Name: 使用Cpf1的C-Brick DNA标准装配的方案 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 3 s
Description: 学习使用Cpf1和C-Brick标准进行DNA组装的方案，该方法不依赖特定序列并支持迭代组装，适用于合成生物学中构建复杂遗传回路的研究。

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我们感谢上海兆维生物技术有限公司在C-Brick标准开发过程中提供的技术协助。本工作得到了中国科学院战略性先导科技专项（项目编号：XDB19040200）的资助。

1. crRNA 的制备
<ol>
	<li>crRNA模板的制备
	<ol>
		<li>将各个寡核苷酸（表1）用无RNase的水重悬，配制成10 µM的浓度。</li>
		<li>在0.2 mL的PCR管中加入22.5 µL的上链寡核苷酸（表1中的T7-F）、22.5 µL的下链寡核苷酸（表1）以及5 µL的10×退火缓冲液，总体积应为50 µL。 
		注：在表1中列出了六种不同的下链寡核苷酸，每种均应与上链T7-F单独配对使用。表1中的小写字母代表将被转录为crRNA引导序列的序列。可使用10×Taq PCR缓冲液替代10×退火缓冲液。</li>
		<li>将PCR管放入热循环仪中。</li>
		<li>运行退火程序：95 °C初始变性5分钟，随后以每分钟降低1 °C的速率从95 °C降温至20 °C。 
		注：退火完成后应立即用于步骤1.2.1。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>crRNA的转录与纯化
	<ol>
		<li>在1.5 mL微量离心管中加入38 µL无RNase的水、8 µL步骤1.1.4中的模板、20 µL的5×T7转录缓冲液、20 µL的NTP混合物（10 µM）、4 µL的重组RNase抑制剂（RRI）以及10 µL的T7 RNA聚合酶，总体积应为100 µL。</li>
		<li>将微量离心管置于37 °C水浴中过夜（约16小时）。</li>
		<li>使用RNA纯化与浓缩试剂盒对转录产物进行纯化，操作步骤遵循制造商的说明书。</li>
		<li>使用紫外-可见分光光度计对RNA进行定量，并将RNA稀释至10 µM的浓度。样品应立即使用或储存于-80 °C。 
		注：crRNA序列列于表2中。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. C-Brick 片段的构建（即 将生物片段插入 C-Brick 标准载体）
注意：此步骤包含三个子步骤。对于较短的生物元件（例如启动子和终止子），最好采用直接PCR方法将生物元件插入C-Brick标准载体4。完整载体序列见补充数据，前缀和后缀序列见图1（如下步骤2.1）。对于可通过PCR轻松获得的生物元件（例如以基因组DNA、质粒或从头合成的DNA序列为模板），最好采用无缝克隆方法将生物元件插入C-Brick标准载体（如下步骤2.2）。对于来源于BioBrick和BglBrick标准的元件，可使用限制性内切酶介导的消化和T4 DNA连接酶介导的连接方法，将生物元件插入C-Brick标准载体（如下步骤2.3）。
<ol>
	<li>通过直接PCR扩增构建
	<ol>
		<li>设计并订购用于PCR扩增的寡核苷酸。 
		注意：寡核苷酸的5'-端包含目标DNA片段的序列，而3'-端包含载体序列（即，正向链3'-端为&#34;GGATCCACTAGTCTCTAGCTCG&#34;，反向链为&#34;GGATCCTTTCTCCTCTTTCTAG&#34;）。寡核苷酸5'-端可设计为无突出端或约20 bp的突出端。具体示例可参见先前的研究4。</li>
		<li>将各寡核苷酸用超纯水重悬至10 µM的浓度。</li>
		<li>在冰上于0.2 mL PCR管中配制PCR反应体系：加入18 µL超纯水、25 µL 2x PCR缓冲液、1 µL dNTPs（10 µM）、各2.5 µL步骤2.1.2中的正向和反向引物（10 µM）、0.5 µL C-Brick标准载体（50 ng）作为模板，以及0.5 µL高保真DNA聚合酶。确保总体积为50 µL。</li>
		<li>将PCR管直接放入热循环仪中并启动程序。样品可立即使用，或冻存于-20 °C备用。</li>
		<li>热循环程序：98 °C预变性3 min，1个循环；随后进行30个循环：98 °C变性10 s、55 °C退火20 s、72 °C延伸2 min；最后72 °C延伸10 min，1个循环。反应结束后将样品保持在16 °C。</li>
		<li>取步骤2.1.4中的混合物9 µL加入1.5 mL微量离心管中。</li>
		<li>加入1 µL DpnI，于37 °C水浴中孵育1 h。 
		注意：若引物无重叠序列，则需额外加入0.5 µL T4多核苷酸激酶（PNK）和0.5 µL T4 DNA连接酶，并于22 °C水浴中孵育1 h。若引物含有约20 nt的重叠序列，则可将DpnI处理后的产物直接转化至E. coli（DH10B）感受态细胞中（步骤2.4）。线性PCR产物将在宿主细胞的重组系统作用下环化。</li>
