Name: 利用 Immunolabeling 分析斑马鱼胚胎中的稳定、动态和初生的微管 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 38 s
Description: 学习免疫标记技术，用于分析斑马鱼胚胎中稳定、动态和初生微管。该方法可优化原位检测与定量，帮助研究发育神经生物学中的细胞极性建立机制。

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共聚焦显微镜的购置资金来自美国国家科学基金会（NSF）的资助，资助号为 DBI-0722569。本研究得到了美国国立卫生研究院/国家普通医学科学研究所（NIH/NIGMS）资助号 GM085290 以及美国国防部（DOD）资助号 W81XWH-16-1-0466 的支持，上述资助授予 R.M. Brewster。E. Vital 的资助来自霍华德·休斯医学研究所通过预科及本科科学教育项目向马里兰大学巴尔的摩县分校（UMBC）提供的资助，资助号为 52008090。S.P. Brown 获得了美国教育部 GAANN 奖学金、由 NIH/NIGMS 资助号 GM055036 资助的梅耶霍夫研究生奖学金，以及由美国国防部资助号 W81XWH-16-1-0466 资助的研究助理奖学金的支持。

伦理声明：下述实验步骤遵循马里兰大学巴尔的摩县分校的动物护理指南。
1. 使用免疫标记法分析稳定和动态微管（方案1）
<ol>
	<li>固定前胚胎的人工去壳
	<ol>
		<li>通过倒掉过量的系统水，然后将剩余的胚胎收集到一个塑料培养皿中，获取新鲜产下的胚胎（参见材料表）。</li>
		<li>清除系统水中的任何碎片，并将胚胎转移到盛有胚胎培养基的新培养皿中（参见材料表），以确保胚胎在洁净的环境中发育。</li>
		<li>将胚胎置于28.5 °C的温控培养箱中，使其发育至所需阶段。</li>
		<li>将受精后24小时以内（hpf）的胚胎置于玻璃培养皿中，准备去壳。 
		注：为最大限度促进固定剂快速渗透并保持微管（MT）结构完整性，应在固定前进行去壳。使用胚胎培养基而非系统水，以提供去壳过程中所需的额外Ca2+。</li>
		<li>在解剖显微镜下，使用精细镊子在培养皿中手动去除胚胎的卵膜。
		<ol>
			<li>用一对镊子夹住环绕胚胎的圆形透明卵膜的一小部分区域，然后轻轻拉开镊子，使膜破裂。</li>
			<li>用镊子小心撬动已破裂的卵膜以扩大开口。操作时注意不要触碰胚胎，以免其破裂。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>发育阶段胚胎的固定
	<ol>
		<li>将已发育至特定阶段且已去壳的胚胎转移至1.5 mL离心管中。使用玻璃巴斯德移液管尽可能吸除胚胎培养基。 
		注：对年轻胚胎（体节中期）进行固定和药物处理，此时介导痛觉的神经中枢尚未形成，因此在实施安乐死时无需额外程序以减轻疼痛。发育阶段定义参见Kimmel 等., 199525。图2和3的图像采集使用了4–5体节和11–12体节阶段的胚胎。</li>
		<li>通过将1 mL 8% 多聚甲醛（PFA）与1 mL 2X MAB（MT组装缓冲液）混合，并在每1 mL总体积中加入2 µL 100% Triton X-100，配制4% PFA/MAB固定液（参见材料表）。 
		警告：操作含PFA和Triton X-100的溶液时需佩戴手套，二者均为皮肤刺激物。</li>
		<li>在28.5 °C下用1 mL 4% PFA/MAB固定液固定胚胎5分钟。用移液器吸除固定液，更换为1 mL新鲜固定液，并在室温（RT）摇床上孵育3小时。 
		注：样品必须在其生理温度（斑马鱼为28.5 °C）下迅速固定，以防止温度依赖性的微管（MT）解聚。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>吸除固定液，加入1 mL 1x 含NP40的Tris缓冲盐水（TBS-NP40）缓冲液。在室温摇床上轻轻振荡，每次5分钟，共三次。将胚胎保存在1 mL新鲜1X TBS-NP40缓冲液中，置于4 °C，保存时间不超过7天。 
	警告：操作含NP-40的溶液时需佩戴手套，NP-40为皮肤刺激物。</li>
	<li>用于免疫标记的胚胎切片
	<ol>
		<li>将室温下的4%低熔点（LMP）琼脂糖包埋介质置于密闭容器中，使用50 °C加热板加热至溶液澄清，加热位置应靠近解剖显微镜。在样品处理间隙保持容器密闭，并在整个包埋过程（步骤1.4.4–1.4.6）中持续加热。</li>
		<li>使用玻璃移液管将胚胎从1.5 mL离心管转移至培养皿，并加入1X TBS-NP40缓冲液。</li>
		<li>在解剖显微镜放大下，使用精细镊子在培养皿中去除体节形成阶段的胚胎（4–5和11–12体节）的大卵黄细胞26。用一对镊子夹住胚胎尾芽，另一对镊子剥离卵黄细胞，以保留后脑组织。将去卵黄的胚胎转移至培养皿中无卵黄碎片的区域。 
		注：应将胚胎逐个包埋于琼脂糖模具中，以防止LMP琼脂糖过早凝固。</li>
		<li>使用移液器将200 µL熔化的LMP琼脂糖注入切片模具的一个12 mm × 5 mm × 3 mm的孔中。在注模后20秒内迅速完成步骤1.4.5–1.4.6，以在LMP琼脂糖冷却至室温并凝固前完成胚胎包埋。</li>
		<li>在解剖显微镜下，使用精细镊子夹住去卵黄胚胎的尾芽，将其从培养皿转移至琼脂糖填充模具的锥形端。</li>
		<li>使用精细镊子调整胚胎在模具中的方向，使振动切片机能沿所需平面切割。为获得横切面，应使胚胎的后脑组织与模具长度方向平行，背侧朝向边缘，前侧朝向锥形端。对剩余胚胎重复步骤1.4.4–1.4.6。</li>
		<li>在室温下静置5分钟，使琼脂糖包埋物完全凝固。</li>
		<li>使用振动切片机对包埋于琼脂糖中的胚胎（步骤1.4.1–1.4.7）沿最高轴生成40 µm厚的切片，切片槽中应充满1x TBS-NP40。使用精细镊子将感兴趣的切片转移至24孔板，每孔500 µL 1x TBS-NP40中。每孔仅放置一个胚胎的切片。 
