使用Sholl分析法对大鼠乳腺全组织切片中的分支密度进行定量

该计算机辅助方法的总体目标是通过对乳腺全组织制片图像应用改良的Sholl分析，客观量化啮齿类动物乳腺的分支密度和分支衰减程度，这两项均为重要的发育指标。该方法有助于回答乳腺生物学领域中的相关问题，例如化学物质暴露如何影响乳腺发育。该技术的主要优势在于利用开源软件对乳腺发育的基本特征进行客观定量分析。

进行此操作时，需准备在固定放大倍数下显示腺上皮的整装样品图像。首先，在 ImageJ 中打开一幅图像，然后选择自由手绘工具。

沿腺体上皮进行勾画，并清除周围区域。然后沿淋巴结进行勾画，并使用剪切命令移除该部分图像。如果图像背景为黑色，则必须将其转换为白色。

单击“编辑”，然后选择“选项”，再选择“颜色”。在对话框中，从背景选项的下拉菜单中选择白色。尽管背景可能仍显示为黑色，但在图像处理时将被视为白色。

现在，将颜色通道分离为三个8位灰度图像。然后，选择对比度最佳的通道，通常是蓝色通道。接着，从选定的颜色通道中减去背景。

然后，选择所需的参数并预览更改。在对话框中勾选“浅色背景”并预览，然后调整像素数值直至获得理想的对比度。如果需要进一步增强对比度，可使用“USM锐化”选项。

在对话框中查看预览，调整像素半径和蒙版权重，直至获得所需的对比度。应用反锐化掩膜滤镜后，移除滤镜生成的边框。单击工具栏中的双红色箭头按钮，然后选择绘图工具。

然后，选择橡皮擦工具。通过右键点击橡皮擦工具按钮来调整其直径，然后按住鼠标左键擦除边框。擦除过程中仅允许一步撤销操作，因此请谨慎操作。

应用滤镜后，手动去除剩余的噪声。参考原始图像的副本，首先单击工具栏中的双红箭头按钮并选择绘图工具，然后选择橡皮擦工具，擦除已识别的噪声。

通过右键单击橡皮擦工具按钮来调整其直径。然后按住鼠标左键以擦除噪声。擦除时仅允许一步撤销操作，因此请谨慎操作。

接下来，调整图像阈值。移动滑块以调节最小和最大阈值，优化腺体图像，然后点击应用。

使用以下两种方法之一自动去除额外的噪声。第一种方法是使用去斑点命令。第二种方法是使用去除异常值命令。

此过程仅在像素与其邻近区域的中位数偏差超过用户定义的阈值时，才将该像素替换为其邻近区域的中位数。现在，利用原始图像作为对照，重建因阈值分割和去噪处理而被移除的腺上皮部分。在重建图像时，务必谨慎操作，并尽可能最小程度地进行，以保持图像的完整性。

从绘图工具中选择喷枪工具。右键点击喷枪工具按钮以调整工具大小，然后使用鼠标左键仔细填充腺体缺失的部分。接下来，为腺体制作骨架化图像以进行Sholl分析。

首先，将图像转换为二值格式。然后对图像进行骨架化处理。该过程会反复从二值图像的边缘去除像素，直至图像被缩减为仅一个像素宽的形状。

现在，对图像进行一次膨胀操作，以闭合由阈值分割和骨架化产生的间隙。然后，使用“另存为”命令将图像保存为新文件。最后，通过将骨架图像与原始图像叠加，检查骨架图像的准确性。

在添加图像对话框中，选择骨架图像并将透明度设置为 30%。然后，将叠加结果另存为新图像以供日后参考。首先，打开一幅骨架图像，并将图像转换为二值格式。接着，定义图像比例尺。

输入每毫米的像素数，然后将已知距离和像素纵横比均设置为1，再将长度单位设为毫米，并启用全局选项以将该比例尺应用于所有图像。接下来，使用直线绘制工具确定Sholl分析的终止半径。从主导管的起始处画一条线至腺上皮最远端的点。

然后按下 M 键，线条的距离将被报告。现在输入 Sholl 分析的设置参数。首先，在壳层定义部分选择选项，将起始半径设置为 0.00 毫米，半径步长设置为 0.1 毫米。

将样本数量设置为1。刚刚绘制的线段长度将自动填入终止半径字段。对于每个半径的多个样本选项，选择“均值”进行积分。

对于描述符和曲线拟合选项，将包围半径截断值设置为1。在主分支数量选项中选择“从起始半径推断”，并选择线性及最佳拟合度选项。然后，在未归一化的轮廓中选择“信息量最大”的选项。

现在，在Sholl分析方法部分，选择用于归一化曲线的面积。最后，在输出部分，选择创建交点掩膜以生成交点的热图。接着，打开带有同心圆环的图像预览窗口，并确认分析区域。

如果一切正常，请单击“确定”以运行分析。运行分析将生成一个Sholl分析线性窗口、一个Sholl分析半对数窗口、一个包含所有Sholl分析输出值的Sholl结果窗口，以及一个名为“Sholl分析曲线”的窗口，该窗口提供由多项式确定的每个半径处的交点数量。为测量MEA，请在ImageJ中使用腺体的骨架化图像进行操作。

打开多边形工具，在腺体的周边绘制一个多边形。通过鼠标单击添加线段。当整个上皮区域被包围后，双击以闭合多边形。

然后，按下 M 键以打开结果窗口。面积列中的数值对应于 MEA。如果腺上皮延伸至淋巴结之外，在计算分支密度时，需从 MEA 中减去淋巴结的面积。

淋巴结区域的测量方法与MEA相同。采用所述方法，对两组年龄相匹配的大鼠进行了分析。B组动物经某种已知可引起乳腺组织早熟发育的化学物质处理。

沿腺体半径方向绘制分支交点数量可以说明结果的差异。Sholl 分析结果显示，各组之间的平均交点数存在明显差异。然而，必须将交点数据归一化到乳腺组织面积，才能得出结论。

Sholl 分析和乳腺上皮区域面积测量提供了两个可用于进行比较分析的生理参数。显然，处理组中腺体的尺寸要大得多。Sholl 分析返回 Sum N 的数值，该数值用于计算分支密度以及参数 k 的值。

在治疗组中，较高的平均分支密度以及较低的平均值 k（反映分支衰减速率较低）表明，经处理的动物其腺体发育较未处理的动物更为完善。在进行该操作时，需注意去除噪声是最为关键的步骤。去除过多或过少均可能破坏腺体结构的完整性，并导致结果出现偏差。

使用该方法时，必须从一个完整的乳腺全组织块开始。如果组织存在破损或折叠等缺陷，则无法获得准确的骨架化图像。获得准确的骨架化图像需要耐心和练习。

一旦掌握，若操作得当，每分析一个腺体可在15至20分钟内完成。