Name: 分子生物学实验室中大分子结晶的自动化协议 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 20 s
Description: 了解大分子结晶自动化协议，用于结构生物学研究中的蛋白质、DNA和RNA复合物晶体筛选。该方法利用纳升级液滴分配系统实现高通量气相扩散实验，显著提高晶体质量与实验效率。

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MRC-LMB 结晶设施由英国医学研究理事会（Medical Research Council, UK）慷慨支持。我们感谢 LMB 各位成员的支持：Olga Perisic（PNAC）、Tony Warne、Fusinita Van den Ent 和 Pat Edwards（结构研究部）、Steve Scotcher 以及机械车间的其他成员、Neil Grant 和 Jo Westmoreland（视觉辅助部）、Paul Hart 和 Tom Pratt（信息技术部）。我们还要感谢 Steve Elliot（Tecan, UK）、Mitchell Stuart 和 Heather Ringrose（Hamilton Robotics, UK）、Paul Thaw、Robert Lewis 和 Joby Jenkins（TTP Labtech, UK）、Paul Reardon（Swissci AG, 瑞士）、George Stephens 和 Donald Ogg（Alphabiotech, UK）、Neil Williams（Markem Imaje, UK）以及 Graham Harris（The Cleveland Agency）提供的技术支持。

1. 两种全自动系统（初步筛选）
<ol>
	<li>系统1：制备72块装有筛选试剂盒（LMB板）的96孔结晶板
	<ol>
		<li>在执行操作前，确保系统的机器人已完成初始化，并且其控制软件已打开。在主程序启动前约30分钟，打开管路冷却载体的制冷机。</li>
		<li>将测试板放置在板封膜仪的电动SBS载板架上。运行板封膜仪，并检查封膜是否正确贴合。重复此测试两次，以确认板封膜仪已准备就绪。</li>
		<li>然后，向液体处理仪的主容器中加入 20 L 去离子水。断开小容器（20% 乙醇冲洗液）的耦合接头，并将接头连接至主容器。</li>
		<li>输入适当的屏幕名称（表1在喷墨打印机的触摸屏上点击 ）。然后打开并关闭幻灯片架舱门以触发幻灯片架旋转。当第一叠幻灯片出现时，打开舱门。</li>
		<li>将第一个堆栈装满22块结晶板，每块板均以第1列朝外。以相同方式装满接下来的两个堆栈。</li>
		<li>将剩余的6块板加载到第四层堆叠的最高位置，然后关闭转盘门。</li>
		<li>确认冷却器显示屏显示为 14 °C。轻轻反复倒置所选的筛选试剂盒 1 分钟。然后，打开液体处理仪的前面板。</li>
		<li>打开管子，按照标准的96孔板布局（A1、A2）将其放入冷却载体中 等等将每支试管放入载体后，将其管盖按相同的96孔布局放置在托盘上。</li>
		<li>核对试管位置，确保所有试管在载体中水平且放置稳固。然后，关闭前面板。</li>
		<li>在液体处理仪软件的“启动”窗口中，选择“运行维护”并打开冲洗程序。运行该程序，以冲洗系统中的20%乙醇，并清洗液体分配吸头的外部。</li>
		<li>冲洗完成后，单击“Cancel”返回“Startup”界面。选择“Run an existing process”，然后单击“Start your selection”。打开“MRC kit dispensing”程序。在配置界面中将“Instances”设置为“18”，然后运行程序。</li>
		<li>在前四块板进行标记、加样和密封时，监控系统运行。</li>
		<li>当所有72块板均制备完毕并放回转盘后，将耦合接头从主容器切换至小容器，运行“启动冲洗”程序（见步骤1.1.10）。</li>
		<li>关闭制冷机并丢弃空的筛选试剂盒管。小心地从转盘上取下72块已准备好的微孔板。丢弃填充错误或密封不良的微孔板。将可使用的微孔板在10 °C下储存。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>系统2：从单个样品在20块LMB板中设置结晶液滴（100 nL蛋白质 + 100 nL条件溶液）
	<ol>
		<li>首先，确保系统机器人已开启，纳升级分液器已初始化并打开其软件，同时液体处理仪的方法管理器也已打开。在主程序启动前约15分钟，打开微管冷却载体。</li>
		<li>将测试板放置在板封膜机的电动SBS载板架上。运行板封膜机，并确认板已正确密封。重复测试板封膜机三次。</li>
		<li>然后，运行纳升级分液器，在检测板上设置100 nL的测试溶液液滴。在显微镜下检查液滴是否正确放置。关闭纳升级分液器软件，并从仪器平台取出条带架模块。</li>
		<li>接下来，将定制设计的板架插入（参见 代表性结果：在LMB开发的结晶装置）含有挥发性试剂相对含量最高的LMB板表1）。从培养板上移除粘性膜。</li>
		<li>打开液体处理仪的前面板，将未密封的板放置在平台上的第一个滑动载具后部（为方便操作，可将滑动载具拉出）。</li>
		<li>用SBS铝盖盖住板。通过轻轻按压盖子的对角，将盖子向载体的后左角方向固定。</li>
		<li>打开密封，将滑动载体装入，以从最易挥发到最不易挥发的条件顺序，以相同方式覆盖剩余的19块板。当微型管冷却载体温度达到4 °C（由绿灯指示）时，取下其盖子。</li>
		<li>剪下含有至少 440 µL 蛋白质样品的微量离心管管盖表2）。确保样品液面无泡沫，以免干扰液体检测系统。将试管放入微型管冷却载体的1号位置。</li>
		<li>将PCR板放置在液体处理仪工作台前方的板移动适配器载具前，然后关闭前面板。</li>
		<li>加载托盘后，确保纳升级分液仪托盘远离条带固定块，且50 µL吸头堆栈后部的支架远离铝制SBS盖。</li>
