Name: 蛋白晶体的微结晶和在Cellulo衍射 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 35 s
Description: 学习利用活细胞培养蛋白微晶体的X射线晶体学方法，无需复杂纯化步骤即可进行同步辐射衍射实验。该技术适用于细菌、昆虫、哺乳动物和酵母等多种生物系统，为结构生物学研究提供简化流程。

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作者谨此感谢Chan-Sien Lay提供纯化微晶的照片，感谢Daniel Eriksson和Tom Caradoc-Davies在澳大利亚同步加速器MX2光束线提供的支持，以及感谢莫纳什大学FlowCore设施的Kathryn Flanagan和Andrew Fryga所给予的宝贵帮助。

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<li>Fan, G. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+calcineurin+crystals+formed+using+the+baculovirus+expression+system%5BTitle%5D)+AND+%22Micros+Res+Tech%22%5BJournal%5D)">In vivo calcineurin crystals formed using the baculovirus expression system.</a> Micros Res Tech. 34 (1), 77-86 (1996).</li>
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作者无任何利益冲突需要披露。

本方案提供了两种分析微晶的方法，旨在促进对过去可能被忽略的极小晶体的分析。
微晶纯化的关键步骤 
本方案已通过以下方式优化： Bombyx mori 以在Sf9细胞中表达的CPV1多面体蛋白作为模型系统。然而， 体内 微晶在机械强度方面表现出极大的差异性。例如，在昆虫细胞中生长的组织蛋白酶B针状晶体具有较高的刚性和机械稳定性，可采用与本文所述相似的纯化方案进行纯化。 14另一方面，萤火虫荧光素酶晶体也在培养的昆虫细胞中生长，且具有类似的针状形态，但在细胞裂解后会立即溶解 38因此，提取与纯化的方案 体内 晶体的培养需要根据具体情况，通过试错法进行调整，具体步骤如1.3、2a.3-4、2b.4、3.1.3-4和3.2a.5所述。
对于脆弱的晶体，可通过低速离心实现（部分）与细胞碎片的分离即 200 × g）或在管底添加蔗...

在过去二十年中，X射线晶体学在解析生物大分子高分辨率结构方面的应用稳步发展。非专业研究人员日益广泛地采用X射线晶体学，体现了该方法在生命科学多个领域中的普及化1。
传统上，尺寸小于约10 µm的晶体被认为难以处理，甚至无法用于结构测定。随着全球同步辐射光源上专用微聚焦光束线的日益普及，以及微晶操作工具等技术的进步，X射线微晶衍射技术广泛应用所面临的诸多障碍已大幅消除。在串行X射线微晶衍射2,3和微电子衍射4方面的进展表明，使用微晶和纳米晶进行结构测定不仅可行，有时甚至优于使用大尺寸晶体5,6,7。
这些技术进步最初被应用于肽类8以及昆虫病毒产生的天然晶体的研究9,10。如今，它们已被用于研究多种生物大分子，包括最具挑战性的体系，如膜蛋白和大型复合物11。为了便于对这些微晶进行分析，研究人员已在介观相（in meso）条件下对其进行分析，特别是针对膜蛋白12，以及在微流控芯片中进行分析13。
这些新型微晶衍射方法的出现，使得利用体内结晶作为结构生物学的一条新途径成为可能14,15,16，为传统的体外晶体生成提供了替代方案。然而，即使能够在体内形成晶体，仍存在若干障碍，例如在从细胞中纯化过程中配体的降解或丢失、在同步辐射光束线上对晶体进行操作和观察的困难，以及繁琐的X射线衍射实验。作为替代方案，晶体也可在细胞内直接分析，无需任何纯化步骤17,18,19。比较分析表明，此类在细胞内的方法可能比纯化晶体的分析更为高效，并能获得更高分辨率的数据20。
本方案旨在帮助初次接触蛋白质微晶晶体学的研究人员。文中提供了在同步辐射光束线上进行X射线衍射实验的样品制备与操作方法。提出了两种选择：一种是使用分离的晶体进行传统的微晶晶体学研究，另一种是使用流式细胞术分选的含晶体细胞进行in cellulo分析（图1）。

