骨髓衍生祖细胞的低氧预处理作为成熟雪旺细胞产生的来源

这种细胞培养技术的总体目标是富集骨髓神经祖细胞，以促进它们分化为功能性雪旺细胞。该方法解决了干细胞和再生医学中的一个关键问题：如何使用有限的神经祖细胞来源来产生神经胶质细胞，以协助创伤后轴突再生和髓鞘再生。该技术的一个优点是使用高效的培养调节来促进神经细胞从骨髓基质细胞扩增，用于自体细胞治疗。

培养两天后，去除 75% 的用过的培养基和非贴壁细胞，并用 3 次 10 毫米 PBS 洗涤液冲洗贴壁细胞。第三次洗涤后，用 10 毫升骨髓造口细胞或 MSC 生长培养基替换 PBS，并将培养物放回培养箱中。可见的菌落应在第 6 至 7 天出现。

第 10 天，在新鲜 PBS 中洗涤培养物，并用 1.5 mL 重组酶促细胞解离试剂分离细胞。在 37 摄氏度下 5 分钟后，加入 3 毫升 MSC 生长培养基以中和反应，并通过离心收集分离的细胞。将沉淀重悬于 5 毫升新鲜 MSC 生长培养基中，并以每平方厘米 4 倍 10 至 4 个细胞的密度接种在新的 10 厘米组织培养板中。

细胞应在传代后 2 天内达到 80% 至 90% 的汇合度。对于缺氧预处理，首先松开环夹并用 70% 乙醇清洁暴露的部分。进一步将缺氧室拆解成组件，放入层流罩中，在紫外线下消毒 15 分钟。

接下来，如前所述，用 10 毫升 PBS 洗涤 80% 至 90% 汇合的 MSC 培养物，并用补充有 25 毫摩尔 hepes 的新鲜 MSC 生长培养基处理培养物。将处理过的培养物放入重新组装的缺氧室中，并拧紧环夹。密封腔室的连接端以确保没有气体泄漏，并以每分钟 10 升的流速将 99% 氮气和 1% 氧气的气体混合物冲洗到腔室中。

5 分钟后，将腔室放入细胞培养箱中 16 小时。第二天早上，如刚才所示分离细胞并通过离心收集它们。将沉淀重悬于神经祖细胞培养基中，并将 6 次 10 次接种到每平方厘米的第三个细胞上，接种到低附着 6 孔板上，在 37 摄氏度和 5% CO 2 下培养 12 天。

应在第 6 至 7 天观察到相当大的非粘附细胞球体。到第 10 至 12 天，缺氧条件培养物中的神经球明显多于常氧培养物中的神经球。第 12 天，使用 10 毫升移液管将神经球转移到 15 毫升锥形管中，并通过离心收集神经球。

将球体重悬于 DMEM/F12 中，并将每平方厘米 5 至 10 个神经球接种在每孔 1.5 毫升神经胶质诱导培养基中的聚-D-赖氨酸层粘连蛋白包被的 6 孔板上。将球形细胞培养物保持至少 7 天，每三天刷新一次培养基。为了收获背根神经节，将第一个胚胎转移到含有室温 PBS 的 10 厘米培养皿中，在解剖显微镜下以俯卧位，并沿脊髓的两侧插入显微解剖钳。

使用钝性解剖，使用镊子将脊髓与周围的软组织分开，沿颈部开口和尾部存根切除脊髓。从释放的脊髓中去除残留的软组织，直到只剩下脊髓、神经根和附着的背根神经节。将单个背根神经节与其连接的神经根分离。

然后，使用配备有 1 毫升移液管尖端的移液管笔将多达 100 个背根神经节转移到 1.5 毫升微量离心管的 PBS 中。通过离心收集神经节，并将沉淀重悬于每管 200 微升重组酶细胞解离试剂中。在 37 摄氏度下 10 分钟后，使用 200 微升移液管吸头再次离心背根神经节，以轻轻研磨背根神经节神经元维持培养基中的沉淀。

将背根神经节细胞以每平方厘米 5 乘以 10 至第三个细胞接种到聚-D-赖氨酸层粘连蛋白包被的 6 孔板上，每孔 1.5 毫升背根神经节神经元维持培养基。在 37 摄氏度和 5% CO 2 下培养两天后，洗涤细胞并将神经元细胞培养物放回新鲜背根神经节神经元纯化培养基中的培养箱中再培养两天。经过 3 到 4 个维持和纯化周期后，背根神经节细胞培养物的神经元标志物 Tuj-1 检测呈阳性，神经胶质细胞标志物 S100 β 检测呈阴性。

在雪旺细胞样细胞培养物的第 7 天，在 PBS 中冲洗细胞，然后在 37 摄氏度下用每孔 0.5 mL 重组酶细胞解离试剂解离 5 分钟。将细胞沉淀重悬于共培养基中，并将雪旺细胞样细胞以每平方厘米 10 至第三细胞的一次乘以 10 至第三细胞的速度接种到纯化的背根神经节神经元培养物上，在 37 摄氏度和 5% CO 2 下共培养 14 天。健康的 MSC 表现出锥形形态，而 MSC 的四边形外观已维持大量传代并已失去其多能性。

扩增的 MSC 集落应显示 MSC 标志物的表达、造血干细胞标志物的缺失以及分化为脂肪生成、成骨和软骨形成谱系的能力。经过低氧预处理的健康 MSC 培养物显示神经球的数量和大小都更大。背根神经节神经元网络的纯度可以通过神经元标志物 Tuj-1 的表达和伴随的雪旺细胞标志物 S100 的缺失来确认。

与背根神经节神经元共培养 14 天后，雪旺细胞样细胞获得成熟命运定型雪旺细胞的特征和功能特性。一旦掌握，如果细胞扩增技术执行得当，神经祖细胞亚群可以在 10 天内在人或大鼠 BMSC 中扩增。在尝试此程序时，请务必记住确认 BMSC 样本中含有巢蛋白阳性神经祖细胞，并且 CD45 阳性造血祖细胞均已被去除。

观看此视频后，您应该对如何获取 BMSC、富集神经祖细胞亚群以及将神经祖细胞分化为命运决定的雪旺细胞以用于增强创伤后轴突再生和髓鞘再生有很好的了解。在此程序之后，可以衍生出髓鞘神经胶质细胞，例如成熟的雪旺细胞，用于开发用于外周和中枢神经系统脱髓鞘损伤和疾病的疗法。