		<li>在液体处理仪的“方法管理”界面中，选择“设置板”。监控两个系统的初始化过程，并填写运行参数。遵循方法管理界面中的指南（提示、图示以及吸头管理系统将协助准备工作）。</li>
		<li>仔细检查所有必需组件是否已准备就绪，然后启动流程。</li>
		<li>在纳升级分液器将液滴加入第一块板后，随即由板封仪对板进行封板，需全程监控该系统。</li>
		<li>当所有20块板均制备好结晶液滴并自动返回滑动载体后，打开前面板，轻轻取出板。在将板存放用于结晶之前，检查其密封是否正确。</li>
		<li>使用20%乙醇溶液清洁SBS盖子，然后将其堆叠在液体处理仪左侧以供储存。丢弃PCR板和微量离心管。</li>
		<li>关闭微型离心管冷却装置，并擦去冷凝水。在冷却表面放置一张纸巾，以吸收后续产生的冷凝水。然后盖上载体盖板并关闭前面板。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 条件优化
<ol>
	<li>基于注射器的液体处理装置：通过四角法在结晶板的储液池中生成两种浓度的线性梯度。
	<ol>
		<li>首先，确保液体处理仪已开机，并启动其配套软件完成初始化。</li>
		<li>在“梯度”选项卡中：打开所需程序，选择结晶板类型以及储液池中的终体积（表3). 当使用含有异丙醇的溶液时，应将“最大射流体积”高级设置从 6,000 降低至 3,000 &#62; 10% v/v 和 [MPD] &#62; 20% v/v</li>
		<li>准备注射器。将活塞插入每个注射器内（尖端朝下），并将注射器尾部插入机器人头部下方的指定凹槽中。顺时针旋转注射器以将其固定到位（程序仅在所有必需的注射器正确安装后才会启动）。</li>
		<li>准备槽体。取下不锈钢框架，插入槽体。左侧的4个位置对应4个角A、B、C、D。切换到“SET UP”选项卡，该选项卡显示每个注射器中所需的溶液体积（在 表3，需在显示体积基础上增加0.5 mL死体积）。将各角的溶液倒入相应的槽中，并将支架放回工作台面上（支架通过台面前端的两个小磁铁固定位置）。 执行此步骤的另一种方法是，当槽体已放置在平台上时，将溶液倒入槽中。</li>
		<li>将结晶板放置在电动SBS载板架上。</li>
		<li>点击“ASPIRATE”，并等待此步骤完成（当活塞在上升过程中停止时）。</li>
		<li>切换到“RUN”选项卡并运行程序。</li>
		<li>程序结束后，返回“设置”选项卡并点击“移除”：系统将清除注射器中残留的溶液，然后将活塞完全上提。 可请求执行“PURGE”而非“REMOVE”；此操作将使活塞保持在底部位置，以便使用同一注射器吸取更多溶液。</li>
		<li>通过逆时针旋转移除注射器。</li>
		<li>将注射器和槽体丢弃至适当的垃圾桶中（或用去离子水冲洗，再用20% v/v乙醇溶液冲洗后重复使用）。</li>
		<li>密封培养板并置于微孔板振荡器中，以1,000 rpm振荡3分钟；若混合高黏度溶液，则振荡10分钟。培养板随后可用于纳米升移液器设置结晶液滴。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>添加剂筛选方案1（在预装有添加剂筛选试剂的96孔结晶板中设置结晶液滴）
	<ol>
		<li>首先，配制试剂初始浓度提高10%的条件（使用液体处理仪将反应体系从容器转移至添加剂筛选板时，最小体积为15 mL）。</li>
		<li>确保液体处理仪处于可运行状态。打开“向单孔板中添加添加剂”程序（在储液槽中输入体积：“72 µL”）。 提示信息、图示和移液枪头管理系统（需12盒1,000 µL枪头）有助于确保机器人根据所选设置准备就绪并正常运行。</li>
		<li>从-20 °C冰箱中取出添加剂筛选板，立即用板架移除其铝制封膜，然后将板放置在液体处理仪的工作台上。 程序按照纵向布局运行（将板放置在载体上前左角为A1角）。 同时将装有培养条件的容器放入。运行程序。</li>
		<li>在微孔板的储液槽加样完成后，将其放入微孔板摇床并运行程序。用去离子水和20%乙醇冲洗条件溶液容器，以备重复使用。</li>
		<li>在纳升级分液器上设置液滴首先，打开结晶板的密封（使用板架）。然后，将结晶板和8孔蛋白条带放置在条带架模块的第一个位置。 控制软件中的“设置”选项卡显示甲板上各组件的实际位置. 根据所需的液滴大小，向条带的每个孔中加入蛋白样品（表 4). 运行程序以制备液滴。</li>
		<li>程序结束后，立即从仪器平台取下反应板并密封（使用板封仪或3英寸宽的压敏胶带）。将封条丢弃至指定垃圾桶中。</li>
		<li>在储存前，通过显微镜评估液滴的大小、形状和居中情况。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>添加剂筛选方案2（使用可重复利用的添加剂筛选试剂盒在96孔结晶板中设置结晶液滴）
	<ol>
		<li>首先，准备添加物筛选板：将相应的冷冻96孔细胞培养板在室温下放置40分钟以解冻。然后，在1,000 x g条件下离心2分钟。</li>
		<li>准备条件培养基（使用液体处理仪将培养基从容器转移至添加剂筛选板时，最小体积为15 mL）。</li>
		<li>用条件溶液填充96孔结晶板的储液槽。在液体处理仪上操作步骤与方案1的2.2.2步骤相同，但在设置储液槽体积时输入“80 µL”。</li>
		<li>在纳升级分配仪上设置液滴，将甲板上的三个组分进行布置（包含添加剂筛选板、结晶板，以及位于条带固定块第一位置的8孔蛋白条带） 表4).</li>
		<li>用铝箔密封含有筛选样本的细胞培养板，并将其放回 -20 °C 培养箱中。</li>
		<li>在储存前，通过显微镜评估液滴的大小、形状及居中情况。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

我们在此声明存在利益冲突，因为 LifeArc 公司对以下产品进行商业化：96 孔和 48 孔 MRC 板、MRC 悬滴密封垫、MORPHEUS、Pi、ANGSTROM 和 LMB 结晶筛选试剂盒。