		注：更多细节参见参考文献18。确保切片始终至少浸没在250 µL缓冲液中，并在后续步骤中以低速（10–25 rpm）摇动，以防止切片从琼脂糖包埋物中分离。封闭剂和洗涤液中的去垢剂应降低液体介质的表面张力，使切片完全浸没。检查切片在所有操作过程中是否保留在孔中。清洗时需小心，避免意外丢弃切片。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>吸除缓冲液，加入500 µL封闭液。在室温下摇动至少1小时。 
	注：封闭液应包含每种二抗宿主物种来源的5%血清（参见材料表）。</li>
	<li>在4 °C摇床上，用300 µL以封闭液稀释的一抗孵育36–72小时。在室温下用600 µL 1x TBS-NP40缓冲液在摇床上洗涤两次，每次30分钟。 
	注：通过同时孵育针对总微管（抗β-微管蛋白或抗α-微管蛋白）和稳定微管（抗Glu-微管蛋白）或动态微管（抗Tyr-微管蛋白）的一抗实现双标记。当对总微管和翻译后修饰的α-微管蛋白群体进行双标记时，应选择来自不同宿主物种的一抗。抗体稀释比例参见材料表。</li>
	<li>在4 °C避光条件下，在摇床上用300 µL以封闭液稀释的荧光标记二抗孵育16–24小时。在室温下用600 µL 1x TBS-NP40缓冲液在摇床上洗涤两次，每次30分钟。 
	注：从此时起，每次操作后均需用铝箔包裹含二抗的多孔板，以防止荧光淬灭。选择能与一抗宿主免疫球蛋白反应的二抗。选择发射光谱分离且无重叠的荧光二抗。抗体稀释比例参见材料表。</li>
	<li>在室温下，在摇床上用500 µL DAPI溶液孵育胚胎30分钟。在室温下用TBS-NP40缓冲液摇动洗涤三次，每次5分钟。 
	注：细胞核标记为步骤1.12中进行的微管（MT）定量分析提供细胞背景信息。</li>
	<li>在洁净载玻片中央滴加一滴含抗淬灭剂的封片剂。使用精细镊子将切片转移至封片剂液滴中。在样品上加盖洁净的盖玻片。将载玻片用铝箔包裹，存放于干燥、避光、低温处，直至成像。 
	注：成像前用细头永久性记号笔在载玻片背面圈出切片位置，有助于在显微镜下识别切片。</li>
	<li>共聚焦成像
	<ol>
		<li>将切片置于倒置激光扫描共聚焦显微镜上，将载玻片固定于载物台，使盖玻片朝向物镜。在对照载玻片上确定合适的光学参数（物镜、激光和通道设置如增益和偏移），并在各样品间保持一致27。避免像素过饱和，以防数据丢失。</li>
		<li>使用所选荧光二抗的通道设置采集Z-stack共聚焦图像，并保存图像文件27。为每个切片采集Z-stack。 
		注：通过以下采集参数复制图2和3图像的获取条件：模式 = XYZ；物镜放大倍数 = 63X油镜；物镜数值孔径 = 1.4；Z步长 = 0.1 µm；Z深度 = 16.23 µm。通道设置如下：DAPI使用20%紫外激光激发，发射滤光范围 = 430–480 nm，光电倍增管（PMT）增益 = 525 V，PMT偏移 = -1.72%；448 nm荧光染料（参见材料表）使用20% 488 nm激光激发，发射滤光范围 = 493–573 nm，PMT增益 = 689 V，PMT偏移 = -0.2%；594 nm荧光染料使用32% 594 nm激光激发，发射滤光范围 = 608–706 nm，PMT增益 = 768 V，PMT偏移 = -6.8%。</li>
		<li>以唯一且具描述性的文件名保存原始数据文件，并创建副本用于图像分析软件编辑。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Z-stack合并以生成最大投影图像
	<ol>
		<li>使用公共领域的三维图像分析软件（例如，ImageJ）打开数据文件副本。检查每个通道是否显示为独立的图像序列（Z-stack）。</li>
		<li>使用以下菜单序列拆分图像通道：“图像/颜色/拆分通道”。</li>
		<li>通过以下菜单序列叠加目标通道创建合并图像：&#34;图像/颜色/合并通道&#34;。选择将594 nm、488 nm和DAPI通道分别伪染为红色、绿色和蓝色。勾选&#34;创建复合图像&#34;并点击&#34;确定&#34;28。 
		注：为更好地在最大投影中展示微管（MT）的细节（如图2和3所示），可省略DAPI通道，仅对另两个通道进行伪染。</li>
		<li>检查合并的Z-stack，记录所有可见通道中内部最佳Z平面的起始和终止位置。忽略因切片表面不平整而导致信号不佳的外部Z平面。详情参见参考文献29。</li>
		<li>通过以下三维图像分析菜单序列对Z-stack执行最大强度投影，将合并的Z-stack可视化为单张二维图像：&#34;图像/堆栈/Z-投影&#34;。将步骤1.11.3中确定的内部最佳Z平面的起始和终止位置分别填入&#34;起始切片&#34;和&#34;终止切片&#34;。选择&#34;最大强度&#34;作为投影类型，点击&#34;确定&#34;。更多细节参见参考文献28。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>微管标记分析
	<ol>
		<li>打开商用三维图像分析软件。选择&#34;创建库&#34;，并为图像库提供描述性名称。点击&#34;创建&#34;。将共聚焦显微镜生成的原始图像文件拖入库中。较大的文件需要更长时间传输。</li>
		<li>选择待分析文件。从&#34;视图&#34;菜单中选择&#34;扩展聚焦&#34;，在主窗口中显示通道合并图像。</li>
		<li>通过左右拖动每个通道的滑块工具调整阈值，以降低背景信号并增强真实信号。观察每个通道是否显示目标分子的真实信号（例如，DAPI通道显示椭圆形或有丝分裂的细胞核，而非细胞质或琼脂糖的自发荧光）。</li>
		<li>选择&#34;自由手选感兴趣区域（ROI）&#34;工具，勾勒待分析区域。选择&#34;操作&#34;标签页，然后选择&#34;裁剪至选区&#34;以裁剪图像。将裁剪后的图像文件另存为新名称。点击&#34;测量&#34;标签页，创建用于筛选与三维分析相关的特定对象的协议。</li>
		<li>将&#34;查找对象&#34;拖至协议窗口。将第一个协议重命名为&#34;DAPI&#34;。在下拉菜单中选择DAPI通道。将以下设置依次拖至DAPI协议中，并置于&#34;查找对象&#34;下方（顺序见表1）：&#34;填充对象孔洞&#34;；&#34;分离接触对象&#34;；&#34;按大小排除对象&#34;；&#34;排除不接触ROI的对象&#34;。 
