Name: 通过流式细胞术分离原代小鼠视网膜神经节细胞（RGC） (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-05T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 1 s
Description: 学习使用流式细胞术分离原代小鼠视网膜神经节细胞（RGC）的标准化方法。该技术可快速获得高纯度活细胞，为研究视网膜退行性疾病和视觉功能衰退机制提供重要实验资源。

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作者谨此感谢微生物学、免疫学与生物化学系高级插画师蒂姆·希金斯先生（Tim Higgins）在技术视频方面的协助；感谢马修·威尔逊博士（Matthew W. Wilson）的讨论，以及贾布隆斯基（Jablonski）和莫拉莱斯-蒂拉多（Morales-Tirado）实验室成员提供的有益意见。本研究得到了阿尔康研究基金会青年研究者奖（VMM-T）、田纳西大学研究基金会（VMM-T）、国立眼科研究所 EY021200（MMJ）、格尔温奖学金（VMM-T）、格尔温博士前奖学金（ZKG）、美国国防部陆军医学研究与物资司令部（VMM-T）以及防盲研究基金会（Research to Prevent Blindness）的无限制资助。

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作者声明不存在任何竞争性经济利益。

FACS 是纯化细胞群体的首选技术。其他分离方法包括免疫贴壁法、磁珠分选以及补体固定耗竭法。FACS 相较于这些方法的优势在于能够同时识别具有不同强度的细胞表面标志物。荧光分子的强度与蛋白表达量成正比。迄今为止，RGC 的分离仅依赖于 Thy1（CD90）阳性及 CD48 阴性15,16,22,34，无论采用何种分离方法。最近研究表明，Thy1+CD48neg 表型不足以分离出表达 RGC 胞内标志物的均一细胞群体23。准确识别 RGC 群体对其分离至关重要，尤其是因为它们仅占视网膜细胞的一小部分7,8,9。...

视网膜神经节细胞（RGCs）为终末分化的神经元，因此实验需使用原代细胞。建立一种用于分离与富集原代小鼠视网膜神经节细胞（RGCs）的实验方案，对于揭示RGCs健康与退变机制具有重要意义 体外这一点对于旨在开发潜在疗法以促进视网膜神经节细胞（RGC）功能并减少其死亡的研究尤为重要。RGC的退化与多种视网膜变性疾病相关，例如青光眼、糖尿病性视网膜病变以及正常衰老过程。尽管导致RGC丢失的具体细胞机制尚不明确，但已鉴定出一系列风险因素。视神经头部缺氧1,2,3 导致RGC死亡4 并作为单个视网膜神经节细胞内兴奋性和抑制性受体激活之间稳态平衡的干扰因素5,6一系列挑战阻碍了这些细胞在深入研究中的应用。首先，小鼠视网膜中视网膜神经节细胞（RGCs）的数量较少。RGCs约占视网膜总细胞数的不到1%7,8,9其次，大多数RGC特异性标记物是细胞内蛋白10,11,12基于这些标记物的筛选会导致细胞失去活力，从而无法进行后续的功能分析。最后，目前可用的方案耗时较长且缺乏标准化13,14早期的RGC分离方案基于免疫平皿法。Barres 等15 改良了经典的免疫平皿分离技术，并增加了一个步骤，即在基于抗胸腺细胞抗原（又称Thy1）免疫阳性进行阳性筛选之前，先从大量视网膜细胞中去除单核细胞和内皮细胞。数年后，Hong 等 结合磁珠分离技术与细胞分选策略，以更高纯度分离视网膜神经节细胞16磁性微珠的使用仍在许多科学研究中被广泛应用。磁性微珠与流式细胞术方案结合，可提高分离细胞的纯度。然而，目前尚未建立标准化的纯化系统，用于从解离的鼠视网膜中分离视网膜神经节细胞（RGCs）。
流式细胞术是一种强大的分析方法，可测量细胞悬液的光学和荧光特性。该技术以高灵敏度对细胞进行定性和定量分析，实现对细胞群体的多维度分析。细胞的区分主要基于两个关键物理特性：细胞大小或表面积，以及颗粒度或内部复杂性17。通过结合使用具有相似激发波长但不同发射波长的荧光染料标记抗体，可实现多维度分析。流式细胞术具有快速、可重复且灵敏度高的优点。多种类型的激光器使得流式细胞术能够对单个细胞进行更广泛的多维度分析。因此，该技术是细胞学样本研究中极具吸引力的方法。荧光激活细胞分选（FACS）则利用流式细胞术识别出的多维度表型差异，将单个细胞分选到不同的亚群中。
在过去的十年中，多种细胞表面和细胞内蛋白被鉴定为可用于细胞（包括神经元）筛选的潜在生物标志物。早期从大鼠中分离视网膜神经节细胞（RGCs）的研究采用Thy1作为神经节细胞的标志物。然而，Thy1 又称为 CD90在其他啮齿类物种中具有多种同工型18,19,20 并在多种视网膜细胞类型中表达19,20，使其成为RGCs的一种非特异性标记物。另一种表面标记物CD48存在于视网膜中的单核细胞群体，包括巨噬细胞和小胶质细胞。利用这两种表面标记物，可建立一种改良的RGC特征性标记—Thy1+ 和 CD48阴性 细胞——已开发15,16,21,22遗憾的是，仅靠这两个筛选标准不足以获得高度富集的视网膜神经节细胞（RGC）群体。为解决这一尚未满足的需求，开发了一种流式细胞术方案23 基于已知细胞表面标志物的多层正向与负向筛选标准，富集和纯化原代小鼠视网膜神经节细胞。