1- 准备和使用保存在培养板中的初始筛选样本
在将筛选试剂盒中的溶液分装到板孔之前，应先进行混匀，因为在储存过程中，部分管内的溶液可能出现轻微沉淀或相分离现象。当一个筛选实验包含两个试剂盒（2 × 48 管）时，第二个试剂盒的第一管应放置于冷却载体的 E1 位置。当筛选实验包含四个试剂盒（4 × 24 管）时，第二个试剂盒的第一管置于 C1 位置，第三个试剂盒的第一管置于 E1 位置，第四个试剂盒的第一管置于 G1 位置。在将各管插入冷却载体的同时，管盖应按照标准的 96 孔板横向布局放置于托盘上。由于制造商通常在管盖顶部标注了孔位编号，此操作可便于核对所有管子是否按正确顺序放置。此外，在仅需填充较少数量的板时，该方法也有助于将正确的管盖重新盖回对应的管子上。
我们将预装好的板存放在10 °C，这一温度是为避免冻结以及4 °C储存可能导致的条件恶化和密封问题而采取的折中方案。这些板可储存数月，通常在密封膜内表面不会出现明显冷凝。但对于LMB05、LMB06、LMB09和LMB10板而言，此情况较不理想，因为这些板中含有挥发性试剂浓度相对较高的条件（表1）。密封膜内侧出现少量冷凝会降低密封效率，并在打开板时导致孔间交叉污染。为帮助防止初始冷却过程中产生冷凝，可先将板从转盘转移到一个隔热的便携式冷藏箱中，并在4 °C冷藏室中过夜。这种极缓慢的冷却过程可最大程度减少密封孔内温度梯度的形成，从而整体上减少冷凝15。此外，当板存放在10 °C培养箱中后，会在每叠板的顶部加盖一个实验室自制的SBS聚苯乙烯盖（未示出）。
我们所有预装板均可用于对一种新的水溶性蛋白质样品进行大规模初筛。或者，也可选择较少的板以满足特定需求。例如，LMB15 和 LMB19 是专为膜蛋白样品设计的筛选板26,27，而 LMB20 则是一种含有重原子的筛选板，有助于衍射数据的实验相位测定28（另见：<a href="https://www.youtube.com/watch?v=Gpb4SypWnQY&amp;t=11s">MORPHEUS 蛋白质结晶筛选试剂的配制</a>）。
2. 设置结晶液滴
使用系统2时，应优先处理含有大量挥发性试剂的筛选试剂盒。这可以避免在SBS盖板的橡胶部分形成冷凝水，从而影响盖板操作和板的密封性。SBS盖板在放置于板顶部时存在一定的间隙，因此需要在初始阶段进行对齐（见方案，步骤1.2.6）。PCR板各孔中的蛋白质死体积相对充足（0.8 µL，参见表2图注）。需要注意的是，当单独使用纳升级分液器配合8联管条带中的蛋白质进行操作时，同样采用了同样充足的死体积（表4）。虽然更小的死体积可能也能使用，但某些样品可能会黏附在吸头表面，机器校准可能略微不准确，环境温度可能高于常规水平，等等。上述各种因素均可能导致样品损失，而充足的死体积可覆盖这些损失，以确保方法的稳健性。
最近的技术进展使得实验进一步微型化，因此通过整合相应技术，筛选结晶条件所需的样品体积可显著减少29,30。然而，进一步微型化的一些方面需要仔细考虑，例如液滴的蒸发31和微晶的操作32。
最后，在设置结晶液滴（位于球形上孔中）时，可将离心步骤（2,000 rpm，1 分钟）作为常规的最终操作纳入流程。通过离心获得的液滴在大小和形状上更为均一，有助于减少重复性问题33,34。此外，居中的液滴将便于后续使用显微镜对实验结果进行评估，因为整个板上的各液滴所需焦距将趋于一致。
4 角法的优势
四角法最主要的优点是其操作简便，能够最大限度地减少误差，并便于建立直接的自动化流程。例如，四个角溶液始终以相同的布局放置在液体处理设备的样品载台。此外，所有程序均基于各溶液之间的固定比例（图3C）。 
我们更倾向于手动配制四个角溶液，而不是对高浓度、可能具有高黏度的溶液进行自动化处理。这样可以在大多数类型的液体处理设备上实现相对快速且准确的吸液和分液操作，同时对液体类别的优化要求最低。然而，某些角溶液可能仍然过于黏稠，导致采用常规液体系统的机器人难以高效运行。因此，我们选择使用正置换式液体处理设备（图3B）。
除了两种浓度的线性梯度外，还包含第三种组分（即，可在恒定浓度下以便捷的方式测试一系列缓冲液/添加剂。具体方法为：首先制备相对较大体积的核心角溶液组，其浓度适当提高，但不包含待调整的组分；然后加入含有该组分的储备液，以调节至最终浓度。例如，先制备50 mL的4种角溶液，其浓度比初始目标浓度高10%。随后将该核心溶液组均分为5个较小的子组，每组包含4种溶液。最后，向每个子组中分别加入体积比为10%的不同缓冲液-pH溶液。
4. 加性筛选的格式与类型
这些筛选板通常保存在 -20 °C（图4），因为它们不经常使用，且含有挥发性或不稳定的化合物。使用储存在深孔板（每孔1 mL）中的冷冻添加剂筛选板时，必须提前规划，因为所有添加剂溶液在室温下完全解冻需要12–24小时。此外，多个用户共用同一块添加剂筛选板，可能导致交叉污染问题。最后，深孔板的高度使其不适用于大多数纳升级分液器。为方便解决上述问题，应将筛选板从深孔板转移至低剖面板（图4）。
传统上，包含多种单一试剂（以单一浓度）的添加剂筛选方法非常流行35,36。然而，也已发展出其他类型的添加剂筛选方法，例如整合多种添加剂混合物37，或使用较少种类的单一添加剂但在不同浓度下进行测试38。最后，另一种互补的方法是研究添加剂在结晶前对样品的影响39,40。
5. 其他注意事项
良好实践： 大多数屏幕含有有害甚至有毒物质，因此在操作过程中必须采取适当的个人防护措施。同样，机器人运动部件可能导致伤害，尤其是在程序运行期间试图手动干预时（尽管大多数机器人配有紧急停止按钮/系统）。由于涉及技术复杂性，定期使用已表征的测试样品对机器人、屏幕和程序进行检查，对于保持高水平的可重复性至关重要。
通量： 作为参考，系统1每年可生产4,000至8,000块LMB平板（随后由用户用于初步筛选）。当预期使用量远低于此水平时，该系统不适合在10 °C下储存大量预填充的平板，因为在4-5个月后，部分条件会开始恶化并发生蒸发。针对小型至中型实验室，已实施多种不同的自动化方案41。
实验的保存与评估： 制备液滴后，将板置于温度严格控制在4或18 °C（最大偏差±0.5 °C）且振动极小的房间内的低振动架上保存。实验通过冷光源显微镜进行评估。目前市面上有多种自动成像系统可供选择，但需仔细考虑以下各个方面：扫描整块板所需的速度是否足以满足高通量需求？除晶体外的其他物体是否会干扰自动对焦？所获得的图像质量是否足以识别非常微小的晶体（尤其是在液滴边缘区域）？42,43,44
结晶条件的比较：在仔细研究最初获得的晶体性质后，可以利用<a href="https://search.mrc-lmb.cam.ac.uk/screens2/search.html">LMB 筛选数据库</a>或 C6 <a href="http://c6.csiro.au/">网络工具</a>45分析不同条件之间的趋势与相似性。

