使用Cpf1的C-Brick DNA标准装配的方案
2017年6月15日
CRISPR相关蛋白Cpf1可以由专门设计的CRISPR RNA（crRNA）引导，以在所需位点切割双链DNA，产生粘性末端。基于此特点，建立了DNA组装标准（C-Brick），并详细介绍了其使用方法。
以下视频详细介绍了使用 C-Brick 标准品通过 CRISPR 相关蛋白 Cpf1 组装 DNA 部分的程序。该方法可以进一步推动合成生物学领域 DNA 组装的发展。例如通过促进复杂遗传回路的构建。
这种方法的主要优点是它独立于序列，并允许 DNA 构建体的迭代组装。当我们注意到 Cpf1 受单个 siRNA 和催化 DNA 堆积的引导时，我们第一次想到了这种方法。因此，生成 DKN。
演示该程序的是我实验室的研究生 Shi-Yuan Li。为了修复 crRNA 模板，将单个寡核苷酸重新悬浮于不含 RNase 的水中至浓度为 10 微摩尔。向 0.2 mL PCR 管中加入上链寡核苷酸、下链寡核苷酸和 10x 退火缓冲液，如随附文件中所述。
确保总体积为 50 微升。下表显示了六种不同的底链寡核苷酸，每种寡核苷酸都应与上链 T7-F 单独配对。小写字母表示要转录成 crRNA 向导序列的序列。
将 PCR 管放入热循环仪中。运行退火程序，在 95 摄氏度下进行初始脱硝 5 分钟，然后从 95 摄氏度冷却到 20 摄氏度，每分钟降低 1 摄氏度。退火后，将退火产物与不含 RNase 的水、T-7 转录缓冲液、NTP 混合物、重组 RNase 抑制剂和 T-7 RNase 聚合酶混合在 1.5 mL 微量离心管中，立即进行转录。
将反应物在 37 摄氏度的水浴中孵育过夜。第二天，使用 RNA 纯化和浓缩试剂盒纯化转录的 RNA。使用 UV-Vis 分光光度计定量 RNA。
然后，将 RNA 稀释至 10 微摩尔的浓度。如果样品不立即使用，请将其储存在 80 摄氏度。C-Brick 零件的构造可以通过多种方法完成。
在视频的这一部分，将使用无缝组装方法组装三个色蛋白盒 cjBlue、eforRed 和 amilGFP。首先设计和订购用于染色质蛋白盒 PCR 扩增的寡核苷酸。当寡核苷酸到达时，将它们重新悬浮于超纯水中至浓度为 10 微摩尔。
接下来，为了设置 PCR 反应，将 0.2 毫升 PCR 管放在冰上。加入超纯水、两种 XPCR 缓冲液、DNTP、正向和反向引物、色蛋白模板和高保真 DNA 聚合酶。将试管直接放入热循环仪中并运行程序。
立即使用样品，或冷冻并储存在 20 摄氏度。扩增后，使用试剂盒纯化 PCR 产物。接下来，要用 BamH1 消化 C-Brick 标准载体，向试管中加入超纯水、质粒、10x 缓冲液和 BamH1。
在 37 摄氏度的水浴中孵育长达 2 小时。使用凝胶纯化试剂盒纯化线性化载体。纯化后，将线性化载体、PCR 产物、5x 无缝组装缓冲液和无缝组装试剂盒中的无缝组装酶混合在 1.5 mL 微量离心管中。
确保总体积为 10 微升。将其放入 37 摄氏度的水浴中 30 分钟。孵育后，立即使用样品或将其冷冻在冰上并储存在 20 摄氏度。
向 90 μL 大肠杆菌 DH10B 中加入 10 μL 构建体。执行化学转化。然后，将转化的细胞铺在 LB 板上，并在 37 摄氏度下孵育。
第二天，选择几个克隆在 5 mL 液体 LB 管中培养，并在 37 摄氏度下在摇床上以 220 rpm 的速度孵育过夜。使用质粒制备试剂盒提取质粒。然后，通过 Sanger 测序鉴定正确的克隆。
要知道，C-Brick 通路的构建也可以通过反应性 PCI 应用或通过限制 T4 DNA 连接酶培养基的立即消化到连接来完成。接下来，为了用 Cpf1 消化 C-Brick 载体，将不含 RNase 的水、10x Cpf1 缓冲液、质粒、重组 RNase 抑制剂和 Cpf1 混合在 1.5 mL 微量离心管中。要将外源 DNA 片段插入 T1 和 T2 位点，请添加 1 微升 crRNA T2，并将试管置于 37 摄氏度的水浴中孵育 30 分钟。
然后，将试管放在水浴中，加入 1 μL crRNA T1、1 μL Cpf1，再孵育 30 分钟。首先添加 crRNA T2，因为两个识别位点在载体 DNA 上更接近。T1 位点上的 Cpf1 结合可能会影响 T2 位点的铺设。
此外，如果 T2 位点取代了 T2 位点，那么如果先添加 crRNA T1，T2 位点就会被破坏。加入 1 微升热敏性碱性磷酸酶，并将试管在 37 摄氏度的水浴中再孵育一小时。进行琼脂糖凝胶电泳，并使用凝胶纯化系统试剂盒纯化载体。
立即使用样品，或冷冻并储存在 20 摄氏度。为了用 Cpf1 消化目标 DNA 片段，将不含 RNase 的水、10x Cpf1 缓冲液、质粒、重组 RNase 抑制剂和 Cpf1 混合在 1.5 mL 微量离心管中。要将外源 DNA 片段插入 T1 和 T2 位点，向试管中加入 1 微升 crRNA T1 和 1 微升 crRNA T3，并在 37 摄氏度的水浴中孵育 2 小时。
孵育后，进行琼脂糖凝胶电泳并使用凝胶纯化试剂盒纯化片段。立即使用样品，或冷冻并储存在 20 摄氏度。接下来，要在 C-Brick 载体中连接外源 DNA 片段，将线性化载体和 DNA 片段混合在 1.5 mL 微量离心管中。