<table><tbody><tr><td>Sf9细胞</td><td>Life Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SF900-SFM昆虫细胞培养基</td><td>Life Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 L细胞培养瓶</td><td>Thermofisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>用于昆虫细胞培养的摇床培养箱</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 mL锥形管</td><td>Falcon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>配有50 mL管摆动转子的离心机</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>配备19 mm探头的超声破碎仪</td><td>MSE Soniprep 150&amp;nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>玻璃载玻片</td><td>Hampton Research</td><td></td><td></td></tr><tr><td>血细胞计数板</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>碘化丙啶</td><td>Thermofisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD Influx细胞分选仪&amp;nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hampton重金属筛选试剂盒</td><td>Hampton Research</td><td></td><td></td></tr><tr><td>微量离心机</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>微网（Micromesh）</td><td>Mitigen</td><td></td><td>700/25目微网提供更大的表面积。可购买带索引的微网用于系统性研究。</td></tr><tr><td>滤纸引线（Paper wick）</td><td>Mitigen</td><td></td><td>可根据晶体性质和所用冷冻保护剂的不同，调整滤纸引线的尺寸以实现最佳流动效果。</td></tr><tr><td>乙二醇</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>台盼蓝</td><td>Life Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MX2微聚焦光束线</td><td>澳大利亚同步辐射中心（Australian Synchrotron）</td><td></td><td>有关可用微聚焦光束线的列表，请参见Boudes &lt;em&gt;et al.&lt;/em&gt; (2014) &lt;em&gt;Reflections on the Many Facets of Protein&lt;br/&gt; Microcrystallography.&lt;/em&gt; Australian Journal of Chemistry 67 (12), 1793&amp;ndash;1806,&lt;br/&gt; doi:10.1071/CH14455。</td></tr></tbody></table>

蛋白质晶体的微晶衍射分析 活细胞内 衍射

Microcrystallography of Protein Crystals and In Cellulo Diffraction

许多同步辐射装置上高质量微聚焦光束线的出现，使得常规分析最大尺寸小于10 µm的晶体成为可能，而这类晶体过去曾带来巨大挑战。本文介绍了两种通过X射线晶体学进行蛋白质微晶结构解析的替代性实验流程，特别聚焦于在活体（in vivo）条件下生长的晶体。微晶可通过超声破碎从细胞中提取，并利用差速离心法进行纯化；或者在通过流式细胞术分选含晶体的细胞后，直接在细胞内（in cellulo）进行分析。可选地，可将纯化的晶体或含晶体的细胞浸泡于重原子溶液中，以进行实验相位测定。随后，这些样品均以类似方式制备用于衍射实验：将其点样至微网支撑膜上，并在液氮中快速冷冻。我们简要描述并比较了使用微聚焦同步辐射光束线对分离的微晶和含晶体的细胞进行的序列衍射实验，以获得适用于相位确定、模型构建和精修的数据集。
本流程以家蚕质型多角体病毒1型（Bombyx mori cypovirus 1, BmCPV1）多角体蛋白晶体为例，该蛋白通过重组杆状病毒感染昆虫细胞后表达获得。在此案例中，细胞内（in cellulo）分析比纯化晶体的分析更为高效，从表达到结构精修可在约8天内完成。

使用替代方法进行结构测定的概述 体内 微晶的制备方法被介绍（图1）。多面体可通过超声处理和离心轻松纯化。由于其密度较高，多面体会在离心管底部形成一层，其上覆盖一层碎片，可通过移液去除该碎片层（图3a 和 3b）。然后对样品进行多轮超声处理和洗涤，直至达到足够的纯度，这一标准通过观察沉淀物呈现的白色 chalky 外观来判断（图3c).
对于 in cellulo 方法，将非感染细胞的流式细胞术图谱与含晶体细胞的图谱进行比较，以确定应选择哪一群细胞，从而将含晶体细胞与其他细胞分选开来（图4）。在此示例中，含有多面体晶体的细胞比非感染细胞具有更高的侧向...