		<li>样品可立即使用，或于-20 °C保存。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过无缝连接构建
	<ol>
		<li>设计并订购用于PCR扩增的寡核苷酸。 
		注意：寡核苷酸的3'-端包含目标DNA片段的末端序列，5'-端则包含线性化C-Brick标准载体的末端序列（即，正向链5'-端为&#34;CTAGAAAGAGGAGAAAGGATCC&#34;，反向链5'-端为&#34;CGAGCTAGAGACTAGTGGATCC&#34;）。具体示例可参见先前的研究4。</li>
		<li>将各寡核苷酸用超纯水重悬至10 µM的浓度。</li>
		<li>在冰上于0.2 mL PCR管中配制PCR反应体系：加入18 µL超纯水、25 µL 2x PCR缓冲液、1 µL dNTPs（10 µM）、各2.5 µL步骤2.2.2中的正向和反向引物（10 µM）、0.5 µL模板（20–500 ng）以及0.5 µL高保真DNA聚合酶。确保总体积为50 µL。</li>
		<li>将PCR管直接放入热循环仪中并运行程序。样品可立即使用，或冻存于-20 °C备用。 
		注意：热循环程序设置为：98 °C预变性3 min，1个循环；随后进行30个循环：98 °C变性10 s、55 °C退火20 s（根据引物的退火温度调整）、72 °C延伸1 min（根据生物元件长度调整）；最后72 °C延伸10 min，1个循环。反应结束后将样品保持在16 °C。</li>
		<li>使用PCR纯化试剂盒对PCR产物进行纯化；操作遵循制造商说明书。</li>
		<li>用BamHI酶切C-Brick标准载体：在微量离心管中加入34 µL超纯水、10 µL质粒（1 µg）、5 µL 10x缓冲液和1 µL BamHI。于37 °C水浴中孵育最多2 h。</li>
		<li>使用凝胶纯化试剂盒对上述产物进行纯化；操作遵循制造商说明书。</li>
		<li>在1.5 mL微量离心管中加入步骤2.2.7所得的线性化载体2 µL（50 ng）、步骤2.2.4所得的片段5 µL（200 ng）、5x无缝连接缓冲液2 µL，以及无缝连接试剂盒中的无缝连接酶1 µL。确保总体积为10 µL。</li>
		<li>将反应体系置于37 °C水浴中孵育30 min。样品可立即使用，或冻存于-20 °C备用。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过限制性内切酶消化与T4 DNA连接酶介导的连接构建。 
	注意：对于来源于BioBrick标准（步骤2.3.4–2.3.7）和BglBrick标准（步骤2.3.1–2.3.3）的元件，可通过限制性内切酶消化与T4 DNA连接酶介导的连接，将生物元件插入C-Brick标准载体中。
	<ol>
		<li>用BamHI和BglII酶切BglBrick标准元件：在微量离心管中加入34 µL超纯水、10 µL质粒（2 µg）、5 µL 10x缓冲液3、0.5 µL BamHI和0.5 µL BglII。于37 °C水浴中孵育2 h。</li>
		<li>进行1%琼脂糖凝胶电泳，并使用凝胶纯化试剂盒回收目标片段。</li>
		<li>将片段与C-Brick标准载体连接：在1.5 mL微量离心管中加入步骤2.1.12所得的线性化载体2 µL（50 ng）和步骤2.3.3所得的片段6 µL（200 ng）。加入1 µL 10x T4 DNA连接酶缓冲液和1 µL T4 DNA连接酶。于22 °C孵育2 h。样品可立即使用，或冻存于-20 °C备用。</li>
		<li>用XbaI和SpeI酶切BioBrick标准元件：在微量离心管中加入34 µL超纯水、10 µL质粒（2 µg）、5 µL 10x缓冲液、0.5 µL XbaI和0.5 µL SpeI。于37 °C水浴中孵育2 h。</li>
		<li>用XbaI和SpeI酶切C-Brick标准载体：在微量离心管中加入34 µL超纯水、10 µL质粒（1 µg）、5 µL 10x缓冲液、0.5 µL XbaI和0.5 µL SpeI。于37 °C水浴中孵育2 h。</li>
		<li>进行1%琼脂糖凝胶电泳，并使用凝胶纯化试剂盒分别回收步骤2.3.4中的片段和步骤2.3.5中的线性化载体；操作遵循制造商说明书。</li>
		<li>将片段与C-Brick载体连接：在1.5 mL微量离心管中加入步骤2.3.5所得的线性化载体2 µL（50 ng）和步骤2.3.4所得的片段6 µL（200 ng）。加入1 µL 10x T4 DNA连接酶缓冲液和1 µL T4 DNA连接酶。于22 °C孵育2 h。样品可立即使用，或冻存于-20 °C备用。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>取步骤2.1.8、2.2.9、2.3.3或2.3.7所得产物各10 µL，用于化学转化E. coli（DH10B）感受态细胞。</li>