<table><tbody><tr><td>抗小鼠 CD15 PE</td><td>BioLegend</td><td>125606</td><td>克隆 MC-480</td></tr><tr><td>抗小鼠 CD48 PE-Cy7</td><td>BioLegend</td><td>103424</td><td>克隆 HM48-1</td></tr><tr><td>抗小鼠 CD57</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C6680-100TST</td><td>克隆 VC1.1</td></tr><tr><td>抗小鼠 CD90.2 AF700</td><td>BioLegend</td><td>105320</td><td>克隆 30-H12</td></tr><tr><td>Brilliant Violet 421 山羊抗小鼠 IgG</td><td>BioLegend</td><td>405317</td><td>克隆 Poly4053</td></tr><tr><td>纯化抗小鼠 CD16/32</td><td>BioLegend</td><td>101302</td><td>FcgRII/III 阻断剂，克隆 93</td></tr><tr><td>Zombie Aqua&amp;nbsp;</td><td>BioLegend</td><td>423102</td><td>活细胞/死细胞区分</td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Hyclone</td><td>SH30071.03</td><td>美国来源</td></tr><tr><td>AbC 总抗体补偿微珠试剂盒</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A10497</td><td>多物种 Ig</td></tr><tr><td>Neurobasal 培养基</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>21103049</td><td>培养前向培养基中添加血清</td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲盐水 (PBS)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10010049</td><td>生理盐水溶液</td></tr><tr><td>解剖显微镜</td><td>Olympus</td><td>SZ-PT 型号</td><td>体视显微镜</td></tr><tr><td>Sorvall 离心机</td><td>Thermo Scientific</td><td>ST 16R</td><td>所有离心操作均&amp;nbsp;在室温下进行</td></tr><tr><td>底板 &amp;ndash; 解剖盘</td><td>Fisher Scientific</td><td>SB15233FIM</td><td>也可使用石蜡板</td></tr><tr><td>镊子</td><td>Aesculap</td><td>5002-7</td><td>4 &amp;frac12; 英寸</td></tr><tr><td>直头虹膜剪</td><td>Aesculap</td><td>1360</td><td>5 &amp;frac12; 英寸</td></tr><tr><td>Falcon 15 mL 圆锥形离心管</td><td>Fisher Scientific</td><td>352097</td><td>聚丙烯管</td></tr><tr><td>Falcon 50 mL 圆锥形离心管</td><td>Fisher Scientific</td><td>352098</td><td>聚丙烯管</td></tr><tr><td>BD FACS 管</td><td>Fisher Scientific</td><td>352003</td><td>聚丙烯管</td></tr><tr><td>40 mm 培养皿</td><td>MidSci</td><td>TP93040</td><td>经组织培养处理</td></tr><tr><td>70 &amp;mu;m 尼龙滤网</td><td>MidSci</td><td>70ICS</td><td>无菌</td></tr><tr><td>40 &amp;mu;m 尼龙滤网</td><td>MidSci</td><td>40ICS</td><td>无菌</td></tr><tr><td>&amp;nbsp;BD 10 mL 注射器</td><td>Fisher Scientific</td><td>301604</td><td>无针一次性注射器</td></tr><tr><td>研磨杵</td><td>MidSci</td><td>PEST</td><td>无菌</td></tr><tr><td>Wheaton 小瓶</td><td>Fisher Scientific</td><td>986734</td><td>无衬垫</td></tr><tr><td>BD 30 G 针头</td><td>Fisher Scientific</td><td>305128</td><td>1 英寸</td></tr><tr><td>Hausser Scientific Bright-Line 玻璃计数板</td><td>Fisher Scientific</td><td>0267151B</td><td>血细胞计数板</td></tr><tr><td>Gibco 台盼蓝 0.4% 溶液</td><td>Fisher Scientific</td><td>15250061</td><td>细胞活力染料</td></tr><tr><td>Eppendorf 管</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-402-25</td><td>1.5 mL</td></tr><tr><td>EVOS Floid 细胞成像系统</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>447113</td><td>使用 20X 物镜进行荧光成像</td></tr><tr><td>100% 乙醇</td><td>Fisher Scientific</td><td>04-355-452</td><td>用于配制 70% 乙醇</td></tr><tr><td>Pipet-Lite LTS 移液器 L-1000XLS+</td><td>Rainin</td><td>17014282</td><td>LTS 移液器</td></tr><tr><td>Pipet-Lite LTS 移液器 L-200XLS+</td><td>Rainin</td><td>17014391</td><td>LTS 移液器</td></tr><tr><td>Pipet-Lite LTS 移液器 L-20XLS+</td><td>Rainin</td><td>17014392</td><td>LTS 移液器</td></tr><tr><td>Rack LTS 1000 mL &amp;ndash; GPS-L1000S</td><td>Rainin</td><td>17005088</td><td>蓝色架，无菌吸头</td></tr><tr><td>Rack LTS 250 mL &amp;ndash; GPS-L250S</td><td>Rainin</td><td>17005092</td><td>绿色架，无菌吸头</td></tr><tr><td>Rack LTS 20 mL &amp;ndash; GPS-L10S</td><td>Rainin</td><td>17005090</td><td>红色架，无菌吸头</td></tr><tr><td>FACSAria II 细胞分选仪</td><td>BD Biosciences</td><td>N/A</td><td>定制订单</td></tr><tr><td>LSR II 流式细胞仪</td><td>BD Biosciences</td><td>N/A</td><td>定制订单</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Abca8a&lt;/em&gt;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Mm00462440_m1</td><td>M&amp;uuml;ller 细胞</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Aldh1al&lt;/em&gt;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Mm00657317_m1</td><td>M&amp;uuml;ller 