蛋白质晶体的微晶衍射分析 活细胞内 衍射

本实验方案的总体目标是介绍适用于微晶的X射线晶体学方法，特别是针对在细胞内产生的、被视为体内晶体的微晶。该方法的主要优势在于，它提供了一种简单且高效的微晶制备、检测与分析流程。本方法旨在通过利用在活细胞内生长的晶体，简化微晶的使用，从而避免复杂的纯化步骤以及Aprocox镇静试验。

在本视频中，我们将重点介绍在同步辐射光束线上进行X射线偏转实验的简单样品制备与操作方法。我们将展示与传统晶体学差异最大的实验步骤。在本演示中，我们将使用成功表达的多面体蛋白晶体，但该方法同样适用于在细菌、昆虫、哺乳动物或酵母细胞中形成的蛋白质晶体。

首先，在27摄氏度的旋转平台上，将30毫升过表达呼肠孤病毒多面体蛋白的Sf9细胞培养三天。使用无菌移液管，将500微升Sf9细胞培养物转移至微量离心管中，注意在II级生物安全柜中操作并遵循标准无菌技术，以确保主培养物的无菌状态。从微量离心管中吸取5微升细胞，滴加到玻璃载玻片上。

然后，将玻璃盖玻片的一边轻轻接触液滴，再缓缓倾斜盖下，使其平稳覆盖在液体上，避免产生气泡。接着，使用倒置显微镜观察载玻片。从200倍放大开始仔细检查细胞，当发现潜在晶体时，切换至最高放大倍数进行观察。

观察是否有锐利的边缘和折射率的变化。若发现晶体，需每天检查培养物，通过重复前述步骤监测晶体生长情况。对于Sf9细胞，将培养物转移至离心管中进行收获。

将试管置于冰上，并尽快进行下一步操作。为分离含晶体的细胞，用移液器将4毫升感染的Sf9细胞转移至适合流式细胞术分析的试管中。另准备第二支试管，加入来自模拟感染培养物的等量Sf9细胞作为对照。

接下来，在进行流式细胞术分析前，向两个样品中加入碘化丙啶，使其终浓度为每毫升1微克。然后，将对照样品细胞上样至标准流式细胞仪，根据前向散射光（FSC）和侧向散射光（SSC）进行细胞分选。分析至少20,000个事件。

在分析中剔除死细胞、细胞团块和碎片后，生成FSC与SSC图。随后，至少分析含有晶体的样品中的20,000个事件。将FSC与SSC图与对照组进行比较，观察是否出现对应于含晶体细胞的独特细胞群。

圈选含有晶体的细胞群体，该群体通常在较高的SSC或FSC信号中出现。根据此圈选条件，分选约150,000至200,000个含晶体的细胞进入已预装50微升PBS缓冲液的1.5毫升微量离心管中。按照先前所述方法，通过光学显微镜对分选后的样品进行成像，以确认与含晶体细胞相关的细胞群。

如果需要进行实验相位测定，此时可将细胞与重原子溶液共同孵育。该方法需根据文中及其他综述所述，对多种化合物及孵育时间进行筛选。首先将固定在针头上的微网附着于磁性操作棒末端，以准备样品装载所需的工具。

将探头侧向插入透析浮筒的凹槽中。然后用镊子夹取一条滤纸灯芯并固定。操作前务必再次检查装置是否安装完整。

现在，将细胞与等体积的0.4%台盼蓝溶液混合，使终浓度为0.2%。重悬细胞后，取0.5微升分选后的细胞滴加到微网栅上。待细胞沉降到微网栅表面后，用滤纸条吸去大部分多余液体。若微网栅未充分吸去多余液体，细胞将处于不同深度的液层中，这会增加在同步辐射光源处与X射线束对准的难度。

此外，过多的液体将增加背景X射线散射。如果对微网格过度吸液，液体将被完全去除，导致样品无法保留在网格孔洞中。经过最佳吸液处理后，微网格上仅保留一层薄液，既保护了样品，又使其被压入网格孔洞内。

某些晶体需要使用冷冻保护剂。本实验无需此步骤，但若需操作，其流程与加样后吸除多余液体相同。确保仅保留一层薄薄的液体即可。

立即将微网格在液氮中快速冷却，并转移至机器人载具中，以便运送到同步辐射微聚焦光束线。由于体内晶体尺寸较小，需在微聚焦晶体学光束线上收集衍射数据。首先，将微网格安装到测角仪上。

现在，通过正面和侧面方向将微网格与光路中心对齐。当微网格处于正面方向时，通过调整微网格其中一条水平通道的中心来精细校准对齐。在此水平通道上采集数据，仅需对对齐进行微小的重新调整。

在测试完一条泳道中的所有晶体后，继续进行下一条泳道，并重复对准步骤。务必明确标记已处理的泳道，以避免遗漏晶体或对同一晶体重复照射，可利用台盼蓝颜色变化作为参考依据。本文介绍了两种利用体内微晶进行结构测定的方法概述。

上排描述了从细胞中纯化晶体的经典方法，而下排展示了原位晶体学（in cellulo crystallography）方法，该方法在宿主细胞内直接对晶体进行数据收集。在原位晶体学方法中，将未感染细胞的流式细胞术图谱与含晶体细胞的图谱进行比较，以确定应选择哪一群细胞，从而将含晶体细胞与其他细胞分离开。在此示例中，含有多面体（polyhedra）的细胞比未感染细胞具有更高的侧向散射信号。

使用大多数同步辐射光束线配备的相机即可轻松观察经台盼蓝染色的细胞。尽管由于尺寸微小，纯化的晶体在识别和与X射线束对准时较为费时，但在数据采集过程中，最好采用网格模式进行，以尽量减少重复定位操作，避免对同一细胞或晶体进行多次照射，或遗漏细胞与晶体。一旦熟练掌握，从收获含晶体的细胞到完成数据采集，整个流程大约需要半天时间。

该实验步骤适用于重原子浸泡法进行实验性相位测定。以多面体为例，从蛋白质表达开始仅用八天便获得了常规结构。请务必注意，操作液氮可能存在极高危险性，必须采取预防措施以避免窒息和烧伤。