	<li>挑取数个克隆接种至5 mL液体LB培养基中，于37 °C摇床（220 rpm）中过夜培养。</li>
	<li>使用质粒提取试剂盒提取质粒；操作遵循制造商说明书。</li>
	<li>通过Sanger测序鉴定正确克隆11。</li>
</ol>
3. C-Brick 组装（图 2）
<ol>
	<li>C-Brick 载体的 Cpf1 消化
	<ol>
		<li>向一个1.5 mL微量离心管中加入22.5 µL无RN酶水、4 µL 10x Cpf1缓冲液、10 µL步骤2.6的质粒（1 µg）、0.5 µL RRI和1 µL Cpf1（5 µM）。 
		注意：Cpf1 可从商业渠道购买，或根据先前研究中的方案进行纯化4.</li>
		<li>为了将外源DNA片段插入T1和T2位点，加入1 µL crRNA-T2（10 µM），在37 °C水浴中孵育30分钟。 A加入1 µL crRNA-T1（10 µM）和Cpf1（5 µM），继续孵育30分钟。 
		注意：或者，若要将外源DNA片段插入T3和T4位点，可加入1 µL crRNA-T3（10 µM），在37 °C水浴中孵育30分钟；再加入1 µL crRNA-T4（10 µM），继续孵育30分钟。</li>
		<li>加入1 µL热敏碱性磷酸酶，将试管置于37 °C水浴中再孵育1小时。</li>
		<li>进行琼脂糖凝胶电泳，并使用凝胶回收试剂盒纯化载体。样品可立即使用，或于 -20 °C 冻存备用。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Cpf1 对 DNA 片段的消化
	<ol>
		<li>向一个1.5 mL微量离心管中加入21.5 µL无RN酶水、4 µL 10x Cpf1缓冲液、步骤2.6中的质粒10 µL（2 µg）、0.5 µL RRI和2 µL Cpf1（5 µM）。</li>
		<li>为了将外源DNA片段插入T1和T2位点，加入1 µL crRNA-T1（10 µM）和1 µL crRNA-T3（10 µM），在37 °C水浴中孵育2小时。 
		注意：也可加入1 µL crRNA-T2（10 µM）和1 µL crRNA-T4（10 µM），在37 °C水浴中孵育2小时。</li>
		<li>进行琼脂糖凝胶电泳，并使用胶回收试剂盒纯化片段。样品可立即使用，或冷冻后于 -20 °C 保存。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>C-Brick 连接组装及进一步验证
	<ol>
		<li>将外源DNA片段与C-Brick载体连接：取2 µL第3.1.4步中线性化的载体（50 ng）和6 µL第3.2.3步中的DNA片段（200 ng），加入1.5 mL微量离心管中。加入1 µL 10x T4 DNA连接酶缓冲液和1 µL T4 DNA连接酶。22 °C孵育2 h。样品可立即使用，或于-20 °C冻存备用。</li>
		<li>加入10 µL连接产物（步骤3.3.1）用于化学转化 E. coli (DH10B) 感受态细胞</li>
		<li>将多个克隆加入5 mL液体LB培养基中，置于摇床于37 °C、220 rpm条件下过夜培养。</li>
		<li>使用质粒提取试剂盒提取质粒；按照生产商提供的说明书操作。</li>
		<li>通过Sanger测序鉴定正确克隆11.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>进行新一轮的C-Brick组装。第3.3.4步中筛选出的正确克隆可作为新的C-Brick载体或DNA片段，按照3.1–3.3步骤的相同方案进行后续迭代的C-Brick组装。 
	注意：T2' 和 T3' 位点是作为 T2 和 T3 位点的备用设计图1a对于从步骤 2.3.7 获得的质粒，仅可使用 T2' 和 T3' 进行 C-Brick 标准组装。</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本方案描述了C-Brick DNA组装标准的操作流程。该方案中最关键的步骤是C-Brick标准载体的线性化；若载体未完全酶切，将严重影响实验成功率。此外，尽管Cpf1主要在&#34;18-23&#34;的切割模式下切割目标DNA序列，但也有研究检测到其在临近两个碱基处发生不精确切割4，这可能导致DNA组装后产生少量突变。因此，需要通过Sanger测序验证组装产物的正确性。
C-Brick 组装的效率低于先前研究中描述的传统限制性内切酶和连接方法4。影响组装效率的主要原因可能是 Cpf1 的切割特性不够精确。未来，提高切割准确性将对标准化具有重要意义，目前相关改进工作正在探索中。
C-Brick 与 BglBrick 和 BioBrick 标准也具有部分兼容性。例如，BglBrick 部件可用 BglII 和 BamHI 切割，然后插入 C-Brick 标准载体的 BamHI 位点，从而生成一个 C-Brick 部件。然而，应验证 B...

