Name: 新型乳腺脂肪移植技术可视化血管内皮干细胞的血管生成 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 41 s
Description: 了解乳腺脂肪垫移植技术用于评估血管内皮干细胞的血管生成潜能。该方法结合全组织包埋制备与显微观察，为研究血管生物学和再生医学提供了重要的体内功能评价工具。

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本工作得到国家自然科学基金（项目编号：31530045 和 31371500，资助 Y.A.Z.；项目编号：31401245，资助 Q.C.Y.）、中国科学技术部（项目编号：2014CB964800）、中国科学院（项目编号：XDB19000000，资助 Y.A.Z.）以及中国细胞生物学学会（青年学者早期职业奖学金，资助 Q.C.Y.）的支持。

实验方案已获得中国科学院上海生物化学与细胞生物学研究所动物护理与使用委员会的批准，批准协议编号为 SIBCB-NAF-15-002-S335-003。
1. 从小鼠乳腺中分离血管内皮干细胞
<ol>
	<li>乳腺组织的收获与消化
	<ol>
		<li>使用8周龄的Actin-GFP成熟未交配报告基因小鼠作为组织供体，其体重范围为20至25 g。 
		注：来源于供体的细胞可通过GFP表达轻松追踪。</li>
		<li>配制组织消化基础培养基：在RPMI1640培养基中加入5%胎牛血清（FBS）、1%青霉素-链霉素（pen/strep）和25 mM HEPES。将混合液经0.22 µm滤膜过滤以灭菌，并在水浴中预热至37 °C。</li>
		<li>将小鼠置于CO2麻醉舱中处死。使用手术刀（或手术剪）在下腹部中线处做垂直皮肤切口，用镊子将皮肤轻轻向一侧剥离，暴露腹股沟乳腺组织。取出双侧第四对腹股沟乳腺，并在6 cm培养皿中用剪刀将其剪成细小碎片。
		<ol>
			<li>称量剪碎后的组织总重量，并将其转移至50 mL离心管中。 
			注：确保每块组织碎块小于1 mm3。通常每只小鼠可获得约5,000个VESCs。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>在50 mL带盖离心管中，按每克组织碎块加入10 mL消化基础培养基的比例准备培养基。每10 mL消化基础培养基中加入300单位的III型胶原酶，配制成消化缓冲液。混匀后加入组织碎块中。</li>
		<li>将50 mL离心管水平放置于摇床上，设定转速为100 rpm，温度为37 °C，持续振荡消化乳腺组织2小时。每隔20分钟检查并手动震荡离心管，以确保充分消化。 
		注：FACS前进行组织消化的目的是将实体组织制备为单细胞悬液。因此，消化结束后应得到无可见组织块的浓稠液体。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>单细胞悬液的制备
	<ol>
		<li>消化完成后，向50 mL离心管中加入预热的无菌PBS至满，倒置混匀。以200 × g离心5分钟，获得细胞沉淀。</li>
		<li>弃去上清液，轻弹管底使细胞沉淀松散。加入3 mL红细胞裂解缓冲液（见材料表），在室温（RT）的组织培养超净台中孵育5分钟，以去除红细胞。</li>
		<li>加入10 mL无菌PBS，倒置混匀。以200 × g离心5分钟，弃去上清液。加入3 mL预热的0.05%胰蛋白酶，于37 °C孵育5分钟，进一步消化残留组织。</li>
		<li>加入3 mL预热的IMDM培养基，再加入100 µL DNase I溶液（将0.25 mg DNase I溶于1 mL PBS中）。将离心管置于37 °C以降解DNA丝状物。将组织混合物通过70 µm细胞筛网，获得细胞悬液。用2 mL PBS + 5% FBS冲洗筛网两次，以中和酶消化作用。</li>
		<li>将细胞混合物以200 × g离心5分钟，使细胞沉淀。弃去上清液，将细胞沉淀重悬于1 mL PBS + 5% FBS中，用于抗体染色。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>基于FACS的Procr+ VESC分离
	<ol>
		<li>对来自供体乳腺组织的细胞混合物进行抗体染色，操作遵循已发表的标准流程8。 
		注：所用抗体如下：抗小鼠血液谱系-FITC、抗小鼠CD31（PECAM1）-PECY7、抗小鼠CD105-APC（均以1 µg/mL浓度使用）、抗小鼠CD201（Procr）-生物素（以2.5 µg/mL浓度使用）以及链霉亲和素-v450（以0.5 µg/mL浓度使用）。
		<ol>