细胞</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Aqp4&lt;/em&gt;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Mm00802131_m1</td><td>星形胶质细胞</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Calb2&lt;/em&gt;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Mm00801461_m1</td><td>无长突细胞、水平细胞</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Cd68&lt;/em&gt;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Mm03047340_m1</td><td>视网膜色素上皮细胞</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Gad2&lt;/em&gt;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Mm00484623_m1</td><td>无长突细胞</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Hprt&lt;/em&gt;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Mm01545399_m1</td><td>管家基因</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Lhx1&lt;/em&gt;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Mm01297482_m1</td><td>水平细胞</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Lim2&lt;/em&gt;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Mm00624623_m1</td><td>水平细胞</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Nrl&lt;/em&gt;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Mm00476550_m1</td><td>光感受器细胞</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Ntrk1&lt;/em&gt;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Mm01219406_m1</td><td>水平细胞</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Pcp4&lt;/em&gt;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Mm00500973_m1</td><td>双极细胞、无长突细胞</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Pou4f1&lt;/em&gt;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Mm02343791_m1</td><td>视网膜神经节细胞</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Prdx6&lt;/em&gt;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Mm00725435_s1</td><td>星形胶质细胞</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Prkca&lt;/em&gt;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Mm00440858_m1</td><td>双极细胞</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Prox1&lt;/em&gt;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Mm00435969_m1</td><td>水平细胞</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Pvalb&lt;/em&gt;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Mm00443100_m1</td><td>无长突细胞</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Rbpms&lt;/em&gt;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Mm02343791_m1</td><td>视网膜神经节细胞</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Rom1&lt;/em&gt;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Mm00436364_g1</td><td>光感受器细胞</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Rpe65&lt;/em&gt;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Mm00504133_m1</td><td>视网膜色素上皮细胞</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Slc1a3&lt;/em&gt;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Mm00600697_m1</td><td>星形胶质细胞</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Slc6a9&lt;/em&gt;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Mm00433662_m1</td><td>无长突细胞</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Sncg&lt;/em&gt;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Mm00488345_m1</td><td>视网膜神经节细胞</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Tubb3&lt;/em&gt;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Mm00727586_s1</td><td>视网膜神经节细胞</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Vim&lt;/em&gt;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Mm01333430_m1</td><td>M&amp;uuml;ller 细胞</td></tr><tr><td>Taqman 通用预混液</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4440047</td><td>qPCR 试剂</td></tr><tr><td>miRNeasy Mini 试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>217004</td><td>RNA 提取</td></tr><tr><td>SuperScript VILO cDNA 合成试剂盒</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11754250</td><td>cDNA 合成</td></tr><tr><td>Taqman 预扩增预混液</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4391128</td><td>预扩增步骤</td></tr><tr><td>BD Cytofix/Cytoperm</td><td>BD Biosciences</td><td>554714</td><td>固定/通透缓冲液</td></tr><tr><td>BD Perm/Wash</td><td>BD Biosciences</td><td>554723</td><td>通透溶液</td></tr><tr><td>RBPMS</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-86815</td><td>细胞内抗体</td></tr><tr><td>SNCG</td><td>Gene Tex</td><td>GTX110483</td><td>细胞内抗体</td></tr><tr><td>BRN3A</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-8429</td><td>细胞内抗体</td></tr><tr><td>TUJ1</td><td>BioLegend</td><td>801202</td><td>细胞内抗体</td></tr></tbody></table>