DNA生物元件的标准化对于合成生物学的发展至关重要1DNA组装方法的开发可替代 特设的 实验设计，并减少在将遗传元件组装成更大系统过程中出现的许多意外结果。BioBrick 标准（BBF RFC 10）是最早提出的 DNA 组装标准之一。该标准使用前缀序列（包含 EcoRI 和 XbaI 酶切位点）和后缀序列（包含 SpeI 和 PstI 酶切位点）2,3由于 XbaI 和 SpeI 具有互补的黏性末端，因此用 XbaI 和 SpeI 切割的 BioBrick DNA 片段可以连接在一起，形成新的 BioBrick，用于进一步的迭代组装。
在使用 BioBrick 标准时已发现一些缺陷4。例如，它会在 DNA 片段之间产生一个 8 bp 的“疤痕”序列，从而无法构建融合蛋白。此外，必须从 DNA 片段中去除上述四种 6 bp 限制性酶切位点，这非常不便。BglBrick 标准的建立旨在解决第一个问题5。它产生一个 6 bp 的 &#34;GGATCT&#34; 疤痕序列，编码甘氨酸-丝氨酸（Gly-Ser），从而实现多个蛋白或蛋白结构域的融合。iBrick 则是为解决第二个问题而开发的6。它利用识别长DNA序列的归巢内切酶（homing endonucleases, HEs）。由于HE的识别位点在天然DNA序列中极为罕见，因此iBrick标准可直接用于构建iBrick元件，而无需修改其DNA序列。然而，iBrick标准在DNA片段之间会留下21 bp的疤痕序列，这可能是其未被广泛采用的原因。
近年来，成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPR）系统发展迅速7,8。在CRISPR相关蛋白（Cas蛋白）中，源自Streptococcus pyogenes的Cas9核酸内切酶目前已得到广泛应用，其主要引起具有平末端的双链DNA断裂（DSBs）9。
2015年，Zhang 及其同事首次对 Cpf1（来自 Prevotella 和 Francisella 1 的 CRISPR）进行了表征。Cpf1 属于第2类 V 型 CRISPR-Cas 系统，是一种由 CRISPR RNA（crRNA）引导的内切核酸酶10。与 Cas9 不同，Cpf1 引发的双链断裂（DSB）具有 4 或 5 个核苷酸的 5' 突出末端10。基于这一特性，研究人员开发了一种 DNA 组装标准——C-Brick4。在 C-Brick 标准载体上，生物元件两侧分别被预置的 T1/T2 和后置的 T3/T4 四个 Cpf1 靶位点所包围，这与 BioBrick 标准类似。由于 T2 和 T3 位点的切割可产生互补的黏性末端，因此可在组装 DNA 元件的同时，在元件之间生成一个 &#34;GGATCC&#34; 的短序列“疤痕”。值得注意的是，C-Brick 标准具有两个主要优势：识别较长的靶序列以及留下较短的疤痕序列。C-Brick 产生的 6 bp &#34;GGATCC&#34; 疤痕编码甘氨酸-丝氨酸（Gly-Ser），可用于构建融合蛋白。此外，C-Brick 标准还与 BglBrick 和 BioBrick 标准部分兼容。