		注：表1中设置的目标是首先设定一个阈值，以剔除分布和大小与待分析对象不符的信号。例如，在计数细胞核时，应排除尺寸过小不足以成为细胞核的信号。</li>
		<li>按照步骤1.12.9的流程，使用表1中的设置为β-微管蛋白及其他标记物组装剩余的筛选步骤。</li>
		<li>在每个协议底部选择&#34;测量&#34;。对所有微管蛋白标记选择&#34;强度与体积测量&#34;和&#34;骨架长度&#34;，仅对DAPI信号选择前者。</li>
		<li>在待测区域周围绘制ROI。软件处理区域后，在&#34;汇总&#34;标签页下查看测量结果。复制数据并保存至可编辑的电子表格中（如表2所示）。为后续分析创建电子表格的备份副本。</li>
		<li>在电子表格中选择感兴趣的测量指标（例如，微管束长度、每个细胞核的微管束数量，通过不同标记揭示），并进行分析以确定各组的平均值。 
		注：平均微管束长度 = 每个胚胎的“β-微管蛋白平均骨架长度”之和除以胚胎总数。参见表2第20行。格式化电子表格，以便变量和实验组易于绘图。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 从头 MT 组装实验（方案 2）
<ol>
	<li>在实验前2天构建并测试多孔流通装置（图1）。 
	注意：该装置可利用材料表中的耗材，在诺考达唑处理后同时对多个实验组进行洗脱。硅胶密封剂在使用前至少需要24小时的干燥时间，以确保对胚胎无毒性风险。
	<ol>
		<li>使用夹具或带锯沿长度方向将一个50 mL离心管切成两半。</li>
		<li>从70 µm尼龙网中裁剪出7个半圆形（半径3 cm），修剪后使其紧密贴合于离心管的一半中。使用水族专用硅胶密封剂将这些半圆形网片平行粘附于离心管的10 mL刻度线位置。让装置干燥2天，然后在烧杯的水中浸泡2–3小时进行冲洗。</li>
		<li>用油灰在切割后的离心管顶部（螺纹端）内侧进行衬垫，使流通装置中保留的液面深度为¼英寸（图1，视图2和3）。</li>
		<li>准备洗脱装置：从50 mL注射器上取下推杆，并将12英寸细管插入注射器尖端。将细管尽可能推入，并用油灰在连接处进行密封。</li>
		<li>使用胚胎培养基预润湿滤网，使液体能够流经整个流通装置。将装置倾斜放置于冰上，使液体充满所有腔室，但仍能从前端（油灰边缘所在位置）排出。使用铁架台将洗脱装置悬置于冰上的流通装置上方（图1）。</li>
		<li>将200 mL胚胎培养基冰上预冷，倒入洗脱装置中，确保排尽所有气泡，且流速约为7 mL/min。通过调节注射器高度来调整流速。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>酶法去除胚胎的卵膜
	<ol>
		<li>通过将1 mL浓度为10 mg/mL的非特异性蛋白酶原液稀释至20 mL胚胎培养基中，配制工作液。</li>
		<li>在胚胎预计达到目标发育阶段前1小时进行化学去膜。将处于目标阶段的胚胎从100 mm培养皿中移除原有培养基，加入20 mL非特异性蛋白酶工作液以消化卵膜。</li>
		<li>在37 °C下孵育5分钟。 
		注意：孵育时间不得超过5分钟，也不得使用更高浓度的非特异性蛋白酶溶液，否则在后续诺考达唑处理时会导致胚胎解体。</li>
		<li>迅速用移液器吸出非特异性蛋白酶溶液，并用约25 mL胚胎培养基重新填充培养皿。重复一次。</li>
		<li>使用1 mL玻璃移液器将小于24 hpf的胚胎转移至玻璃培养皿中，以避免损伤。</li>
		<li>如步骤1.1.5所述，使用精细镊子手动去除残留卵膜，完成去膜过程。</li>
		<li>将含有去膜胚胎的玻璃培养皿置于28.5 °C培养箱中，至少孵育30分钟，直至达到目标发育阶段。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>解聚已有的微管（MTs）
	<ol>
		<li>将50 µL浓度为1 mg/mL的诺考达唑原液与10 mL冰上预冷的胚胎培养基混合，配制5 µg/mL的诺考达唑工作液。 
		注意：操作诺考达唑时需佩戴手套，因其为皮肤刺激物。</li>
		<li>将诺考达唑处理组的胚胎培养基更换为10 mL冰冷的诺考达唑工作液。将培养皿置于冰上，根据发育阶段孵育适当时间（例如，4–5体节期胚胎孵育1小时）。将未处理的对照组胚胎保留在冰上的培养皿中，留待步骤2.3.4.1中与洗脱样本一同固定。</li>
		<li>使用火焰抛光的1 mL玻璃移液器将胚胎转移至流通装置中，每个实验组使用独立腔室。通过向50 mL注射器顶部倒入冰上预冷的胚胎培养基，开始诺考达唑洗脱。 
		注意：每个实验组至少使用30个胚胎。实验组可包括对照组胚胎，或多种形态吗啉代（morpholino）或RNA注射的胚胎。洗脱过程中每8–10分钟需添加约150 mL胚胎培养基。在洗脱诺考达唑的同时，继续通过低温抑制微管生长。保持胚胎处于冰上对该实验的成功至关重要，因为微管在低温下不稳定，且低温可延缓早期胚胎的发育。</li>
		<li>洗脱20分钟后，将胚胎转移至含有温热（28.5 °C）胚胎培养基的玻璃培养皿中，在室温下允许微管重新生长。使用火焰抛光的1 mL玻璃移液器进行转移，转移完成后立即启动计时器。
		<ol>
			<li>在1分钟、5分钟和10分钟时间点，分别用移液器将约10个对照组和洗脱组胚胎转移至装有1 mL 4% PFA/MAB固定液（28.5 °C）的1.5 mL离心管中，并按照步骤1.2.3的说明进行固定。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>按照第1.3–1.5节所述方法准备免疫标记样本。</li>
	<li>按照第1.6–1.10节所述方法对游离切片进行免疫标记并成像，但一抗使用条件调整如下：使用1:500稀释的兔抗γ-微管蛋白抗体和1:200稀释的小鼠抗β-微管蛋白抗体。</li>
	<li>按照步骤1.12所述，使用三维图像分析软件对图像进行处理和分析。</li>
</ol>