加入 10x T4 DNA 连接酶缓冲液和 T4 DNA 连接酶。然后，在 22 摄氏度下孵育 2 小时。立即使用样品，或冷冻并储存在 20 摄氏度。
将 10 μL 连接产物添加到大肠杆菌 DH10B 感受态细胞中，并进行化学转化。然后，将转化的大肠杆菌涂抹在 LB 平板上，并在 37 摄氏度下孵育。第二天，将几个克隆添加到 5 mL液体LB管中，并在摇床上以220 rpm和37°C孵育过夜。
使用质粒制备试剂盒提取质粒。然后，通过 Sanger 测序鉴定正确的克隆。执行新一轮 C-Brick 装配。
使用该样品，所谓的裂解克隆可以用作新的 C-Brick 载体或 DNA 片段，用于进一步的 C-Brick 迭代组装。如本视频所述组装三个色蛋白盒 cjBlue、eforRed 和 amilGFP。三种染色体蛋白在平板上生长的大肠杆菌中表达。
没有色蛋白的阴性对照细菌显示在第四个板上。随后，两个颜色表达盒与 C-Brick 标准进一步组装以产生更多颜色。3 个染色蛋白和 3 个组装的双染色蛋白在液体 LB 培养基中生长的大肠杆菌中表达。
从 1 到 6，表达的构建体是 eforRed，1，amilGFP，2，cjBlue，3，amilGFP 加 eforRed，4，eforRed 加 cjBlue，5，和 amilGFP 加 cjBlue，6。单个板或单个微量离心管中的彩色细菌是从单个序列验证的克隆中培养的。一旦掌握，如果执行得当，这项技术可以在一周内完成。
在尝试此程序时，请务必记住，所有材料都应不含 RNase，用于 siRNA 制备和 Cpf1 清除。我仍然建议，这种策略有助于合成生物学领域的研究人员建立代谢途径的遗传展示。看完这个视频后，您应该对如何使用 C-Brick 标准组装 DNA 通路有了很好的了解。
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概览
本文介绍了一种使用CRISPR相关蛋白Cpf1和称为C-Brick的DNA组装标准来组装DNA部分的方法。该技术允许序列独立和迭代地组装DNA构建体，从而促进复杂的遗传电路的构建。
关键研究组成部分
科学领域
- 合成生物学
- 基因工程
- CRISPR技术
背景
- CRISPR相关蛋白Cpf1可以在特定位点切割双链DNA。
- C-Brick标准是为了利用这一特性进行DNA组装而开发的。
- 该方法提高了构建遗传电路的效率。
- 它由特别设计的CRISPR RNA（crRNA）引导。
研究目的
- 提供在DNA组装中使用C-Brick标准的协议。
- 展示使用Cpf1进行基因工程的优势。
- 促进DNA构建体的迭代组装。
使用的方法
- 利用crRNA引导的Cpf1蛋白。
- 应用C-Brick标准进行DNA组装。
- 组装过程的视频演示。
- 分析该方法的序列独立性。
主要结果
- 该方法允许构建复杂的遗传电路。
- 它对DNA部分的迭代组装有效。
- Cpf1的独特性质使DNA切割高效。
- 该协议对合成生物学研究人员来说是可访问的。
结论
- C-Brick标准代表了DNA组装技术的重大进步。
- 这种方法对于旨在构建复杂遗传系统的研究人员来说是有利的。
- 未来的应用可能包括更复杂的合成生物学项目。
常见问题
Executive Industry Relevance
The C-Brick DNA assembly standard using Cpf1 enables sequence-independent, iterative construction of complex genetic circuits, directly supporting synthetic biology innovation. This approach enhances modularity and scalability in early discovery and engineering of biological systems, reducing technical barriers for rapid prototyping. Its standardized, reusable workflow positions it as a foundational tool for biopharma R&D teams focused on genetic construct design and pathway engineering.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Facilitates rapid assembly and testing of genetic constructs for pathway interrogation.
- Enables modular validation of biological parts, supporting functional target assessment.
- Supports iterative hypothesis testing by allowing seamless addition or replacement of DNA elements.