			<li>抗体染色完成后，用PBS + 5% FBS补满细胞悬液，以200 × g离心5分钟。弃去上清液，将细胞重悬于1 mL PBS + 5% FBS中。经40 µm细胞筛网过滤后，置于冰上待FACS分选。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>进行基于FACS的分选，以分离Procr+ VESCs。
		<ol>
			<li>分析未染色样本及各单色对照，确定每种荧光信号的电压设置。计算补偿参数，以消除自发荧光或背景染色干扰。建立合适的设门与分选模板，用于目标细胞群的分选。</li>
			<li>为建立FACS分选层级，首先排除所有事件中的碎片，然后通过宽度信号排除双联体或粘连细胞团。设门排除血液谱系阳性细胞，再利用CD31+和CD105+定义内皮细胞群体。 
			注：Procr+细胞通过与FMO对照比较，从CD31+ CD105+内皮细胞中分离获得。代表性FACS分析图见图1。FACS分选出的VESC群体应悬浮于IMDM + 50% FBS中，并置于冰上，待后续处理。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 体内 使用乳腺脂肪垫的VESC血管形成实验
<ol>
	<li>准备用于移植的原代内皮细胞（ECs）。
	<ol>
		<li>用10 mL PBS + 5% FBS重悬FACS分选的细胞，然后在200 × g下离心5分钟，使细胞沉淀至管底。</li>
		<li>小心吸弃上清液，使用血细胞计数板计数细胞数量，并用基底膜基质混合液（由50%基底膜基质、含20% FBS的PBS以及添加100 ng/mL rmVEGF和60 U/mL肝素组成）重悬细胞沉淀，调整至工作浓度为15,000个细胞/15 µL。 
		注意：基底膜基质混合液应始终置于冰上保存。</li>
		<li>将分选并计数后的细胞在1.5 mL微量离心管中进行系列稀释，以达到所需的输入浓度，确保最终注射体积总计不超过15 µL。向每管中加入0.1%台盼蓝以便在移植过程中更清晰地观察内容物。充分吹打混匀。将离心管置于冰上保存直至使用。 
		注意：成功形成血管至少需要100个VESCs。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将原代内皮细胞移植至乳腺脂肪垫。
	<ol>
		<li>对手术器械和操作台面进行消毒。若在同一台手术中对多只动物使用相同器械，可使用玻璃珠灭菌器进行消毒。</li>
		<li>根据所在机构兽医及实验动物护理与使用委员会（IACUC）推荐的麻醉方案，对3周龄BALB/c裸鼠实施麻醉。将每只小鼠仰卧位放置于手术台上，背部贴合台面，并用胶带固定四肢。</li>
		<li>将棉签浸入含碘消毒液中，彻底擦拭小鼠整个腹部区域，以在手术前对皮肤表面进行灭菌。</li>
		<li>用镊子夹起并提起小鼠腹部皮肤，使用手术刀做一约1 cm长的垂直小切口。再分别向两侧后肢方向各做一条长约0.5–1 cm的切口，形成倒Y形切口。
		<ol>
			<li>使用镊子和棉签轻轻分离皮肤与腹壁组织，并将皮肤向两侧固定，以暴露腹股沟乳腺组织。将小鼠置于体视显微镜下，调节放大倍数至2.0倍，并调整焦距，确保乳腺脂肪垫清晰可见且便于操作。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>将27G 1/2&#34;针头置于冰上预冷。提前用基底膜基质混合液预润1 mL注射器，以排除针头连接部位可能存在的气泡。吸取15 µL混合液滴加至微量离心管管盖上，然后将全部液体吸入已预润的注射器中。</li>
		<li>用精细镊子夹住位于腹股沟淋巴结前方的乳腺脂肪垫，并轻轻提起以便注射。将注射器针头约1/4长度轻柔插入脂肪垫内。
		<ol>
			<li>松开夹持脂肪垫的镊子，改用镊子夹住并稳定注射器针头。缓慢注射溶液，防止液体外漏。注射后停留数秒，确保细胞混合物凝固，以最大程度减少拔针时的泄漏。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>使用可吸收缝线关闭皮肤切口。&#160;采用5-0规格的非反应性单股缝线&#160;进行缝合，打外科结，每个结间距约0.3 cm。也可选择使用皮肤缝合钉关闭切口。</li>
		<li>将术后小鼠放入单独的笼盒中恢复。在笼盒上方放置加热灯，防止麻醉后小鼠发生低体温。在笼底铺设柔软纸巾和棉花，以维持小鼠术后体温。
		<ol>
			<li>密切观察小鼠，直至所有受体动物完全清醒。术后数天内，根据设施兽医指导或常规方案，预先给予所有动物术后镇痛药物。如出现伤口感染，按批准的动物实验方案使用抗生素。若手术切口使用缝合钉闭合，应在术后10天、伤口完全愈合后拆除缝合钉。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 显微观察用组织整体装片制备
<ol>
	<li>组织收获