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作者无任何利益冲突需要披露。

目前已有多种方法可用于成像斑马鱼早期发育过程中的微管（MT）动态，范围涵盖对标记分子的活体成像到对固定组织进行免疫标记11,12,13,14。尽管单个细胞内的微管可处于动态或稳定状态，上皮化则是一个微管随时间推移逐渐稳定化的过程。利用稳定与动态微管的特异性标记物，可实现对该现象的可视化观察。本文所介绍的方法利用三维成像软件，对胚胎斑马鱼组织横截面中微管从动态向稳定群体转变的过程进行定量分析。在方案2中，该方法被用于标记一群新生微管，并追踪其成核及随时间的生长过程。
微管（MTs）由于易于解聚，其天然状态下的成像一直非常困难。因此，本方法的关键在于对整个胚胎内的微管进行快速固定。这一步骤通过在生理温度下开始固定，并使用一种既能稳定微管又能提高胚胎通透性的缓冲液来实现。固定时间也至关重要：固定时间过...

微管（MTs）是由α-和β-微管蛋白聚合形成的多聚体，可组装成线性原纤维，多条原纤维结合形成中空管状结构1，2。微管具有极性结构，其快速生长的正端和缓慢生长的负端分别指向细胞的不同区域，负端通常锚定在中心体或其他微管组织中心（MTOC）3。de novo微管的形成起始于γ-微管蛋白环复合体（γ-TURC）介导的成核过程，该复合体为微管组装提供模板4。在特定细胞中，可区分出两种 turnover 速率不同的微管群体。动态微管通过在生长期和缩短期之间切换来探索细胞环境，这一过程称为动态不稳定性5。与动态微管不同，稳定微管不进行显著生长，且其半衰期长于动态微管6。

数十年来的细胞生物学研究提供了多种复杂的工具，用于研究微管（MT）的结构与功能，从而积累了大量关于这些细胞骨架组分的知识。例如，微管在细胞极性的建立与维持中发挥着核心作用，这不仅归因于其内在的极性，还与稳定型和动态型微管在亚细胞区域的差异性分布密切相关7,8。相比之下，人们对更复杂的三维（3-D）环境中微管的结构与功能了解甚少，例如在脊椎动物胚胎中，部分原因在于高分辨率成像微管细胞骨架的技术挑战。尽管存在这一限制，近年来开发的表达绿色荧光蛋白（GFP）的转基因品系，或瞬时表达荧光标记的微管标记物，已显著增进了我们对微管动态变化及其在斑马鱼胚胎中细胞与发育功能的理解。在某些转基因品系中，可通过直接标记微管蛋白9，或利用微管相关蛋白Doublecortin-like-kinase（Dclk）或Ensconsin（EMTB）间接标记微管聚合物，从而实现对整个微管网络的成像10,11。此外，已有其他品系（和构建体）被开发出来，通过特异性地标记微管正端或中心体锚定的负端，用于评估微管的内在极性11,12,13,14。这些工具的优势在于能够研究活体发育生物中微管的动态过程。此类研究已揭示了特定细胞群体中微管的空间分布与动态特征、在形态发生过程中组织内有丝分裂纺锤体的方向（指示细胞分裂平面）、微管聚合物极性与细胞伸长和迁移等过程的关系，以及通过彗星运动速度测定的微管生长速率9,13,15。然而，这些工具的局限性在于难以有效区分稳定型与动态型微管群体。