<table><tbody><tr><td>商业寡核苷酸</td><td>Sangon Biotech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>10x Taq PCR 缓冲液</td><td>Transgen</td><td>#J40928</td><td></td></tr><tr><td>超纯蒸馏水</td><td>Invitrogen</td><td>10977-015</td><td></td></tr><tr><td>5x RNA 转录缓冲液</td><td>Thermo Scientific</td><td>K0441</td><td></td></tr><tr><td>T7 RNA 聚合酶</td><td>Thermo Scientific</td><td>#EP0111</td><td></td></tr><tr><td>NTP 混合物</td><td>Sangon</td><td>#ND0056</td><td></td></tr><tr><td>RRI（重组 RNase 抑制剂）</td><td>Takara</td><td>2313A</td><td></td></tr><tr><td>RNA Clean &amp; Concentrator-5</td><td>Zymo Research</td><td>R1015</td><td></td></tr><tr><td>UV-Vis 分光光度计</td><td>Thermo Scientific</td><td>Nano-Drop 2000c</td><td></td></tr><tr><td>2x Phanta Max 缓冲液</td><td>Vazyme</td><td>PB505</td><td>PCR 缓冲液</td></tr><tr><td>dNTPs</td><td>Transgen</td><td>AD101</td><td></td></tr><tr><td>Phanta Max 超保真 DNA 聚合酶</td><td>Vazyme</td><td>P505-d1</td><td></td></tr><tr><td>Ezmax 一步法克隆试剂</td><td>Tolobio</td><td>24303-1</td><td>无缝连接试剂盒</td></tr><tr><td>Ezmax 一步法克隆 5x 缓冲液</td><td>Tolobio</td><td>32006</td><td></td></tr><tr><td>BamHI</td><td>NEB</td><td>#R0136L</td><td></td></tr><tr><td>BamHI-HF</td><td>NEB</td><td>#R3136L</td><td></td></tr><tr><td>BglII&amp;nbsp;</td><td>NEB</td><td>#R0144L</td><td></td></tr><tr><td>XbaI</td><td>NEB</td><td>#R0145L</td><td></td></tr><tr><td>SpeI</td><td>NEB</td><td>#R3133L</td><td></td></tr><tr><td>10x Buffer 3</td><td>NEB</td><td>#B7003S</td><td></td></tr><tr><td>10x CutSmart 缓冲液</td><td>NEB</td><td>B7204S</td><td></td></tr><tr><td>10x T4 DNA 连接酶缓冲液</td><td>Tolobio</td><td>32002</td><td></td></tr><tr><td>T4 PNK</td><td>Tolobio</td><td>32206</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA 连接酶</td><td>Tolobio</td><td>32210</td><td></td></tr><tr><td>DpnI</td><td>NEB</td><td>#R01762</td><td></td></tr><tr><td>SV 凝胶与 PCR 产物纯化系统</td><td>Promega</td><td>A9282</td><td></td></tr><tr><td>质粒小提试剂盒 I</td><td>Omega</td><td>D6943-02</td><td>质粒制备试剂盒</td></tr><tr><td>热敏感碱性磷酸酶&amp;nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>#EF0651</td><td>FastAP</td></tr><tr><td>10x Cpf1 缓冲液</td><td>Tolobio</td><td>32008</td><td></td></tr><tr><td>Cpf1</td><td>Tolobio</td><td>32105</td><td>FnCpf1</td></tr><tr><td>PCR 仪</td><td>Applied Biosystems</td><td>veriti 96 well</td><td></td></tr><tr><td>C-Brick 标准载体</td><td>Tolobio</td><td>98101</td><td></td></tr><tr><td>大肠杆菌 [DH10B]</td><td>Invitrogen</td><td>18297010</td><td></td></tr><tr><td>LB 培养基（胰蛋白胨）</td><td>Oxoid</td><td>LP0042</td><td></td></tr><tr><td>LB 培养基（酵母提取物）</td><td>Oxoid</td><td>LP0021</td><td></td></tr><tr><td>LB 培养基（NaCl）</td><td>Sangon Biotech</td><td>B126BA0007</td><td></td></tr></tbody></table>

