Automated Protocols for Macromolecular Crystallization at the MRC Laboratory of Molecular Biology

该程序的总体目标是从初始结晶筛选条件中生产出高质量的晶体。这些晶体可用于研究蛋白质、DNA、RNA 及其复合物的结构。关于大分子结构的某些方面变得越来越具有挑战性。

提供多种初始条件可以提高有用晶体的产量，同时减少对样品和晶体优化的需求。两个全自动系统 LMB 有助于在纳升液滴中制备多达 1， 920 个蒸汽扩散实验。为简洁起见，假设用户已经熟悉纳升分配器、喷墨打印机和粘合板封口机的基本功能和维护。

在执行该过程之前，请确保系统的机器人已初始化并且其控制软件已打开。在主程序启动前约 30 分钟打开管式冷却架的冷却器。将测试板放在封板机的电动 SBS 载体上。

运行孔板密封机并检查薄膜是否正确粘贴。再重复此测试两次，以验证板封口机是否已准备就绪。然后将 20 升去离子水加入液体处理器的主容器中。

断开较小容器中的 20% 乙醇冲洗液的耦合插件，并将插件连接到主容器。在喷墨打印机触摸屏上输入适当的屏幕名称。然后打开和关闭轮播门以触发轮播旋转。

当第一个堆栈出现时打开门。用 22 个结晶板装满第一个堆栈，每个结晶板的第 1 列朝外。以相同的方式完全加载接下来的两个堆栈。

将剩余的 6 个板加载到第四个堆栈的最高位置，然后关闭转盘门。验证冷却器显示屏是否指示 14 摄氏度。轻轻地反复颠倒选定的筛选试剂盒一分钟。

然后，打开液体处理器的前面板。打开试管并将其以标准 96 孔布局放置在冷却载体中。将每根试管放入载体中后，将其盖子以相同的 96 孔布局放在托盘上。

使用系统 1 时，标记导线以 96 孔布局放置在托盘上，以便交叉检查试管是否排列正确。交叉检查试管位置，然后确保所有试管都水平并固定在托架中。然后关闭前面板。

在液体处理器软件的 Startup（启动）窗口中，选择 Run Maintenance（运行维护）并打开 Flushing 程序。运行该程序以冲洗系统中的 20% 乙醇并清洗液体分配吸头的外部。刷新完成后，单击 Cancel 返回 Startup。

选择 Run An Existing Process 并单击 Start Your Selection。打开 MRC Kit 分配程序。在配置屏幕中填写 18 英寸for Instances 并运行程序，在前四个板贴标签、填充和密封时监控系统。

在前 4 个板的制备完成之前，不要让系统无人看管。准备好所有 72 块板并放回转盘中后，将偶联插件从去离子水容器切换到 20% 乙醇容器。使用与以前相同的过程运行启动 flush 程序。

关闭冷却器并丢弃空的筛选套件管。小心地从转盘中取出准备好的 72 个盘子。丢弃填充错误或密封不良的板。

将即用型板储存在 10 摄氏度。首先确保系统的机器人已打开，纳升分配器在软件打开的情况下进行初始化，并且液体处理器的方法管理器已打开。在主程序启动前约 15 分钟打开微管冷却托架。

将测试板放在封板机的电动 SBS 载体上。运行板密封仪并验证板是否正确密封。测试板封口机三次。

然后运行纳升分配器，在测试板中设置 100 纳升测试溶液液滴。此处显示的是 100 纳升液滴的光学显微照片，该液滴由纳升分配器产生，测试溶液由红色染料制成。关闭 nanoliter 分配器软件并从甲板上取下胶条支架块。

接下来，设置在定制设计的板架中，这是一个预装的 96 孔结晶板，在其条件下具有最高的挥发性试剂相对量。从板上取下胶膜。打开液体处理器前面板，将未密封的板放在第一个滑动托架背面的甲板上。

用 SBS 铝盖盖住板。轻轻按压盖子的对角，将盖子朝托架的左后角方向放置。使用系统 2 时，应首先处理含有大量挥发性试剂的筛选试剂盒。

这避免了在 SBS 引线上形成冷凝水，这可能会影响引线的自动处理或板密封。解封，装入滑动托架，并以相同的方式覆盖剩余的 19 块板，从最易挥发性到最不易挥发的条件下工作。一旦微管冷却载体达到 4 摄氏度（如绿灯所示），请取下其盖子。

切掉含有至少 440 μL 蛋白质样品的微管的盖子。确保样品的弯液面上方没有泡沫，因为这会干扰液体检测系统。将管子放在微管冷却载体的位置 1 上。

将 PCR 板放在移液板移动适配器托架前面的液体处理平台上。然后关闭前面板。在液体处理器方法管理界面中，选择 Setup Plates（设置板）。

监控两个系统的初始化并填写运行参数，包括板类型和每种条件的液滴数、液滴大小、要处理的第一个板的位置以及板的数量。当询问您是否需要帮助加载 Deck 时，单击 No （否）。检查没有空的枪头盒后，单击 OK（确定）。检查完运行时有足够的提示后，单击 OK（确定）。必要时，请更新提示管理系统，然后单击 OK（确定）。确保纳升分液器台面远离胶条支架块，并且载体位于 50 微升吸头堆栈的背面，远离铝制 SBS 盖。

仔细检查所有其他必需的组件是否都已准备就绪，然后开始该过程。当纳升分液器将液滴设置在第一块板中时，系统会对系统进行监测，然后板封口机会密封板。在第一块板的制备完成之前，不要让系统无人看管。

用结晶液滴制备完所有 20 个板并自动返回到滑动载体后，打开前面板并轻轻取出板。在储存板进行结晶之前，请检查板是否正确密封。用 20% 乙醇溶液清洁 SBS 盖子，然后将其堆叠在液体处理器的左侧进行储存。

丢弃 PCR 板和微管。关闭微管冷却载体并擦去冷凝水。在冷却器表面的顶部留下一张纸巾以吸收进一步的冷凝水。

然后装回托架盖并合上前面板。OmpF 和 MreB 最初使用这些全自动方案进行筛选。在 LMB 7 板的 A4 孔中发现了质量足以进行 X 射线衍射的 OmpF 晶体。

在 LMB 20 板的 D12 孔中发现了 MreB 的衍射质量晶体。将预燃料板存放在 10 摄氏度是一种折衷方案，以避免冻结并在 4 摄氏度下储存，这可能会导致结晶条件恶化和冷凝相关问题。以这种方式储存时，印版可在 4 到 5 个月内使用。

每年使用系统 1 生产 4 到 8， 000 个 LMB 板，然后用于初步筛选。当预期周转率低得多时，应以不同的方式优化协议。我们的整套预燃料板通常用作新样品的大型初始筛选。

但是，根据更具体的样品要求，可以选择较少的板。制备液滴后，将板储存在低振动架上，温度严格控制在 4 或 18 摄氏度。用涡旋光源显微镜评估实验。

在仔细研究了晶体的性质之后，可以使用基于 Web 的工具（如 LMB 或 C6 Screen 数据库）分析不同条件下的特征和相似性。可能仍然需要对结晶条件进行后续优化。我们的手稿中描述了其他自动化方案，包括 4 角方法和添加剂筛选。