本文基于丰富的细胞生物学文献，介绍了在斑马鱼胚胎中对稳定性和动态性微管（MTs）进行免疫标记成像的方法，这些方法可作为转基因品系应用的补充。由于固定过程中难以保持微管结构的完整性，此类免疫标记技术在斑马鱼研究中的广泛应用受到一定限制。方案1概述了一种优化后的免疫标记方法，可用于对发育中斑马鱼后脑横切面中的总微管、动态微管和稳定微管进行标记。此外，还描述了一种使用市售软件对这些微管群体进行定量分析的简便方法。稳定微管与动态微管可通过α-微管蛋白的多种翻译后修饰加以区分，例如乙酰化和去酪氨酸化，这些修饰会随着时间在稳定微管上累积16,17。在斑马鱼胚胎中，乙酰化主要出现在纤毛和轴突微管上，而不出现在稳定的间期微管上18，因此该标记物仅适用于部分稳定的微管。相比之下，去酪氨酸化似乎出现在斑马鱼胚胎中所有稳定微管上18。这种翻译后修饰暴露了α-微管蛋白羧基末端的谷氨酸残基（去酪氨酸化微管蛋白）18，可通过抗Glu-微管蛋白抗体进行检测19。尽管去酪氨酸化优先发生在稳定微管上，实验证据表明，这种翻译后修饰是微管稳定的结果，而非其成因16。另一类微管群体即动态微管，则可利用特异性识别酪氨酸化形式α-微管蛋白的抗体（抗Tyr-微管蛋白）加以区分19。在使用上述标记物完成免疫标记并进行共聚焦成像后，可在发育中神经管的特定区域内对微管进行定量分析（包括长度、数量和相对丰度）。本文提供了一种利用三维图像处理软件执行该分析的简化方法。该方法可用于研究形态发生过程以及细胞极性的建立或成熟过程20。事实上，稳定微管形成的极性阵列伴随多种发育事件的发生，包括感光细胞的形态发生21、发育中神经管内细胞的上皮化18以及轴突发育8。

方案2描述了一种细胞生物学检测方法的体内应用，用于分析微管（MTs）在组装阶段（成核/锚定及生长）的动态过程22,23。新生微管在中心体处成核，随后锚定于母中心粒的亚远端附属结构上23。本文介绍了一种在微管去聚合后分析其重新生长的方法。该方案详细说明了使用诺考达唑（nocodazole）处理以去聚合微管、药物洗脱步骤以及处理后的恢复期。根据方案1所述的一般操作流程，在洗脱后的不同时间点，通过免疫标记总微管标志物（抗β-微管蛋白抗体）、中心体标志物（抗γ-微管蛋白抗体）和细胞核标志物（4',6-二脒基-2-苯基吲哚，DAPI）来定期监测微管的重新生长情况。本方案中的微管去聚合步骤至关重要，因为它使得研究人员能够评估从头微管生长，而非已有微管的延伸。因此，该技术不同于其他已发表的测量微管生长速率的方法（即在未进行去聚合的情况下），后者通常使用如绿色荧光蛋白融合的末端结合蛋白3（EB3-GFP）等正端标记物，如Tran 等., 201211所示。此外，该检测方法特别适用于分析在从头微管组装过程中存在缺陷的胚胎，例如先前报道的NEDD1突变体，其特征是γ-微管蛋白向中心体的募集受损，导致神经管闭合不全及神经元发育异常24。