X射线晶体学被广泛应用于深入理解生物和疾病机制的原子层面，并进一步辅助基于理性设计的药物发现1。为此，需对蛋白质、DNA、RNA、其他配体及其复合物等纯化且浓缩（2–50 mg/mL）的大分子样品进行试验，以评估其通过结晶形成有序三维晶格的倾向2,3,4。当获得可衍射X射线的高质量晶体时，即可解析出接近原子分辨率的晶体结构5,6。关键在于，新型样品的结晶条件无法预先预测，且高质量晶体的获得率通常极低。其根本原因之一在于，许多目标样品具有复杂的生化特性，导致其在相应的结晶时间尺度（通常为数天）内不稳定。此外，样品及其变体的制备耗时，以及纯化与结晶条件的优化过程进一步延长了整体周期7,8。
结晶条件是指含有能够降低样品溶解度的沉淀剂的溶液，这些条件通常还包含缓冲液和添加剂。数百种此类试剂都非常适合用于调节结晶实验的参数，因为它们极少会干扰样品的完整性（例如蛋白质或核酸的去折叠）。尽管测试数百万种结晶试剂组合并不可行，但通过微型化实验和自动化方案，可以对多种筛选试剂盒进行测试——这些试剂盒基于不同的设计策略9,10。从这一角度来看，最适用的技术可能是蒸汽扩散法，即将100–200 nL的液滴置于含有结晶条件溶液（25–250 µL）的储液槽上方的小孔中，该方法在专用的结晶板中实现11,12。在上层小孔中制备液滴时，通常将蛋白质样品与结晶条件溶液以1:1的比例混合，总体积为200 nL。机器人纳米级蛋白质结晶也可采用其他技术和板型实现，例如油下批量法13和脂质立方相法14（后者专门用于在水中溶解度极低的跨膜蛋白）。
<a href="http://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/groups/JYL/WWWrobots/robot.html">英国医学研究理事会分子生物学实验室（MRC-LMB）的结晶设施</a>始于21世纪初，我们自动化实验方案的早期总结于2005年发表15。当时介绍了蛋白质结晶技术的历史背景，并概述了机器人纳升级方法的优势（该方法在当时是常规实验中的一种新颖手段）。由于大分子结晶本质上是一个随机过程，几乎不存在可用的先验信息，因此采用多种多样的（合适的）初始条件可提高获得高质量衍射晶体的几率16。此外，大规模初筛的一个常被忽视的优点是，在许多情况下可显著减少后续对样品和晶体进行优化的需求。当然，在某些情况下仍需对部分初始条件进一步优化。通常，会系统地考察试剂浓度和pH值。也可在优化后的条件中引入更多试剂，以进一步调节结晶参数。当然，应尽量使用新鲜制备的样品进行结晶实验，因此相关实验方案必须简洁明了，并可随时使用。
本文全面描述了在MRC-LMB设计的两套全自动系统（系统1和系统2）及其相应的操作流程。这两套系统的主要应用是通过悬滴结晶板中的蒸气扩散法进行初步筛选。系统1集成了液体处理仪、用于储存板的自动转盘、用于板标记的喷墨打印机以及粘性板封膜机。在系统1上，72块96孔板被填充市售筛选试剂盒（从试管中起始体积为10 mL的溶液转移80 µL条件液至储液槽），并进行标记和封膜。随后，这些板被储存在10 °C培养箱中，供用户随时取用（作为称为“LMB板”的初步筛选板）。
系统2集成了液体处理仪、纳升级分液器和粘性板封膜机。在系统2上，通过将条件溶液与样品在20块预装有实验条件的48孔或96孔板的上部孔中混合，生成用于蒸汽扩散实验的悬滴（100–1,000 nL）。这意味着当在系统2上使用20块LMB板时，可同时进行1,920种初始筛选条件的试验。
机器人也被单独用于优化特定条件，相应的半自动化方案也有描述。通常采用四角法17进行优化筛选。该方案首先需要手动配制四种溶液（“A、B、C 和 D”）。随后，在结晶板的储液池中自动形成两种浓度的线性梯度（针对两种主要的结晶试剂）。为此，基于注射器的液体处理系统以不同比例分配四种角落溶液。
为进一步优化条件，可采用添加剂筛选方法，以增强所得晶体的性质18有两种方法可用于添加剂筛选：一种方法是在设置液滴前，先将添加剂加入结晶板的储液池中（方案1）。 以及另一种将添加剂筛选直接分配到液滴上的方案（方案2）。
本文还介绍了在MRC-LMB为促进大分子自动结晶而开发的其他实用技术。这些技术主要包括结晶板及相关装置，例如可堆叠的生物分子筛选学会（SBS）盖板，该盖板在使用系统2时可最大限度减少实验条件的蒸发。
为简洁起见，假设用户已熟悉纳升级分液器、喷墨打印机和粘性板封膜机的基本功能与维护。除非另有说明，机器人工作台上的板均放置在板架的后左角朝向位置，即A1孔（“A1角”）朝向板架的后左角。