	<ol>
		<li>在移植后 2 - 4 周，按照步骤 2.2.2 的方法，通过腹腔注射 2.5% 麻醉剂（剂量为每 20 g 体重 0.12 mL）对受体 BALB/c 裸鼠进行麻醉。 
		注意：细胞移植后 2 - 4 周可检测到血管的阳性生长。</li>
		<li>通过尾静脉注射 isolectin-647 染料标记受体的全身循环系统，剂量为每 25 g 体重 50 µg，用 50 µL 无菌 PBS 重悬。静置 5 - 10 分钟后，使用 CO2 处死小鼠。</li>
		<li>根据步骤 2.2.4，解剖出最初注射细胞的乳腺组织区域，使用手术剪分离组织。在 6 cm 培养皿中用手术刀片将组织切成约 3 至 4 mm3 的小块。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>组织消化及抗体染色前处理
	<ol>
		<li>将组织块放入含有 10 mL 预热消化基础培养基（步骤 1.1.2）的 15 mL 离心管中，加入胶原酶 III（每 10 mL 培养基含 300 U），进行组织消化。</li>
		<li>将 15 mL 离心管水平放置于摇床上，设置转速为 100 rpm，温度为 37 °C，持续约 1 小时，以松散组织结构并去除多余的脂肪组织。 
		注意：脂肪细胞易产生自发荧光，可能导致荧光背景噪声。消化完成后，组织块应呈现柔软、浑浊的外观。最佳消化时间取决于切碎组织块的大小，应据此适当调整以获得最佳结果。由于组织血管已用荧光标记的 Isolectin 标记，后续所有操作均需避光进行。</li>
		<li>在室温下用 PBS 清洗组织块 10 分钟。将组织块小心转移至半满 4% 多聚甲醛（PFA，pH 7.2 - 7.4）的 6 cm 培养皿中，进行整体组织固定以保存荧光信号。将培养皿置于摇床上，在室温下轻柔振荡 30 分钟。 
		注意：PFA 为致癌物，操作时应谨慎。</li>
		<li>去除残留的 PFA，并用整体组织洗涤缓冲液（PBS 中含 0.1% tween）清洗固定组织三次，每次间隔 10 分钟。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>整体组织抗体染色
	<ol>
		<li>在 2 mL 离心管中用抗体染色缓冲液稀释一抗。将组织与一抗在 4 °C 下孵育过夜。 
		注意：使用大鼠抗 CD31 抗体（浓度：10 µg/mL）或大鼠抗 VE-Cadherin 抗体（CD144/Cdh5；浓度：2.5 µg/mL）作为一抗。CD31 和 VE-Cadherin 均为内皮细胞表面标志物。5x 抗体染色缓冲液的配制成分为：500 mM 马来酸（pH 7.5）、750 mM NaCl 和 0.5%（v/v）tween 溶于 PBS 中。配制新鲜的 1x 工作液时，仅加入适量血清（5%）9。</li>
		<li>去除抗体染色缓冲液，用洗涤缓冲液清洗整体组织三次，每次间隔 10 分钟。将组织在摇床上于室温下与二抗（见材料表）及 DAPI 共孵育 4 小时，或在 4 °C 下孵育过夜。 
		注意：使用 DAPI（4',6-二脒基-2-苯基吲哚）终浓度为 5 µg/mL 以显示细胞核。</li>
		<li>用洗涤缓冲液清洗整体组织三次，每次 10 分钟。将组织块在 80% 甘油或 80% 蔗糖中孵育过夜，以脱水并更好地保存组织。</li>
		<li>将单个组织块置于载玻片上，去除多余的脱水缓冲液。加入封片剂覆盖组织，加盖盖玻片，并轻轻按压使组织平整固定。</li>
		<li>进行共聚焦显微镜图像采集。对于整体乳腺组织，使用 40X、数值孔径 N.A. = 1.3 的油镜进行成像。以 1,024 x 1,024 的光学切片分辨率和 1.0 - 1.2 µm 的层间距，采集 Z 轴堆栈的拼接图像。 
		注意：为准确捕获荧光信号，滤光分光镜应设置为三重二向色镜（TD）488/553/638，光电倍增管（PMT）增益设为 600-800。应使用以下激发/发射光源：mGFP，激发/发射最大值为 488/509 nm；mTomato，激发/发射最大值为 532/588 nm；Alexa-647，激发/发射最大值为 594/665 nm；DAPI，激发/发射最大值为 350/470 nm。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 利用基因修饰小鼠模型进行谱系示踪
<ol>
	<li>检测 Procr+ 使用小鼠模型的血管内皮细胞。
	<ol>
		<li>使用 ProcrCreERT2-IRES-tdTomato/+ （以下简称 ProcrCreERT2基因敲入小鼠品系 
		注意：在此小鼠模型中，一个 CreERT2-IRES-tdTomato 盒式结构10 插入到第一个ATG密码子之后 Procr11.