<table><tbody><tr><td>琼脂糖</td><td></td><td></td><td>用于处理培养皿。&amp;nbsp;&amp;nbsp; 制备1%琼脂糖&lt;br/&gt;：将每100 ml 1X胚胎培养基中加入1克琼脂糖，在微波炉中加热&lt;br/&gt;至完全聚合。&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Kpipes</td><td>Sigma</td><td>P7643</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Sigma</td><td>T3253-500G</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P9333-500G</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2&amp;middot;2H2O</td><td>Sigma</td><td>C5080</td><td></td></tr><tr><td>NP-40</td><td>American Bioanalyticals</td><td>AB01424</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma</td><td>E3889-25G</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma</td><td>M2670-500G</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白（BSA）</td><td>Fisher</td><td>BP1605</td><td></td></tr><tr><td>Triton-x</td><td>American Bioanalyticals</td><td>AB02025</td><td></td></tr><tr><td>抗荧光淬灭封片剂</td><td>Invitrogen</td><td>P10144</td><td></td></tr><tr><td>小鼠抗-&amp;beta;-微管蛋白抗体</td><td>发育研究杂交瘤库</td><td>E7</td><td>1/200</td></tr><tr><td>兔抗-&amp;gamma;-微管蛋白抗体</td><td>Genetex</td><td>GTX113286</td><td>1/500</td></tr><tr><td>兔抗-&amp;alpha;-微管蛋白抗体</td><td>Genetex</td><td>GTX108784</td><td>1/1000*</td></tr><tr><td>兔抗去酪氨酸化微管蛋白抗体</td><td>Millipore</td><td>AB3201</td><td>1/200-1/1000*&amp;nbsp; 首次使用新批次抗体时需进行滴定。</td></tr><tr><td>兔抗酪氨酸化微管蛋白抗体</td><td>Millipore</td><td>ABT171</td><td>1/500</td></tr><tr><td>小鼠抗中心粒蛋白抗体</td><td>Millipore</td><td>04-1624</td><td>1/1000</td></tr><tr><td>山羊抗兔IgG（488标记）</td><td>Thermofisher</td><td>A11008</td><td>1/500</td></tr><tr><td>山羊抗兔IgG（594标记）</td><td>Thermofisher</td><td>A11012</td><td>1/500</td></tr><tr><td>山羊抗小鼠IgG（594标记）</td><td>Thermofisher</td><td>A11005</td><td>1/500</td></tr><tr><td>山羊抗小鼠IgG（488标记）</td><td>Thermofisher</td><td>A11001</td><td>1/500</td></tr><tr><td>振动切片机</td><td>Vibratome</td><td>1500</td><td></td></tr><tr><td>镊子</td><td>World Precision Instruments</td><td>555227F</td><td></td></tr><tr><td>100 mm 培养皿</td><td>Cell treat</td><td>229693</td><td></td></tr><tr><td>35 mm 培养皿</td><td>Cell treat</td><td>229638</td><td></td></tr><tr><td>50 ml 离心管</td><td>Fisher</td><td>14-432-22</td><td></td></tr><tr><td>编织尼龙网（70 μm）</td><td>Amazon.com</td><td>B0043D1SZG&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>微量移液器</td><td>Gilson</td><td>F123602</td><td></td></tr><tr><td>玻璃移液管</td><td>Fisher</td><td>NC-999363-9</td><td></td></tr><tr><td>水族箱密封胶</td><td>Amazon.com，MarineLand品牌</td><td>硅酮密封剂 1盎司（管装）&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>铁架台</td><td>Fisher</td><td>14-675BO</td><td></td></tr><tr><td>微孔PTFE管，内径0.022英寸</td><td>Cole-Parmer</td><td>WU-06417-21</td><td></td></tr><tr><td>油泥</td><td>Amazon.com</td><td>Sargent Art 22-4000</td><td>任何无毒的蜡基或油基油泥均可使用</td></tr><tr><td>夹具</td><td>Fisher</td><td>02-215-466</td><td></td></tr><tr><td>60 ml 注射器</td><td>Fisher</td><td>14-820-11</td><td></td></tr><tr><td>胚胎培养基（E3）</td><td></td><td></td><td>34.8 g NaCl&lt;br/&gt; 1.6 g KCl&lt;br/&gt; 5.8 g CaCl2&amp;middot;2H2O&lt;br/&gt; 9.78 g MgCl2&amp;middot;6H2O&lt;br/&gt; &lt;br/&gt; 制备60X储备液：将上述成分溶于H2O中，定容至2 L，用NaOH调节pH至7.2，高压灭菌。制备1X工作液时，取16.5 mL 60X储备液稀释至1 L。&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>封闭液</td><td></td><td></td><td>50 ml TBS-NP-40&lt;br/&gt; 2.5 ml 正常山羊血清&lt;br/&gt; 1 g BSA&lt;br/&gt; 625 &amp;micro;l Triton-X</td></tr><tr><td>TBS-NP-40（pH 7.6）</td><td></td><td></td><td>155 mM NaCl&lt;br/&gt; 10 mM Tris HCl&lt;br/&gt; 0.1% NP-40</td></tr><tr><td>2x MAB（pH 6.4）</td><td></td><td></td><td>160 mM KPIPES&lt;br/&gt; 10 mM EGTA&lt;br/&gt; 2 mM MgCl2</td></tr><tr><td>商用三维图像处理软件</td><td>PerkinElmer</td><td>Volocity（V 6.2）</td><td></td></tr><tr><td>干式恒温仪&amp;nbsp;</td><td>VWR</td><td>12621-108</td><td>在方案1中用作加热板以融化琼脂糖。</td></tr><tr><td>体视显微镜</td><td>Leica</td><td>MZ12</td><td></td></tr><tr><td>共聚焦显微镜</td><td>Leica</td><td>SP5</td><td></td></tr><tr><td>平底包埋模具</td><td>emsdiasum.com</td><td>BEEM 70904-01</td><td></td></tr><tr><td>公共领域图像处理软件</td><td>NIH</td><td>ImageJ（V 1.5）</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">* 效果因批次不同而异</td></tr></tbody></table>

利用免疫标记分析斑马鱼胚胎中稳定的、动态的和新生的微管

Use of Immunolabeling to Analyze Stable, Dynamic, and Nascent Microtubules in the Zebrafish Embryo

微管（MTs）是动态且脆弱的结构，成像难度较大 体内，尤其是在脊椎动物胚胎中。本文描述了用于分析斑马鱼胚胎发育过程中神经管内不同微管（MTs）群体的免疫标记方法。尽管重点在于神经组织，但该方法也可广泛适用于其他组织。实验流程针对体节形成早期至中期（1个体节至12个体节）的胚胎进行了优化，但经过相对较小的调整后，也可适用于其他发育阶段。第一项方案提供了一种评估稳定性和动态性微管空间分布的方法，并利用图像处理软件对这些微管群体进行定量分析。该方法可作为现有实时成像技术的补充，后者依赖于转基因品系或标记构建体的瞬时表达来观察微管的动态变化和分布。尽管这些工具非常有用，但它们难以有效区分动态与稳定的微管。能够对这两类不同的微管群体进行成像与分析，对于理解细胞极化和形态发生背后的机制具有重要意义。第二项方案概述了一种专门用于分析新生微管的技术。该技术通过捕获新生微管的形成过程来实现 从头合成 药物诺考达唑处理导致微管解聚后，以及洗脱药物并经过恢复期后，微管随时间变化的生长特性。该技术尚未应用于斑马鱼胚胎中微管的研究，但是一种有价值的检测方法，可用于研究微管的 体内 参与微管组装的蛋白质功能。

利用免疫标记分析稳定和动态微管 
在方案1中，使用Glu-微管蛋白和Tyr-微管蛋白分别作为稳定和动态微管的标志物，揭示了神经管发育早期（神经脊阶段）和晚期（神经索阶段）微管亚群的分布情况。在神经脊阶段（4-5体节），后脑区域以动态微管为主（图2A-D）。随着神经脊发育为神经索（11-12体节），即上皮化增强阶段，使用抗Tyr-微管蛋白抗体进行免疫标记的微管数量在定性上减少（图2E-H），尤其是在神经索腹侧区域更为明显。相比之下，Glu-微管蛋白在神经脊中呈弥散和点状分布（图3A-D），但在神经索腹侧沿微管束路径富集（图3E-H</strong...