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;机器人&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Freedom EVO&amp;reg;</td><td>Tecan</td><td>n/a</td><td>液体处理仪（系统1）。基于系统液体的吸液/分配功能，集成自动化转盘。EVOware plus 控制软件 v.2.4.12.0。&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Microlab&amp;reg; STAR&amp;trade;</td><td>Hamilton</td><td>n/a</td><td>液体处理仪（系统2）。基于正向置换原理（CO-RE&amp;trade; 技术）进行吸液/分配。Hamilton STAR 控制软件 v.4.3.5.4785，配备方法管理界面。</td></tr><tr><td>Mosquito&amp;reg;</td><td>TTP Labtech</td><td>n/a</td><td>基于微注射器的纳升级分液器，用于设置液滴（系统2及独立使用），3位板位。控制软件 v.3.11.0.1422。&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Dragonfly&amp;reg;</td><td>TTP Labtech</td><td>n/a</td><td>基于注射器的液体处理仪，用于生成优化筛选条件（四角法）。控制软件 v.1.2.1.10196。&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>粘性板封膜机</td><td>Brandel</td><td>n/a</td><td>集成于系统1和系统2（也可作为独立机器人使用）。</td></tr><tr><td>喷墨打印机 9232</td><td>Markem-Imaje</td><td>n/a</td><td>集成于系统1。配备触摸屏界面。</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;结晶筛选试剂盒&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Crystal Screen&amp;trade; 1</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-110</td><td>结晶试剂盒（试管，每种条件10 mL），用于LMB01</td></tr><tr><td>Crystal Screen 2&amp;trade;</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-112</td><td>结晶试剂盒（试管，每种条件10 mL），用于LMB01</td></tr><tr><td>Wizard&amp;trade; Classic 1</td><td>Rigaku</td><td>1009530</td><td>结晶试剂盒（试管，每种条件10 mL），用于LMB02</td></tr><tr><td>Wizard&amp;trade; Classic 2</td><td>Rigaku</td><td>1009531</td><td>结晶试剂盒（试管，每种条件10 mL），用于LMB02</td></tr><tr><td>Grid Screen&amp;trade; Ammonium Sulfate</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-211</td><td>结晶试剂盒（试管，每种条件10 mL），用于LMB03</td></tr><tr><td>Grid Screen&amp;trade; PEG/LiCl</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-217</td><td>结晶试剂盒（试管，每种条件10 mL），用于LMB03</td></tr><tr><td>Quick Screen&amp;trade;</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-221</td><td>结晶试剂盒（试管，每种条件10 mL），用于LMB03</td></tr><tr><td>Grid Screen&amp;trade; Sodium Chloride</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-219</td><td>结晶试剂盒（试管，每种条件10 mL），用于LMB03</td></tr><tr><td>Grid Screen&amp;trade; PEG 6000</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-213</td><td>结晶试剂盒（试管，每种条件10 mL），用于LMB04</td></tr><tr><td>Grid Screen&amp;trade; MPD</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-215</td><td>结晶试剂盒（试管，每种条件10 mL），用于LMB04</td></tr><tr><td>MemFac&amp;trade;</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-114</td><td>结晶试剂盒（试管，每种条件10 mL），用于LMB04</td></tr><tr><td>PEG/Ion&amp;trade;</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-126</td><td>结晶试剂盒（试管，每种条件10 mL），用于LMB05</td></tr><tr><td>Natrix&amp;trade;</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-116</td><td>结晶试剂盒（试管，每种条件10 mL），用于LMB05</td></tr><tr><td>Crystal Screen Lite&amp;trade;</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-128</td><td>结晶试剂盒（试管，每种条件10 mL），用于LMB06</td></tr><tr><td>定制 Lite 筛选试剂盒</td><td>Molecular Dimensions Ltd</td><td>n/a</td><td>结晶试剂盒（试管，每种条件10 mL），用于LMB06</td></tr><tr><td>Wizard&amp;trade; Cryo 1</td><td>Rigaku</td><td>1009536</td><td>结晶试剂盒（试管，每种条件10 mL），用于LMB07</td></tr><tr><td>Wizard&amp;trade; Cryo 2</td><td>Rigaku</td><td>1009537</td><td>结晶试剂盒（试管，每种条件10 mL），用于LMB07</td></tr><tr><td>JBS1</td><td>JenaBioScience</td><td>CS-101L</td><td>结晶试剂盒（试管，每种条件10 mL），用于LMB08</td></tr><tr><td>JBS2</td><td>JenaBioScience</td><td>CS-102L</td><td>结晶试剂盒（试管，每种条件10 