Screening & Assay Development
- Prepares standardized DNA constructs for downstream screening of genetic functions.
- Ensures reproducibility and scalability through defined assembly sites and short scars.
- Enables efficient generation of variant libraries for assay optimization.
Translational & Preclinical Research
- Supports construction of multi-gene circuits relevant to disease models or synthetic pathways.
- Maintains continuity from discovery to preclinical validation by enabling reuse of assembled constructs.
- Reduces risk of sequence artifacts, supporting reliable translational research outputs.
Pipeline & Workflow Integration
The C-Brick standard integrates at the interface of early discovery and lead identification, providing a robust platform for genetic construct assembly and iterative optimization.
- Discovery Biology: Accelerates hypothesis-driven design and testing of genetic pathways.
- Screening: Delivers reproducible, modular constructs for high-throughput functional assays.
- Analytics: Supports quantitative assessment of construct performance via standardized assembly and sequence verification.
- Translational Research: Enables direct transfer of validated constructs into preclinical models when relevant.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable assembly framework for ongoing synthetic biology projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in genetic circuit function and reduces mechanistic ambiguity.
- Operational Value: Standardizes assembly processes, improving reproducibility and scalability across teams.
- Strategic Value: Enables faster go/no-go decisions and more efficient resource allocation in construct development.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of synthetic biology initiatives and construct advancement.
Implementation Considerations
- Requires expertise in molecular cloning, CRISPR systems, and sequence verification.
- Needs access to thermocyclers, gel electrophoresis, and sequencing infrastructure.
- Demands strict RNase-free technique for crRNA preparation and Cpf1 reactions.
- Standardization across teams is essential for reproducibility and data comparability.
- Adaptation to different host systems may require protocol optimization.