本文描述了用于分析斑马鱼发育中脑内不同微管群体的免疫标记方法，这些方法也可广泛适用于其他组织。第一个方案概述了一种优化的免疫标记稳定和动态微管的方法。第二个方案提供了一种特异性成像和定量新生微管的方法。

微管（MTs）是动态且脆弱的结构，在体内成像具有挑战性，尤其是在脊椎动物胚胎中。免疫标记方法……

这些标记方法的总体目标是在斑马鱼胚胎发育过程中对稳定、动态及新生的微管进行成像与定量分析。该方法有助于回答发育神经生物学领域中的关键问题，例如微管如何参与细胞极性的建立。该技术的主要优势在于能够优化对原位不同微管群体的检测与定量。通常，初次使用该方法的研究人员会因难以维持微管完整性而遇到困难。根据文本方案对不同发育阶段的斑马鱼胚胎进行脱氯处理后，将其转移至1.5毫升离心管中，并尽可能去除培养基。加入1毫升含4% PFA的微管组装缓冲液（MAB），在28.5°C条件下固定胚胎5分钟。然后使用移液器吸除固定液，并加入一毫升新鲜固定液。将样品在室温下置于摇床上孵育三小时。吸除固定液，加入一毫升 TBS NP-40 缓冲液。将胚胎置于摇床上轻轻振荡五分钟。重复洗涤再两次。然后，用一毫升新鲜 TBS NP-40 缓冲液替换原有缓冲液，将胚胎置于四摄氏度保存，保存时间不超过七天。根据文本方案去除卵黄并用琼脂糖包埋胚胎后，将盛有 TBS NP-40 的切片皿置于振动切片机中，对琼脂糖包埋的胚胎沿最长轴向切出 40 µm 厚的切片。用精细镊子将目标切片转移至 24 孔板中含 500 µL TBS NP-40 的孔内。吸除缓冲液，加入 500 µL 封闭液。然后在室温下轻轻振荡孵育切片至少一小时。将封闭液替换为300 µL用封闭缓冲液稀释的一抗溶液，并在4 °C下于摇床上孵育样品36至72小时。用600 µL TBS NP-40洗涤样品两次。将切片置于室温摇床上，每步操作30分钟。向切片中加入300 µL用封闭缓冲液稀释的荧光染料标记的二抗，于4 °C避光条件下在摇床上孵育16至24小时。随后按照上述方法清洗样本两次。接着，向胚胎中加入500微升DAPI溶液，在室温下孵育30分钟。然后用TBS NP-40在室温下洗涤样品三次，每次五分钟。洗涤后，取一滴含抗荧光淬灭剂的封片介质滴加于无尘载玻片中央。使用精细镊子将切片转移至封片剂液滴中，然后在样本上覆盖一张无尘盖玻片。将载玻片用铝箔包裹，置于干燥、避光且阴凉处保存，直至进行成像。 根据文本方案中所述的详细步骤，使用针对所选二抗荧光染料设置的通道参数采集z轴堆栈共聚焦图像，并保存图像文件。使用Image J等3D分析软件打开数据文件副本。通过选择图像、颜色、合并通道，叠加感兴趣的通道以生成合并图像。选择594纳米、488纳米和DAPI通道，分别伪染为红色、绿色和蓝色。勾选“创建复合图像”并确认。通过执行z轴层叠图像的最大强度投影（使用“图像”→“堆栈”→“z轴投影”），将合并的z轴层叠可视化为单个二维图像。输入内层最佳 z 平面的起始位置和结束位置，分别作为起始切片和终止切片。选择“最大强度”作为投影类型，然后单击确定。在 3D 分析软件中，选择“创建库”，并为图像库提供一个描述性名称。单击并创建，然后将原始图像文件拖动到库中。接着，选择一个文件进行分析。随后，在视图菜单中选择扩展焦面，以在主窗口中显示通道合并的图像。选择自由手绘 ROI 工具，勾画出待分析的兴趣区域。选择“操作”选项卡，然后选择“裁剪至选区”以裁剪图像。随后将裁剪后的图像文件另存为新名称。接下来，单击“测量”选项卡，以创建用于筛选与3D分析相关的特定对象的协议。然后将“查找对象”拖动至协议窗口，并将第一个协议重命名为DAPI。在下拉菜单中选择β-微管蛋白通道。然后将以下设置拖动到 β-tubulin 实验方案中，并按以下顺序放置在“识别对象”步骤下方：填充孔洞和对象、分离相接触的对象、按大小排除对象以及排除未接触 ROI 的对象。接着，在每个实验方案的底部选择“测量”。然后，对除 DAPI 外的所有通道，选择强度和体积测量，并对所有微管蛋白标记选择骨架长度。在待测区域周围绘制 ROI。在“摘要”选项卡下，观察软件处理区域后生成的测量结果。然后复制数据，并将其保存为可操作的电子表格，如图所示。要构建一个多孔流通装置，可使用夹具或带锯将一个50毫升离心管沿长度方向切成两半。从70微米尼龙筛网中裁剪出七个半径为3厘米的半圆形，并修剪至能紧密贴合在离心管一半的内壁中。使用水族箱专用安全硅胶密封剂，将半圆形部件平行粘合在离心管的10毫升刻度线处。待装置干燥两天后，将其浸泡在烧杯的水中两到三小时进行冲洗。在切割后的离心管顶部螺纹端涂抹一层油灰，使流过装置中保留的液面深度为四分之一英寸。通过从50毫升注射器中移除活塞，并将12英寸细管插入其尖端，来准备洗脱装置。将细管尽可能推入，并使用油灰密封接头处。用胚胎培养基预先润湿滤网，使液体能够流经整个流通装置。将装置倾斜置于冰上，使液体流入所有腔室，但仍从前端位于黏土边缘处排出。将冲洗装置悬挂在冰上流动装置上方的铁架台上。将200毫升胚胎培养基预冷于冰上，并倒入足够量至冲洗装置中，确保所有气泡排尽，且流速约为每分钟7毫升。通过调节注射器的高度来调整流速。按照文本方案完成胚胎脱氯和诺可唑（nocodazole）的配制后，取10毫升冰冷的诺可唑工作液，更换诺可唑处理组胚胎的培养液。将培养皿置于冰上，根据胚胎发育阶段放置适当时间。然后使用火焰抛光的1毫升玻璃移液管，将胚胎转移至流通装置中，每个实验组使用独立的隔室。通过将冰冻的胚胎培养基倒入50毫升注射器顶部，开始诺考达唑洗脱。在室温下洗脱20分钟后，使用火焰抛光的1毫升玻璃移液管将胚胎转移至含有温热胚胎培养基的玻璃培养皿中，以允许微管重新生长。胚胎转移后，立即启动计时器。最后，在1分钟、5分钟和10分钟时，通过移液将约10个胚胎加入含有1毫升4% PFA MAB固定液的1.5毫升离心管中，对对照组和洗脱组胚胎进行固定，固定方法如本视频前面所示。使用glu-tubulin和tyr-tubulin作为稳定和动态微管的标记物。在神经杀灭阶段，动态微管在后脑中占主导地位。随着杀灭过程发展为神经管，即上皮化增强阶段，定性观察显示，微管与抗 tyr-微管蛋白抗体的免疫反应性降低，尤其在腹侧神经管中更为明显。相比之下，glu-微管蛋白在整个神经杀灭区域呈弥散和点状分布，但在沿微管束道的腹侧神经管中富集。箭头指示微管束或微管结构中荧光标记增强的特定位置。经诺考达唑处理后，微管发生去聚合，导致标记呈弥散状分布。随着微管重新生长，其从中心体向外延伸。然而，由于微管的非平面运动轨迹，这一现象在单个平面上可能并不明显。尽管如此，一些图像分析软件能够进行三维长度测量，从而可在诺考达唑洗脱后评估微管的生长情况。在所分析的神经管所有区域中，微管的平均长度在诺考达唑洗脱后均随时间推移而增加。使用3D图像分析软件完成数据分析并进行质量控制后，可从原始数据中获取有用信息，例如总微管的平均长度、稳定微管的平均长度，以及稳定微管与总微管的比值。掌握该技术后，整个流程从开始到结束不超过一周时间。在操作过程中，需注意及时收集和处理样品，因为微管容易发生去聚合。该方法也可用于突变体的分析。观看本视频后，您应能够充分理解如何在完整胚胎中捕获不同的微管群体。