mL），用于LMB08</td></tr><tr><td>JBS3</td><td>JenaBioScience</td><td>CS-103L</td><td>结晶试剂盒（试管，每种条件10 mL），用于LMB08</td></tr><tr><td>JBS4</td><td>JenaBioScience</td><td>CS-104L</td><td>结晶试剂盒（试管，每种条件10 mL），用于LMB08</td></tr><tr><td>JBS5</td><td>JenaBioScience</td><td>CS-105L</td><td>结晶试剂盒（试管，每种条件10 mL），用于LMB09</td></tr><tr><td>JBS6</td><td>JenaBioScience</td><td>CS-106L</td><td>结晶试剂盒（试管，每种条件10 mL），用于LMB09</td></tr><tr><td>JBS7</td><td>JenaBioScience</td><td>CS-107L</td><td>结晶试剂盒（试管，每种条件10 mL），用于LMB09</td></tr><tr><td>JBS8</td><td>JenaBioScience</td><td>CS-108L</td><td>结晶试剂盒（试管，每种条件10 mL），用于LMB09</td></tr><tr><td>JBS9</td><td>JenaBioScience</td><td>CS-109L</td><td>结晶试剂盒（试管，每种条件10 mL），用于LMB10</td></tr><tr><td>JBS10</td><td>JenaBioScience</td><td>CS-110L</td><td>结晶试剂盒（试管，每种条件10 mL），用于LMB10</td></tr><tr><td>Clear Strategy&amp;trade; Screen 1 pH 4.5</td><td>Molecular Dimensions Ltd</td><td>MD1-16LMB</td><td>结晶试剂盒（试管，每种条件10 mL），用于LMB10</td></tr><tr><td>Clear Strategy&amp;trade; Screen 1 pH 5.5</td><td>Molecular Dimensions Ltd</td><td>MD1-16LMB</td><td>结晶试剂盒（试管，每种条件10 mL），用于LMB10</td></tr><tr><td>Clear Strategy&amp;trade; Screen 1 pH 6.5</td><td>Molecular Dimensions Ltd</td><td>MD1-16LMB</td><td>结晶试剂盒（试管，每种条件10 mL），用于LMB11</td></tr><tr><td>Clear Strategy&amp;trade; Screen 1 pH 7.5</td><td>Molecular Dimensions Ltd</td><td>MD1-16LMB</td><td>结晶试剂盒（试管，每种条件10 mL），用于LMB11</td></tr><tr><td>Clear Strategy&amp;trade; Screen 1 pH 8.5</td><td>Molecular Dimensions Ltd</td><td>MD1-16LMB</td><td>结晶试剂盒（试管，每种条件10 mL），用于LMB11</td></tr><tr><td>Clear Strategy&amp;trade; Screen 2 pH 4.5</td><td>Molecular Dimensions Ltd</td><td>MD1-16LMB</td><td>结晶试剂盒（试管，每种条件10 mL），用于LMB11</td></tr><tr><td>Clear Strategy&amp;trade; Screen 2 pH 5.5</td><td>Molecular Dimensions Ltd</td><td>MD1-16LMB</td><td>结晶试剂盒（试管，每种条件10 mL），用于LMB12</td></tr><tr><td>Clear Strategy&amp;trade; Screen 2 pH 6.5</td><td>Molecular Dimensions Ltd</td><td>MD1-16LMB</td><td>结晶试剂盒（试管，每种条件10 mL），用于LMB12</td></tr><tr><td>Clear Strategy&amp;trade; Screen 2 pH 7.5</td><td>Molecular Dimensions Ltd</td><td>MD1-16LMB</td><td>结晶试剂盒（试管，每种条件10 mL），用于LMB12</td></tr><tr><td>Clear Strategy&amp;trade; Screen 2 pH 8.5</td><td>Molecular Dimensions Ltd</td><td>MD1-16LMB</td><td>结晶试剂盒（试管，每种条件10 mL），用于LMB12</td></tr><tr><td>Index&amp;trade;</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-144</td><td>结晶试剂盒（试管，每种条件10 mL），用于LMB13</td></tr><tr><td>SaltRX&amp;trade; 1</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-107</td><td>结晶试剂盒（试管，每种条件10 mL），用于LMB14</td></tr><tr><td>SaltRX&amp;trade; 2</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-109</td><td>结晶试剂盒（试管，每种条件10 mL），用于LMB14</td></tr><tr><td>MemStar&amp;trade;</td><td>Molecular Dimensions Ltd</td><td>MD1-21</td><td>结晶试剂盒（试管，每种条件10 mL），用于LMB15</td></tr><tr><td>MemSys&amp;trade;</td><td>Molecular Dimensions Ltd</td><td>MD1-25</td><td>结晶试剂盒（试管，每种条件10 mL），用于LMB15</td></tr><tr><td>JCSG-plus&amp;trade; Suite</td><td>Qiagen</td><td>130720</td><td>结晶试剂盒（试管，每种条件10 mL），用于LMB16</td></tr><tr><td>MORPHEUS&amp;reg; 筛选试剂盒</td><td>Molecular Dimensions Ltd</td><td>MD1-46</td><td>结晶试剂盒（试管，每种条件10 mL），用于LMB17</td></tr><tr><td>Pi minimal 筛选试剂盒</td><td>JenaBioScience</td><td>CS-127</td><td>结晶试剂盒（试管，每种条件10 mL），用于LMB18</td></tr><tr><td>Pi-PEG 筛选试剂盒</td><td>JenaBioScience</td><td>CS-128</td><td>结晶试剂盒（试管，每种条件10 mL），用于LMB19</td></tr><tr><td>MORPHEUS&amp;reg; II 筛选试剂盒</td><td>Molecular Dimensions Ltd</td><td>MD1-91</td><td>结晶试剂盒（试管，每种条件10 mL），用于LMB20</td></tr><tr><td>LMB 结晶筛选试剂盒&amp;trade;</td><td>Molecular Dimensions Ltd</td><td>MD1-98</td><td>结晶试剂盒（试管，每种条件10 mL），用于LMB21</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;添加剂筛选试剂盒&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HT 添加剂筛选试剂盒</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-138</td><td>冷冻于96孔深孔板中（每孔1 mL）。