通过流式细胞术分离原代小鼠视网膜神经节细胞（rgcs）

Isolation of Primary Murine Retinal Ganglion Cells (RGCs) by Flow Cytometry

神经退行性疾病通常对患者造成毁灭性影响。视网膜神经节细胞（RGC）的丢失与多种疾病相关，包括糖尿病性视网膜病变和青光眼，也见于正常衰老过程。尽管RGC具有重要功能，但由于其仅占视网膜中多种细胞的一小部分，因此一直极难开展研究。此外，目前的分离方法依赖细胞内标志物来鉴定RGC，导致所获得的细胞无法存活。这些技术还涉及耗时较长的分离流程，因此缺乏实用、标准化且可靠的RGC获取与分离方法。本研究描述了一种高效、全面且可靠的方法，通过基于阳性与阴性筛选标准的方案，从小鼠视网膜中分离原代RGC。该方法为未来RGC的研究提供了可能，旨在更深入理解神经退行性疾病中功能性RGC丢失所导致的视力显著下降。

RGCs 的深入研究受到多种因素的阻碍，包括其数量稀少以及缺乏高效且标准化的分离方法。 图1 展示了用于视网膜分离的方法学。根据分析类型的差异，去眼球操作步骤可能存在变异，例如当去眼球是作为 体内 实验27本方案中的去核操作在已实施安乐死的小鼠上进行。如图所示 图1A-B用镊子置于眼球下方并轻轻上提，以引起最少出血，并完整摘除带有视神经的眼球。
不同小鼠品系之间的视网膜神经节细胞（RGC）数量存在差异，尤其是在基因改造小鼠中尤为明显23,28,29<s...