使用cpf1进行c-brick dna标准组装的实验方案

Protocols for C-Brick DNA Standard Assembly Using Cpf1

CRISPR 相关蛋白 Cpf1 在 CRISPR RNA（crRNA）的引导下切割双链 DNA，产生黏性末端。由于这一特性，Cpf1 已被用于建立一种名为 C-Brick 的 DNA 组装标准，该标准具有识别位点长、疤痕序列短的优点。在标准的 C-Brick 载体上，生物 DNA 片段两侧包含四个 Cpf1 识别位点——前缀区（T1 和 T2 位点）和后缀区（T3 和 T4 位点）。T2 和 T3 位点的切割可产生互补的黏性末端，从而实现带有 T2 和 T3 位点的 DNA 片段的组装。同时，在片段连接后会在中间生成一个短的 &#34;GGATCC&#34; 疤痕序列。由于新形成的质粒仍包含四个 Cpf1 切割位点，因此该方法支持 DNA 片段的迭代组装，类似于 BioBrick 和 BglBrick 标准。本文描述了使用 C-Brick 标准组装 DNA 片段的操作流程。C-Brick 标准可被科研人员、研究生、本科生乃至业余爱好者广泛使用。

本方案展示了三种色素蛋白表达盒（cjBlue (BBa_K592011)、eforRed (BBa_K592012) 和 amilGFP (BBa_K592010)）的构建。首先，将上述三个基因的编码序列及其终止子分别克隆至C-Brick标准载体中。通过PCR扩增将短DNA元件（启动子和终止子）引入C-Brick载体，所用引物在5'端含有相应的短DNA元件序列，随后采用自连法完成连接。三种编码色素蛋白的序列首先被克隆 从头合成 合成后通过无缝克隆技术插入C-Brick标准载体中。引物信息见先前研究4.
随后，cjBlue、eforRed 和 amilGFP 序列按照图中所示相同步骤，与终止子和启动子序列进行连接。 图2正确的质粒构建体被转化至 E. coli，呈现出绚丽的色彩（<strong class="xf...