</td></tr><tr><td>MORPHEUS&amp;reg; 添加剂筛选试剂盒</td><td>Molecular Dimensions Ltd</td><td>MD1-93-500</td><td>冷冻于96孔深孔板中（每孔500 &amp;micro;L）。</td></tr><tr><td>ANGSTROM 添加剂筛选试剂盒&amp;trade;&amp;nbsp;</td><td>Molecular Dimensions Ltd</td><td>MD1-100</td><td>冷冻于96孔深孔板中（每孔1 mL）。</td></tr><tr><td>MORPHEUS&amp;reg; 添加剂筛选试剂盒</td><td>Molecular Dimensions Ltd</td><td>MD1-93</td><td>冷冻于96孔细胞培养 Costar&amp;reg; V型底板中（每孔100 &amp;micro;L）。</td></tr><tr><td>ANGSTROM 添加剂筛选试剂盒&amp;trade;&amp;nbsp;</td><td>Molecular Dimensions Ltd</td><td>MD1-100-FX</td><td>冷冻于96孔细胞培养 Costar&amp;reg; V型底板中（每孔100 &amp;micro;L）。</td></tr><tr><td>HIPPOCRATES 添加剂筛选试剂盒</td><td>Molecular Dimensions Ltd</td><td>n/a</td><td>48种单一添加剂（来自 MORPHEUS&amp;reg; III 的药物化合物）。</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;其他耗材&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>96孔 MRC 双滴板</td><td>Swissci</td><td>MRC 96T-UVP</td><td>坐滴法，蒸汽扩散板。推荐储液池体积：80&amp;nbsp; &amp;micro;L。有效液滴体积范围：10–1000 nL。可透紫外光。</td></tr><tr><td>48孔 MRC 单滴板&amp;nbsp;（“MAXI 板”）</td><td>Swissci</td><td>MMX01-UVP&amp;nbsp;</td><td>坐滴法，蒸汽扩散板，用于放大/优化。推荐储液池体积：200&amp;nbsp; &amp;micro;L。有效液滴体积范围：0.1–10 &amp;micro;L。可透紫外光。</td></tr><tr><td>MRC 悬滴密封条</td><td>Swissci</td><td>n/a</td><td>悬滴法，兼容 MRC 蒸汽扩散板（MRC 96T-UVP 和 MMX01-UVP）。可透紫外光和X射线。</td></tr><tr><td>粘性封口膜</td><td>Hampton Research</td><td>HR4-50</td><td>3英寸宽 Duck&amp;reg; HD Clear&amp;trade;，用于封膜仪和手动封口。</td></tr><tr><td>粘性铝箔片</td><td>Beckman Coulter</td><td>538619</td><td>用于重新密封添加剂筛选板。</td></tr><tr><td>墨盒</td><td>Markem-Imaje</td><td>9651</td><td>系统1（喷墨打印机）。</td></tr><tr><td>溶剂盒</td><td>Markem-Imaje</td><td>8652</td><td>系统1（喷墨打印机）。</td></tr><tr><td>50 &amp;micro;L 吸头&amp;nbsp;</td><td>Hamilton</td><td>235947</td><td>系统2（STAR&amp;trade; 液体处理仪）。每盒6组，共1920个 CO-RE&amp;trade; 吸头，一次性堆叠包装。</td></tr><tr><td>试剂容器</td><td>Hamilton</td><td>194052</td><td>在添加剂筛选流程中用于向板中分配试剂条件。&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>PCR 板</td><td>Thermo Scientific&amp;trade;</td><td>AB-2150</td><td>系统2（用于盛装待转移至 Mosquito&amp;reg; 的蛋白）。Abgene Diamond ultra，384孔V型底。</td></tr><tr><td>微注射器</td><td>TTP Labtech</td><td>4150-03020</td><td>Mosquito&amp;reg; 纳升级分液器用微注射器卷盘（共26,000支，间距9 mm）。</td></tr><tr><td>条带支架块</td><td>TTP Labtech</td><td>3019-05013</td><td>Mosquito&amp;reg; 条带用SSB装置，又称“四通道试剂支架”。</td></tr><tr><td>2 &amp;micro;L 8孔条带</td><td>TTP Labtech</td><td>4150-03110</td><td>用于 Mosquito&amp;reg; 工作台上的蛋白储存。每盒40条，每孔最大容积3.2 &amp;micro;L。</td></tr><tr><td>5 &amp;micro;L 8孔条带</td><td>TTP Labtech</td><td>4150-03100</td><td>用于 Mosquito&amp;reg; 工作台上的蛋白储存。每盒40条，每孔最大容积7.5 &amp;micro;L。</td></tr><tr><td>5 mL 注射器</td><td>TTP Labtech</td><td>4150-07100</td><td>Dragonfly&amp;reg; 液体处理仪用注射器本体及活塞。每包100个。</td></tr><tr><td>槽/储液槽</td><td>TTP Labtech</td><td>4150-07103</td><td>用于 Dragonfly&amp;reg; 工作台上的储备溶液储存。每包50个。</td></tr><tr><td>轨道微孔板振荡器</td><td>CamLab Limited</td><td>n/a</td><td>Variomag&amp;reg;，用于单块板内条件混合（0–2000 rpm）。</td></tr><tr><td>微孔板混匀器</td><td>TTP Labtech</td><td>3121-01015</td><td>MxOne。通过96个振动针实现单板内条件混合。</td></tr></tbody></table>