数百万人患有导致不可逆失明的视网膜退行性疾病。这些疾病的一个共同特征是视网膜神经节细胞（RGCs）的丧失。本详细实验方案描述了通过流式细胞术结合阳性与阴性筛选方法分离原代小鼠RGCs的技术。

通过流式细胞术分离原代小鼠视网膜神经节细胞（RGCs）

神经退行性疾病通常对患者造成毁灭性影响。视网膜神经节细胞（RGC）的丢失与多种疾病相关，……

本实验的总体目标是分离出富集且均一的原代小鼠视网膜神经节细胞群体。该方法有助于回答视网膜神经节细胞研究领域中关于老龄人群及视网膜退行性疾病人群中视力下降机制的相关问题。该技术的主要优势在于，能够提供一种快速、直观、可重复且标准化的方案，用于富集原代小鼠视网膜神经节细胞的分离。我们最初产生这一方法的想法，源于当时我实验室的研究生、本研究的第一作者苏玛娜·钦塔拉普迪（Sumana Chintalapudi）在我们的期刊俱乐部上介绍了一篇克里希纳·穆尔萨多尔（Krishna Murtheadol）等人于2013年发表的论文。该研究明确表明，RGC五号细胞系——最初被建立为永生化的大鼠视网膜神经节细胞系——已不再具有大鼠来源，也不具备视网膜神经节细胞（RGC）的表型。我们意识到，这一问题给包括我们实验室在内的视觉研究领域造成了重要资源的缺失。于是，苏玛娜和我联系了莫拉莱斯-蒂拉多（Morales-Tirado）博士，三人共同开发了一种分离活体且高度富集的RGC的新方法。通常，初次接触该方法的研究人员会遇到困难，因为该方法的目标是分离出活的且高度富集的细胞群体，这些细胞可用于原代培养，或转化为永生化细胞系。因此，操作过程中必须格外小心，避免损伤待分离的细胞。此外，细胞分选方法的参数必须根据目标分离的特定细胞类型进行优化调整。两种方法均需要特殊的技术。本次操作将由来自Jablonski实验室的研究助理Xiang Di Wang博士和我实验室的博士候选人Zach Goldsmith先生进行示范。去核眼球时，首先将镊子插入眼球的下方。握住视神经并向上牵拉，眼球将完整摘出，视神经保持完整。将眼球置于含PBS的离心管中，冰上保存，并以相同方法摘除另一侧眼球。当所有眼球采集完毕后，将一只眼球置于盛有新鲜 PBS 的培养皿中，在解剖显微镜下用镊子小心夹住视神经根部的眼球壁。使用锋利的 30 号针头穿刺角膜，使房水流出，从而便于用镊子稳定夹持眼球。用镊子夹住角膜，用剪刀在角膜组织上剪开一个小切口，然后用镊子轻轻剥离角膜和巩膜。当眼球剥至一半时，用镊子将视网膜和晶状体卷出。将视网膜置于生物安全柜中一个含有PBS和1% FBS的小型40毫米培养皿中，每次用新鲜的PBS加FBS洗涤，共洗涤三次。所有眼球完成洗涤后，将最多12个视网膜置于已用PBS和FBS润湿的无菌70微米尼龙滤网上，用10毫升注射器活塞的末端以环形动作轻轻研磨视网膜。当所有细胞完全解离后，将滤网置于聚丙烯收集管上方，使用 P1000 移液器将细胞悬液通过滤网过滤至收集管中。用 PBS 和 FBS 冲洗滤网，将洗涤液一并收集至同一收集管中。加入足够的 PBS 和 FBS，使最终体积达到每只视网膜 1 毫升，随后通过离心收集细胞。然后，如果立即进行免疫标记，将沉淀重悬于PBS加FBS中，培养基用量为每五对视网膜使用1毫升。或者，将重悬于神经细胞培养基中的细胞在4°C、水平位置孵育过夜。为免疫标记视网膜细胞，离心视网膜细胞悬液，并将沉淀重悬于50 µL新鲜的PBS加FBS中，置于离心管中。留出五份各10的6次方个细胞作为未标记的阴性对照。接下来，在每管中加入1微升抗小鼠CD 16/32抗体（每1×10⁶个细胞），在室温下孵育10分钟，以阻断任何非特异性的Fc受体结合。