CRISPR相关蛋白Cpf1可通过特别设计的CRISPR RNA（crRNA）引导，在特定位置切割双链DNA，产生黏性末端。基于这一特性，建立了一种DNA组装标准（C-Brick），本文详细描述了其使用方案。

使用Cpf1进行C-Brick DNA标准组装的实验方案

CRISPR相关蛋白Cpf1在CRISPR RNA（crRNA）的引导下切割双链DNA，产生黏性末端。由于这一特性……

以下视频详细介绍了利用 C-Brick 标准，通过 CRISPR 相关蛋白 Cpf1 组装 DNA 片段的方法。该方法可进一步推动合成生物学领域中 DNA 组装技术的发展，例如促进复杂遗传回路的构建。该方法的主要优势在于其序列无关性，能够实现DNA片段的迭代组装。我们最初产生这一方法的设想，是源于观察到Cpf1由单链siRNA引导，并将催化性DNA逐级堆叠，从而生成DKNs。进行该实验操作的是我实验室的研究生 Shi-Yuan Li。为修复 crRNA 模板，将各条寡核苷酸用无 RNase 的水重悬，配制成 10 微摩尔浓度。向一个 0.2 毫升 PCR 管中加入上链寡核苷酸、下链寡核苷酸以及 10 倍退火缓冲液，具体用量详见随附文件。确保总体积为 50 微升。此表格显示了六种不同的下游引物寡核苷酸，每种均应分别与上游引物 T7-F 配对。小写字母代表将被转录为 crRNA 指导序列的序列。将PCR管放入热循环仪中。运行退火程序：首先在95摄氏度下变性5分钟，然后以每分钟降低1摄氏度的速率从95摄氏度降温至20摄氏度。退火完成后，立即进行转录反应，将退火产物与无RNase的水、T7转录缓冲液、NTP混合物、重组RNase抑制剂以及T7 RNA聚合酶在1.5毫升微量离心管中混合。将反应物置于37摄氏度水浴中孵育过夜。次日，使用RNA纯化与浓缩试剂盒纯化转录的RNA。使用紫外-可见分光光度计对RNA进行定量。然后，将RNA稀释至10微摩尔的浓度。如果样品未立即使用，请将其储存在-80摄氏度。C-Brick元件的构建可通过多种方法实现。在本段视频中，将使用无缝克隆方法组装三种色蛋白盒：cjBlue、eforRed 和 amilGFP。首先设计并订购用于扩增这些色蛋白盒的寡核苷酸引物。当寡核苷酸到货后，用超纯水将其重悬至 10 微摩尔的浓度。接下来，设置PCR反应时，将0.2毫升PCR管置于冰上。依次加入超纯水、2×PCR缓冲液、dNTPs、正向和反向引物、色素蛋白模板以及高保真DNA聚合酶。将PCR管直接放入热循环仪中，并运行程序。立即使用样本，或在 -20 摄氏度下冷冻保存。扩增后，使用试剂盒纯化 PCR 产物。接下来，为用 BamH1 消化 C-Brick 标准载体，向离心管中加入超纯水、质粒、10x 缓冲液和 BamH1。在37摄氏度水浴中孵育最多两小时。使用凝胶回收试剂盒纯化线性化载体。回收后，在1.5毫升微量离心管中将线性化载体、PCR产物、5倍无缝克隆缓冲液以及无缝克隆试剂盒中的无缝克隆酶混合。确保总体积为10 µL。将样本置于37°C水浴中30分钟。孵育结束后，立即使用样本，或在冰上冷冻后于20°C保存。向90微升的大肠杆菌DH10B中加入10微升的构建质粒，进行化学转化。随后将转化后的细胞涂布于LB平板上，在37摄氏度下培养。第二天，挑选多个克隆接

protocols-for-c-brick-dna-standard-assembly-using-cpf1

Research

科研

JoVE Journal

Genetics

遗传学

使用Cpf1的C-Brick DNA标准装配的方案

利用标准的可互换DNA元件（BioBricks），设计了一种用于修复石油污染的可持续自调控细菌系统。通过β-氧化途径，构建的大肠杆菌（E.