mrc分子生物学实验室大分子结晶的自动化方案

Automated Protocols for Macromolecular Crystallization at the MRC Laboratory of Molecular Biology

当获得可衍射X射线的高质量晶体时，即可在接近原子分辨率的水平上解析其晶体结构。然而，蛋白质、DNA、RNA及其复合物的结晶条件无法预先预测。采用多种不同的条件是提高获得优质衍射晶体几率的有效方法。英国剑桥医学研究理事会分子生物学实验室（MRC-LMB）已开发出两套完全自动化的系统，可通过纳升液滴的蒸气扩散法，在1,920种初始条件下进行结晶筛选。此外，还建立了半自动化方案，通过调节试剂浓度、pH值或添加可能改善所得晶体性质的添加剂来优化结晶条件。本文将详细描述并简要讨论所有相关实验方案。综合而言，这些方法使得在多用户实验平台中能够便捷且高效地进行大分子结晶，同时使用户能够掌控实验中的关键参数。

本文描述并讨论了用于常规制备大量筛选板及纳升级结晶液滴以进行蒸汽扩散实验的自动化系统与方案。

MRC分子生物学实验室大分子结晶的自动化方案

当获得可衍射X射线的高质量晶体时，即可在接近原子分辨率的水平上解析其晶体结构。结晶所需的条件……

本实验的总体目标是从初步结晶筛选条件出发，获得高质量的晶体。这些晶体可用于研究蛋白质、DNA、RNA及其复合物的结构。关于大分子结构的研究正变得日益具有挑战性。提供多种初始条件可提高获得有用晶体的产量，同时减少样品和晶体优化的需求。LMB 的两个全自动系统可实现最多 1,920 个纳升液滴的蒸汽扩散实验的制备。为简洁起见，本文假设用户已熟悉纳升级分液仪、喷墨打印机以及粘性板封膜仪的基本操作与维护。在执行程序之前，确保系统的机器人已初始化，并且其控制软件已打开。在主程序启动前约30分钟，打开管冷却载体的制冷机。将一块测试板放置在板封膜机的电动SBS载体上。运行封板仪，并检查封膜是否正确贴合。重复此测试两次，以确认封板仪已准备就绪。然后向液体处理系统的主容器中加入20升去离子水。断开连接插件与盛有20%乙醇冲洗液的小容器，将插件连接至主容器。在喷墨打印机的触摸屏上输入相应的屏幕名称，然后打开并关闭转盘门以触发转盘旋转。当第一个堆栈出现时打开门。将第一个堆栈完全装入22块结晶板，每块板的第一列朝外。以相同方式完全装入接下来的两个堆栈。将剩余的六块板加载到第四层堆叠的最高位置，然后关闭转盘门。确认冷却器显示屏显示为14摄氏度。轻轻反复倒置选定的筛选试剂盒，持续一分钟。然后，打开液体处理仪的前面板。打开管盖，将离心管按照标准的96孔板布局放置于冷却载体中。每将一个离心管放入载体时，将其管盖以相同的96孔板布局放置在托盘上。使用系统1时，需将标签引线按96孔板布局放置在托盘上，以便核对确认试管排列正确。核对试管位置后，确保所有试管均处于水平并已稳固地放入载体中，然后关闭前面板。在液体处理仪软件的启动窗口中，选择“运行维护”并打开冲洗程序。运行该程序，以将系统中的20%乙醇冲洗干净，并清洗液体分配吸头的外部。冲洗完成后，单击“取消”返回启动界面。选择“运行现有流程”，然后单击“开始选择”。打开 MRC 试剂盒分液程序。在配置界面中输入 18 作为“实例数”，并运行程序。在前四块板被标记、填充和密封时，监控系统运行情况。在完成前四块板的制备之前，请勿离开系统无人看管。待所有72块板均制备完毕并放回转盘后，将耦合接头从去离子水容器切换至20%乙醇容器。使用与之前相同的操作流程运行启动冲洗程序。关闭制冷机并丢弃空的筛选试剂盒管。小心地从转盘上取下72块已准备好的培养板。丢弃填充错误或密封不良的培养板。将即用型酶标板储存于10摄氏度。首先确保系统的机器人已开启，纳升级分液器已初始化并打开其软件，且液体处理仪的方法管理器已打开。在主程序启动前约15分钟，打开微量管冷却载体。将测试板放置在板封膜机的电动SBS载板架上。运行板封膜机，并确认板已正确封膜。重复测试板封膜机三次。然后运行纳升级分液器，在检测板中加入100纳升的测试溶液液滴。图中所示为纳升级分液器使用红色染料配制的测试溶液产生的100纳升液滴的光学显微图像。关闭纳升级分液器软件，并从仪器平台取下条带架模块。接下来，将一个预先装填好的96孔结晶板放入定制设计的板架中，该结晶板的条件中含有最高相对量的挥发性试剂。移除板上的粘性封膜。打开液体处理仪的前面板，将未密封的板放置在第一个滑动载台后部的台面上。用SBS铝盖盖住平板。通过轻轻按压盖子的对角，将盖子向载体的左后角方向固定。使用System 2时，应优先处理含有大量挥发性试剂的筛选试剂盒。这可以避免在SBS引物上形成冷凝水，否则可能影响引物的自动化操作或板密封。打开密封后，将引物装入滑动载体中，并以相同方式处理剩余的19块板，操作顺序从挥发性最强到最弱的条件依次进行。当微型管冷却载体温度达到4摄氏度（由绿灯指示）时，取下其盖子。剪切掉含有至少 440 微升蛋白样品的微量离心管管盖。确保样品液面无泡沫，因为泡沫会干扰液体检测系统。将该管置于微量离心管冷却载体的 1 号位置。将PCR板放置在液体处理仪工作台面上的板移动适配器载具前方，然后关闭前方面板。在液体处理仪的方法管理界面中，选择“设置板”（Setup Plates）。监测两个系统的初始化过程，并填写运行参数，包括板的类型、每种条件下液滴的数量、液滴体积、待处理第一块板的位置以及板的总数。当提示是否需要帮助加载甲板时，点击“否”。确认无空的吸头架后，点击“确定”。确认运行所需的吸头数量充足后，点击“确定”。必要时更新吸头管理系统，然后点击“确定”。确保纳升级分液仪甲板上无条带支架模块，并且载体位于50 µL吸头堆栈后方，远离铝制SBS盖板。仔细检查所有其他所需组分是否已准备就绪，然后启动程序。在纳升级分液器将液滴加入第一块微孔板、随后由板封仪密封微孔板的过程中，需全程监控系统。在第一块微孔板制备完成前，不得让系统无人看管。当所有 20 块板均制备好结晶液滴并自动返回滑动载体后，打开前面板，轻轻取出这些板。在将板存放以进行结晶之前，检查其密封是否正确。使用 20% 乙醇溶液清洁 SBS 盖，然后将其堆叠在液体处理仪左侧以备储存。弃去 PCR 板和微量离心管。关闭微量离心管冷却装置，并擦去冷凝水。在冷却表面放置一张纸巾，以吸收后续产生的冷凝水。然后更换载体盖并关闭前面板。OmpF 和 MreB 最初通过这些完全自动化的方案进行筛选。在 LMB 7 板的 A4 孔中获得了可用于 X 射线衍射的高质量 OmpF 晶体。MreB 的衍射级晶体在 LMB 20 板的 D12 孔中被发现。将预置试剂板储存于 10 摄氏度是一种折中方案，可避免结冰，同时避免在 4 摄氏度储存时可能引起的结晶条件恶化及冷凝相关问题。以这种方式储存时，试剂板可在四到五个月内使用。每年使用系统1生产4,000至8,000块LMB平板，用于初步筛选。当预期通量显著较低时，应相应调整优化方案。我们通常将全部预制燃料平板作为一个大规模初筛，用于检测新样本。然而，可根据更具体的样品需求选择较少的培养板。制备液滴后，将培养板存放于低振动的置物架上，并将温度严格控制在4或18摄氏度。实验通过扫描光源显微镜进行评估。在仔细研究晶体的性质后，可利用基于网络的工具（如 LMB 或 C6 Screen 数据库）分析不同条件下晶体的特征及相似性。后续可能仍需对结晶条件进行优化。更多自动化实验方案，包括四角法和添加剂筛选，已在我们的论文中详细描述。

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结晶与 原位 使用哈威尔结晶设施和钻石光源 VMXi 光束线在室温下收集数据

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MRC分子生物学实验室大分子结晶的自动化方案

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