见先前研究4.
随后，cjBlue、eforRed 和 amilGFP 序列按照图中所示相同步骤，与终止子和启动子序列进行连接。 图2正确的质粒构建体被转化至 E. coli，呈现出绚丽的色彩（<strong class="xf...

CRISPR相关蛋白Cpf1可通过特别设计的CRISPR RNA（crRNA）引导，在特定位置切割双链DNA，产生黏性末端。基于这一特性，建立了一种DNA组装标准（C-Brick），本文详细描述了其使用方案。

使用Cpf1进行C-Brick DNA标准组装的实验方案

CRISPR相关蛋白Cpf1在CRISPR RNA（crRNA）的引导下切割双链DNA，产生黏性末端。由于这一特性……

以下视频详细介绍了利用 C-Brick 标准，通过 CRISPR 相关蛋白 Cpf1 组装 DNA 片段的方法。该方法可进一步推动合成生物学领域中 DNA 组装技术的发展，例如促进复杂遗传回路的构建。该方法的主要优势在于其序列无关性，能够实现DNA片段的迭代组装。我们最初产生这一方法的设想，是源于观察到Cpf1由单链siRNA引导，并将催化性DNA逐级堆叠，从而生成DKNs。进行该实验操作的是我实验室的研究生 Shi-Yuan Li。为修复 crRNA 模板，将各条寡核苷酸用无 RNase 的水重悬，配制成 10 微摩尔浓度。向一个 0.2 毫升 PCR 管中加入上链寡核苷酸、下链寡核苷酸以及 10 倍退火缓冲液，具体用量详见随附文件。确保总体积为 50 微升。此表格显示了六种不同的下游引物寡核苷酸，每种均应分别与上游引物 T7-F 配对。小写字母代表将被转录为 crRNA 指导序列的序列。将PCR管放入热循环仪中。运行退火程序：首先在95摄氏度下变性5分钟，然后以每分钟降低1摄氏度的速率从95摄氏度降温至20摄氏度。退火完成后，立即进行转录反应，将退火产物与无RNase的水、T7转录缓冲液、NTP混合物、重组RNase抑制剂以及T7 RNA聚合酶在1.5毫升微量离心管中混合。将反应物置于37摄氏度水浴中孵育过夜。次日，使用RNA纯化与浓缩试剂盒纯化转录的RNA。使用紫外-可见分光光度计对RNA进行定量。然后，将RNA稀释至10微摩尔的浓度。如果样品未立即使用，请将其储存在-80摄氏度。C-Brick元件的构建可通过多种方法实现。在本段视频中，将使用无缝克隆方法组装三种色蛋白盒：cjBlue、eforRed 和 amilGFP。首先设计并订购用于扩增这些色蛋白盒的寡核苷酸引物。当寡核苷酸到货后，用超纯水将其重悬至 10 微摩尔的浓度。接下来，设置PCR反应时，将0.2毫升PCR管置于冰上。依次加入超纯水、2×PCR缓冲液、dNTPs、正向和反向引物、色素蛋白模板以及高保真DNA聚合酶。将PCR管直接放入热循环仪中，并运行程序。立即使用样本，或在 -20 摄氏度下冷冻保存。扩增后，使用试剂盒纯化 PCR 产物。接下来，为用 BamH1 消化 C-Brick 标准载体，向离心管中加入超纯水、质粒、10x 缓冲液和 BamH1。在37摄氏度水浴中孵育最多两小时。使用凝胶回收试剂盒纯化线性化载体。回收后，在1.5毫升微量离心管中将线性化载体、PCR产物、5倍无缝克隆缓冲液以及无缝克隆试剂盒中的无缝克隆酶混合。确保总体积为10 µL。将样本置于37°C水浴中30分钟。孵育结束后，立即使用样本，或在冰上冷冻后于20°C保存。向90微升的大肠杆菌DH10B中加入10微升的构建质粒，进行化学转化。随后将转化后的细胞涂布于LB平板上，在37摄氏度下培养。第二天，挑选多个克隆接种于5 mL液体LB培养管中，于37摄氏度、220 rpm条件下在摇床中过夜培养。使用质粒提取试剂盒提取质粒，随后通过Sanger测序鉴定正确的克隆。需知C-Brick路径的构建也可通过反应性PCI应用实现，或通过在T4 DNA连接酶介导的连接反应中立即进行限制性消化来完成。接下来，为用Cpf1消化C-Brick载体，取无RNase的水、10× Cpf1缓冲液、质粒、重组RNase抑制剂和Cpf1，在1.5毫升微量离心管中混合。为将外源DNA片段插入T1和T2位点，加入1 µL crRNA T2，并将反应管置于37 °C水浴中孵育30分钟。然后，将离心管保持在水浴中，加入1 µL crRNA T1和1 µL Cpf1，再孵育30分钟。先加入crRNA T2，因为两个识别位点在载体DNA上距离较近，Cpf1在T1位点的结合可能会影响T2位点的结合。此外，如果 T2' 位点替换了 T2 位点，那么当先加入 crRNA T1 时，T2' 位点将会被破坏。