介绍了一种利用蛋白质微晶进行X射线晶体学的实验方案。两个分析实例 体内纯化后生长的微晶 在细胞内 进行比较。

许多同步辐射装置中高质量微聚焦光束线的出现，使得常规分析尺寸小于10 µm的晶体成为可能……

本实验方案的总体目标是介绍适用于微晶的X射线晶体学方法，特别是针对在细胞内产生的、被视为体内晶体的微晶。该方法的主要优势在于，它提供了一种简单且高效的微晶制备、检测与分析流程。本方法旨在通过利用在活细胞内生长的晶体，简化微晶的使用，从而避免复杂的纯化步骤以及Aprocox镇静试验。在本视频中，我们将重点介绍在同步辐射光束线上进行X射线偏转实验的简单样品制备与操作方法。我们将展示与传统晶体学差异最大的实验步骤。在本演示中，我们将使用成功表达的多面体蛋白晶体，但该方法同样适用于在细菌、昆虫、哺乳动物或酵母细胞中形成的蛋白质晶体。首先，在27摄氏度的旋转平台上，将30毫升过表达呼肠孤病毒多面体蛋白的Sf9细胞培养三天。使用无菌移液管，将500微升Sf9细胞培养物转移至微量离心管中，注意在II级生物安全柜中操作并遵循标准无菌技术，以确保主培养物的无菌状态。从微量离心管中吸取5微升细胞，滴加到玻璃载玻片上。然后，将玻璃盖玻片的一边轻轻接触液滴，再缓缓倾斜盖下，使其平稳覆盖在液体上，避免产生气泡。接着，使用倒置显微镜观察载玻片。从200倍放大开始仔细检查细胞，当发现潜在晶体时，切换至最高放大倍数进行观察。观察是否有锐利的边缘和折射率的变化。若发现晶体，需每天检查培养物，通过重复前述步骤监测晶体生长情况。对于Sf9细胞，将培养物转移至离心管中进行收获。将试管置于冰上，并尽快进行下一步操作。为分离含晶体的细胞，用移液器将4毫升感染的Sf9细胞转移至适合流式细胞术分析的试管中。另准备第二支试管，加入来自模拟感染培养物的等量Sf9细胞作为对照。接下来，在进行流式细胞术分析前，向两个样品中加入碘化丙啶，使其终浓度为每毫升1微克。然后，将对照样品细胞上样至标准流式细胞仪，根据前向散射光（FSC）和侧向散射光（SSC）进行细胞分选。分析至少20,000个事件。在分析中剔除死细胞、细胞团块和碎片后，生成FSC与SSC图。随后，至少分析含有晶体的样品中的20,000个事件。将FSC与SSC图与对照组进行比较，观察是否出现对应于含晶体细胞的独特细胞群。圈选含有晶体的细胞群体，该群体通常在较高的SSC或FSC信号中出现。根据此圈选条件，分选约150,000至200,000个含晶体的细胞进入已预装50微升PBS缓冲液的1.5毫升微量离心管中。按照先前所述方法，通过光学显微镜对分选后的样品进行成像，以确认与含晶体细胞相关的细胞群。如果需要进行实验相位测定，此时可将细胞与重原子溶液共同孵育。该方法需根据文中及其他综述所述，对多种化合物及孵育时间进行筛选。首先将固定在针头上的微网附着于磁性操作棒末端，以准备样品装载所需的工具。将探头侧向插入透析浮筒的凹槽中。然后用镊子夹取一条滤纸灯芯并固定。操作前务必再次检查装置是否安装完整。现在，将细胞与等体积的0.4%台盼蓝溶液混合，使终浓度为0.2%。重悬细胞后，取0.5微升分选后的细胞滴加到微网栅上。待细胞沉降到微网栅表面后，用滤纸条吸去大部分多余液体。若微网栅未充分吸去多余液体，细胞将处于不同深度的液层中，这会增加在同步辐射光源处与X射线束对准的难度。此外，过多的液体将增加背景X射线散射。如果对微网格过度吸液，液体将被完全去除，导致样品无法保留在网格孔洞中。经过最佳吸液处理后，微网格上仅保留一层薄液，既保护了样品，又使其被压入网格孔洞内。某些晶体需要使用冷冻保护剂。本实验无需此步骤，但若需操作，其流程与加样后吸除多余液体相同。确保仅保留一层薄薄的液体即可。立即将微网格在液氮中快速冷却，并转移至机器人载具中，以便运送到同步辐射微聚焦光束线。由于体内晶体尺寸较小，需在微聚焦晶体学光束线上收集衍射数据。首先，将微网格安装到测角仪上。现在，通过正面和侧面方向将微网格与光路中心对齐。当微网格处于正面方向时，通过调整微网格其中一条水平通道的中心来精细校准对齐。在此水平通道上采集数据，仅需对对齐进行微小的重新调整。在测试完一条泳道中的所有晶体后，继续进行下一条泳道，并重复对准步骤。务必明确标记已处理的泳道，以避免遗漏晶体或对同一晶体重复照射，可利用台盼蓝颜色变化作为参考依据。本文介绍了两种利用体内微晶进行结构测定的方法概述。上排描述了从细胞中纯化晶体的经典方法，而下排展示了原位晶体学（in cellulo crystallography）方法，该方法在宿主细胞内直接对晶体进行数据收集。在原位晶体学方法中，将未感染细胞的流式细胞术图谱与含晶体细胞的图谱进行比较，以确定应选择哪一群细胞，从而将含晶体细胞与其他细胞分离开。在此示例中，含有多面体（polyhedra）的细胞比未感染细胞具有更高的侧向散射信号。使用大多数同步辐射光束线配备的相机即可轻松观察经台盼蓝染色的细胞。尽管由于尺寸微小，纯化的晶体在识别和与X射线束对准时较为费时，但在数据采集过程中，最好采用网格模式进行，以尽量减少重复定位操作，避免对同一细胞或晶体进行多次照射，或遗漏细胞与晶体。一旦熟练掌握，从收获含晶体的细胞到完成数据采集，整个流程大约需要半天时间。该实验步骤适用于重原子浸泡法进行实验性相位测定。以多面体为例，从蛋白质表达开始仅用八天便获得了常规结构。请务必注意，操作液氮可能存在极高危险性，必须采取预防措施以避免窒息和烧伤。

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