阻断孵育结束后，轻轻吹打加入适量的目标抗体混合物，冰上避光孵育30分钟。随后用 PBS 和 FBS 将细胞洗涤两次，最终体积为 1 升。在避光冰浴中加入适当的二抗孵育 30 分钟，然后按照上述方法用含 FBS 的 PBS 洗涤两次。将细胞沉淀重悬于新鲜的 PBS 和 FBS 中，用于细胞计数。为调整补偿，向每支无菌离心管中加入三滴聚苯乙烯微球，每管对应一种florafor，并向每管加入一微克相应的florafor。将微球在室温下避光孵育15分钟。随后用三毫升PBS和FBS洗涤微球，并小心移除上清液。将微球沉淀重悬于250 µL PBS和FBS中，并将未标记的样本管上机至流式细胞仪。在流式细胞仪软件中，选择实验、补偿设置，并创建补偿对照。从显示的列表中添加Florafor特异性对照，然后点击确定。检查前向散射光和侧向散射光，圈定初始细胞群。然后将阴性对照管安装到流式细胞仪上，点击加载。确认目标细胞群（P1）已显示，并选择该细胞群。右键点击P1门，选择计算补偿。然后点击记录数据。当记录完成后，点击卸载以移除当前管，并装载下一个对照管以调节补偿对照。当所有对照样本均完成记录后，为第一个实验管创建前向散射 versus 侧向散射图，并圈选P1群体。接下来，打开侧向散射高度（SSC-H）对侧向散射宽度（SSC-W）的伪彩图，圈选单细胞群体。基于单细胞，创建前向散射高度（FSC-H）对前向散射宽度（FSC-W）的散点图，圈选以排除双联体细胞。随后生成CD48对CD90.2的伪彩图，圈选CD90.2阳性CD48阴性细胞以去除单核细胞，再生成CD57对CD15的伪彩图以排除可能存在的无长突细胞污染。现在在分选布局表中定义要采集的样本细胞群，并对细胞进行分选。分选结束后，取 2.5 × 10⁴ 个细胞的等分试样以确认分离细胞群的纯度。在将视网膜多次过细胞筛后，可观察到大量内层视网膜细胞，尽管由于细胞分离过程中轴突被切断，视网膜神经节细胞已失去其典型的形态特征。经典染料标记的CD48阴性表面表型不足以用于鉴定和分离小鼠视网膜神经节细胞，因为这些细胞表达与无长突细胞、穆勒细胞、双极细胞、水平细胞、光感受器细胞以及视网膜色素上皮细胞相关的基因。分选后的细胞还表达视网膜神经节细胞相关的胞内标志物，如γ-突触核蛋白、BRN3A、TUJ1和RBPMS，且通过成像流式细胞术进一步证实了这些标志物的胞内定位。部分分选后的细胞在体外培养后甚至开始呈现出视网膜神经节细胞的形态特征。此外，对高度富集的分选细胞群体进行定量PCR分析，结果显示编码视网膜神经节细胞特异性胞内标志物的基因表达水平显著升高。若操作熟练且流程正确，该技术可在六小时内完成。在实施该实验过程中，需注意保持细胞悬液的无菌状态，封闭细胞悬液中的Fc受体，避免抗体的非特异性结合，并与流式细胞分选仪操作人员充分沟通细胞分选的具体细节或策略。完成此操作后，可进一步采用其他方法（如定量PCR）来探究基因表达谱相关的更多问题。请注意，操作流式细胞分选仪等专业设备需要经过高度专业化培训的技术人员。该技术问世后，为视觉研究领域的科研人员提供了有力工具，有助于深入理解视网膜神经节细胞的存活与死亡机制，进而推动保护视力的新型治疗策略的开发。观看本视频后，您应能充分掌握如何分离获得富集且均一的原代小鼠视网膜神经节细胞群体。

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通过流式细胞术分离原代小鼠视网膜神经节细胞（RGC）

本文介绍了如何对小鼠离体视网膜进行解剖和记录。具体而言，我们描述了如何记录荧光标记的视网膜神经节细胞群体对光刺激的反应，并进一步识别和分析其形态学特征。...