一种可在水环境中实现碳氢化合物转化的工具包

同源重组技术通过实现分子水平上精确突变的构建，极大地推动了黑腹果蝇（Drosophila）遗传学的发展。近年来，重组工程（recombineering）技术的应用使得研究人员能够操作大片段DNA并将其转化到黑腹果蝇（Drosophila）中6。本文所介绍的方法结合了这些技术，可快速构建大型同源重组载体。...

在Drosophila中利用重组工程构建同源重组载体

定制质粒的合成过程费时费力。本实验方案描述了使用吉布森组装克隆技术来减少定制DNA克隆所需的工作量和时间。该方案还能以与传统“剪切-粘贴”DNA克隆相似的成本，获得可靠的用于哺乳动物表达的带标签蛋白载体。...

利用Gibson组装技术构建在人延伸因子-1α启动子调控下表达FLAG标签蛋白的质粒载体

本文介绍了基于质粒回收和限制性酶切位点插入的嵌合体组装方法（CAPRRESI），该方案通过将限制性酶切位点插入同义DNA序列并实现功能性质粒的回收。该方法是一种快速且低成本的蛋白编码基因融合技术。...

CAPRRESI：通过质粒回收与限制性酶切位点插入实现嵌合体组装

鉴定基因与调控元件之间的物理相互作用具有挑战性，但染色体构象捕获技术为此提供了便利。该4C-seq方案的改进通过减少PCR模板的过度扩增，减轻了PCR偏好性，同时通过增加限制性内切酶消化步骤，提高了测序读段的可比对性。...

利用下一代测序技术对染色体构象捕获环化文库（4C-seq）进行基因调控序列的高通量鉴定

我们详细描述了6×6网格可重构DNA手风琴支架的设计、模拟、湿实验及分析的完整实验方案。...

可重构DNA手风琴支架的设计与合成

本文介绍了串联组装gRNA克隆（STAgR）方法，该方法可轻松实现CRISPR/Cas9技术中gRNA载体的多重化。STAgR使gRNA多重化过程变得简单、高效且可定制。...

一种可定制的串联组装gRNA克隆（STAgR）方案

本文介绍了一种小环状DNA分子的T4连接与变性聚丙烯酰胺凝胶纯化、环状瓦片的退火与非变性聚丙烯酰胺凝胶分析、一维和二维DNA纳米结构的组装与原子力显微镜成像，以及有限DNA纳米结构的琼脂糖凝胶电泳与离心纯化等详细实验方案。...

由小型环状DNA分子构建的稳定DNA序列基序、一维和二维纳米结构

本文详细介绍了染色体构象捕获（3C）技术的一种改进方法，重点强调本科生的参与和学习过程。...

通过3C获得A：面向本科生的染色体构象捕获技术

本文介绍了一种逐步操作方案，演示如何将模块化克隆（MoClo）技术应用于多顺反子操纵子的克隆。...

使用 In-Cloning 工具包通过模块化克隆（MoClo）标准化组装多顺反子操纵子

我们介绍一种高通量克隆方法——基于CRISPR的穿梭克隆（CRISPRshuttle...

基于CRISPR的穿梭克隆：一种高通量克隆方法

学习使用Cpf1和C-Brick标准进行DNA组装的方案，该方法不依赖特定序列并支持迭代组装，适用于合成生物学中构建复杂遗传回路的研究。

使用Cpf1进行C-Brick DNA标准组装的实验方案

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