加入一微升热敏感碱性磷酸酶，并将反应管置于 37 摄氏度水浴中再孵育一小时。进行琼脂糖凝胶电泳，并使用胶回收试剂盒纯化载体。立即使用样本，或在 -20 摄氏度下冷冻保存。为了用 Cpf1 消化目的 DNA 片段，将无 RNase 水、10× Cpf1 缓冲液、质粒、重组 RNase 抑制剂和 Cpf1 混合于一个 1.5 毫升微量离心管中。为了将外源 DNA 片段插入 T1 和 T2 位点，向管中加入 1 微升 crRNA T1 和 1 微升 crRNA T3，并在 37 摄氏度水浴中孵育 2 小时。孵育结束后，进行琼脂糖凝胶电泳，并使用胶回收试剂盒纯化片段。样品可立即使用，或冷冻并保存在 -20 摄氏度。接下来，将外源 DNA 片段连接至 C-Brick 载体中，需在 1.5 毫升微量离心管中混合线性化载体与 DNA 片段。加入10倍浓度的T4 DNA连接酶缓冲液和T4 DNA连接酶。然后在22摄氏度下孵育两小时。样品应立即使用，或在20摄氏度下冷冻保存。取10微升连接产物加入大肠杆菌DH10B感受态细胞中，进行化学转化。然后将转化后的大肠杆菌涂布于LB平板上，在37摄氏度下培养。次日，挑取多个克隆加入5毫升液体LB培养管中，在220 rpm、37摄氏度条件下振荡培养过夜。使用质粒提取试剂盒提取质粒。然后通过Sanger测序鉴定正确的克隆。进行新一轮的C-Brick组装。利用该样品，所谓的裂解克隆可作为新的C-Brick载体或DNA片段用于进一步的C-Brick迭代组装。本视频中所述，已将三种色素蛋白盒（cjBlue、eforRed和amilGFP）进行组装。这三种色素蛋白在平板培养的大肠杆菌中得到表达。第四块平板显示了不含色素蛋白的阴性对照细菌。随后，两个颜色表达盒进一步与C-Brick标准元件组装，以产生更多颜色。三种色素蛋白及三种组装的双色素蛋白在大肠杆菌中表达，菌株培养于液体LB培养基中。从一到六，所表达的构建体分别为 eforRed、一、amilGFP、二、cjBlue、三、amilGFP 加 eforRed、四、eforRed 加 cjBlue、五，以及 amilGFP 加 cjBlue、六。单个培养皿上或单个微量离心管中的彩色细菌均培养自一个经序列验证的克隆。一旦掌握，若操作得当，该技术可在一周内完成。在进行该实验操作时，重要的是要牢记所有材料都应保持无RNase，以用于siRNA制备和Cpf1清除。我仍然推荐这一策略，它已帮助合成生物学领域的研究人员构建出代谢通路的遗传展示体系。观看本视频后，您应能充分理解如何使用C-Brick标准组装DNA通路。

protocols-for-c-brick-dna-standard-assembly-using-cpf1

Research

科研

JoVE Journal

Genetics

遗传学

使用Cpf1的C-Brick DNA标准装配的方案

利用标准的可互换DNA元件（BioBricks），设计了一种用于修复石油污染的可持续自调控细菌系统。通过β-氧化途径，构建的大肠杆菌（E.

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在Drosophila中利用重组工程构建同源重组载体

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鉴定基因与调控元件之间的物理相互作用具有挑战性，但染色体构象捕获技术为此提供了便利。该4C-seq方案的改进通过减少PCR模板的过度扩增，减轻了PCR偏好性，同时通过增加限制性内切酶消化步骤，提高了测序读段的可比对性。...

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由小型环状DNA分子构建的稳定DNA序列基序、一维和二维纳米结构

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使用 In-Cloning 工具包通过模块化克隆（MoClo）标准化组装多顺反子操纵子

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基于CRISPR的穿梭克隆：一种高通量克隆方法

学习使用Cpf1和C-Brick标准进行DNA组装的方案，该方法不依赖特定序列并支持迭代组装，适用于合成生物学中构建复杂遗传回路的研究。

使用Cpf1进行C-Brick DNA标准组装的实验方案

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