一种用于记录遗传标记视网膜神经节细胞光反应的离体视网膜制备方法

本视频演示了使用流式细胞术分离小鼠原代视网膜神经节细胞（RGCs）的操作流程。该方法可为未来RGCs的研究提供支持，旨在更深入地理解神经退行性疾病中功能性RGCs丢失所导致的视力显著下降机制。...

使用荧光激活细胞分选法分离小鼠视网膜神经节细胞

来源： Laboissonniere, et. al．视网膜神经节细胞特定亚群的单细胞RNA测序．J. Vis. Exp. (2017)。...

通过荧光示踪鉴定小鼠视网膜神经节细胞亚型

小胶质细胞的吞噬作用对于维持组织稳态至关重要，而吞噬功能不足已被认为与多种病理过程相关。然而，评估小胶质细胞功能 体内...

评估视网膜小胶质细胞的吞噬功能 体内 使用基于流式细胞术的检测方法

本文介绍了一种在分离神经元细胞前对其进行分类，并对单细胞转录组进行后续表征的组合方法。该方案优化了样本制备流程，以确保RNA测序（RNA-Seq）的成功，并描述了一种专门用于深入理解细胞多样性的方法学。...

视网膜神经节细胞特定亚群的单细胞RNA测序

本方案介绍了两种用于分离小鼠视杆光感受器亚细胞区室以进行蛋白质分析的技术。第一种方法利用活体视网膜和纤维素滤纸分离视杆外节，而第二种方法则采用冻干视网膜和粘性胶带剥离视杆内节与外节层。...

小鼠视网膜感光细胞区室分离的两种剥离方法及其蛋白质分析

本方案描述了一种用于分离小鼠出生后视网膜内皮细胞的方法，该方法在细胞得率、纯度和活力方面均经过优化。这些细胞适用于下一代测序技术。...

从小鼠视网膜中分离内皮细胞用于下一代测序

本文描述了一种从小鼠眼球中分离视网膜胶质穆勒细胞的详细实验方案。该方案从小鼠眼球的摘除和解剖开始，随后进行穆勒细胞的分离、接种和培养。...

原代小鼠视网膜胶质穆勒细胞的分离

视网膜色素上皮（RPE）在脉络膜和视网膜之间起着至关重要的屏障作用，有助于维持视网膜细胞类型（如光感受器细胞）的健康与功能。本文中，我们描述了一种简单且有效的成年小鼠RPE分离与培养方案。...

一种简化的小鼠成年视网膜色素上皮细胞分离与培养方法

本方案描述了分离小鼠全 mount 视网膜并进行免疫染色以标记所有视网膜神经节细胞（RGCs）的操作步骤。随后通过成像并利用基于人工智能的软件自动计数 RGCs，为定量分析整个小鼠视网膜中的 RGCs...

小鼠视网膜神经节细胞的全层免疫染色与自动计数

本文介绍了一种从新生Sprague-Dawley（SD）大鼠中分离原代视网膜穆勒细胞的详细方案。该操作流程包括眼球摘除、视网膜组织解剖、细胞提取与鉴定，以及后续细胞培养的关键注意事项。...

从Sprague-Dawley（SD）大鼠中分离与原代培养视网膜Müller细胞

学习使用流式细胞术分离原代小鼠视网膜神经节细胞（RGC）的标准化方法。该技术可快速获得高纯度活细胞，为研究视网膜退行性疾病和视觉功能衰退机制提供重要实验资源。

通过流式细胞术分离原代小鼠视网膜神经节细胞（RGCs）

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