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发育生物学

利用 Immunolabeling 分析斑马鱼胚胎中的稳定、动态和初生的微管

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斑马鱼胚胎中单个神经元和神经嵴细胞的活体成像及肌动蛋白细胞骨架观察

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斑马鱼后脑中细胞的标记与成像

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活体斑马鱼胚胎中亚细胞结构的成像

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对整装斑马鱼胚胎纤毛器官中的磷酸化表位进行免疫染色

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分析 体内 利用细胞移植和延时成像技术研究斑马鱼胚胎中的细胞迁移

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活体斑马鱼胚胎中观察有丝分裂及其动态过程

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通过整体荧光标记联合方案可视化斑马鱼中的多纤毛细胞 原位 杂交与免疫荧光

本方案展示了在早期斑马鱼胚胎冷冻切片上进行连续免疫荧光和免疫组织化学染色的方法，从而实现对特定细胞群体中蛋白共定位的精确分析。...

石蜡切片斑马鱼胚胎的连续免疫荧光与免疫组织化学染色

本文介绍了一种利用荧光抗体在斑马鱼胚胎和幼鱼整体样本中检测蛋白质的实验方案。...

斑马鱼胚胎和幼鱼的整体免疫组织化学染色

我们展示了一种利用快速扫描共聚焦显微镜对发育中斑马鱼视顶盖内的小胶质细胞进行活体成像的方法，从而实现对这些细胞动态行为的分析 体内.

活体成像与斑马鱼胚胎小胶质细胞动态的表征

本文描述了一种在完整卵膜内利用光片显微镜对早期斑马鱼胚胎进行成像的样品制备策略。该方法分析了胚胎在原肠胚形成70%期和胚芽期时于卵膜内所采取的不同方位，并详细阐述了如何利用光片显微系统在整个胚胎范围内获得细胞尺度分辨率的成像策略。...

早期斑马鱼胚胎的光片显微成像与样品制备策略

学习免疫标记技术，用于分析斑马鱼胚胎中稳定、动态和初生微管。该方法可优化原位检测与定量，帮助研究发育神经生物学中的细胞极性建立机制。

利用免疫标记分析斑马鱼胚胎中稳定的、动态的和新生的微管

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