		<ol>
			<li>交叉 ProcrCreERT2 带有以下特征的小鼠 Rosa26mTmTomato-mGFP （称为 R26mTmG) 报告基因小鼠品系以示踪内源性Procr+内皮细胞的命运 体内11鉴定所有标记的内源性 Procr+ 表达GFP的ECs及其后代。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>给予他莫昔芬溶液11 （将10 mg他莫昔芬溶于1 mL花生油加10%乙醇中，配制成10 mg/mL的储存液），在青春期（5周龄）以4 mg/25 g体重的剂量腹腔注射，以示踪Procr+肠上皮细胞的发育命运。</li>
		<li>通过第3步中概述的制备步骤，对标记细胞进行整体免疫染色，分析其克隆形成效率。分别在短期（2天）和长期（长达10个月）处理后，获取经处理小鼠的乳腺脂肪垫。参见 图3.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Thomas, E. D., Lochte, H. L., Lu, W. C., Ferrebee, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravenous+infusion+of+bone+marrow+in+patients+receiving+radiation+and+chemotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Intravenous infusion of bone marrow in patients receiving radiation and chemotherapy.</a> N Engl J Med. 257 (11), 491-496 (1957).</li>
<li>Chao, M. P., Seita, J., Weissman, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+a+normal+hematopoietic+and+leukemia+stem+cell+hierarchy%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Symp+Quant+Biol%22%5BJournal%5D)">Establishment of a normal hematopoietic and leukemia stem cell hierarchy.</a> Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 73, 439-449 (2008).</li>
<li>Bompais, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+endothelial+cells+derived+from+circulating+progenitors+display+specific+functional+properties+compared+with+mature+vessel+wall+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Human endothelial cells derived from circulating progenitors display specific functional properties compared with mature vessel wall endothelial cells.</a> Blood. 103 (7), 2577-2584 (2004).</li>
<li>Fang, S., Wei, J., Pentinmikko, N., Leinonen, H., Salven, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+functional+blood+vessels+from+a+single+c-kit%2B+adult+vascular+endothelial+stem+cell%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Generation of functional blood vessels from a single c-kit+ adult vascular endothelial stem cell.</a> PLoS Biol. 10 (10), e1001407(2012).</li>
<li>Naito, H., Kidoya, H., Sakimoto, S., Wakabayashi, T., Takakura, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+a+resident+vascular+stem%2Fprogenitor+cell+population+in+preexisting+blood+vessels%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of a resident vascular stem/progenitor cell population in preexisting blood vessels.</a> EMBO J. 31 (4), 842-855 (2012).</li>
<li>Yoder, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Redefining+endothelial+progenitor+cells+via+clonal+analysis+and+hematopoietic+stem%2Fprogenitor+cell+principals%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Redefining endothelial progenitor cells via clonal analysis and hematopoietic stem/progenitor cell principals.</a> Blood. 109 (5), 1801-1809 (2007).</li>
<li>Snippert, H. J., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+adult+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Embo+Rep%22%5BJournal%5D)">Tracking adult stem cells.</a> Embo Rep. 12 (2), 113-122 (2011).</li>
<li>Yu, Q. C., Song, W., Wang, D., Zeng, Y. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+blood+vascular+endothelial+stem+cells+by+the+expression+of+protein+C+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Identification of blood vascular endothelial stem cells by the expression of protein C receptor.</a> Cell Res. 26 (10), 1079-1098 (2016).</li>
<li>Rios, A. C., Fu, N. Y., Lindeman, G. J., Visvader, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+identification+of+bipotent+stem+cells+in+the+mammary+gland%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">In situ identification of bipotent stem cells in the mammary gland.</a> Nature. 506, 322-327 (2014).</li>
<li>Barker, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+stem+cells+in+small+intestine+and+colon+by+marker+gene+Lgr5%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Identification of stem cells in small intestine and colon by marker gene Lgr5.</a> Nature. 449, 1003-1007 (2007).</li>
<li>Wang, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+multipotent+mammary+stemcells+by+protein+C+receptor+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Identification of multipotent mammary stemcells by protein C receptor expression.</a> Nature. 517, 81-U201 (2015).</li>
<li>Stahl, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Mouse+Retina+as+an+Angiogenesis+Model%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophth+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">The Mouse Retina as an Angiogenesis Model.</a> Invest Ophth Vis Sci. 51 (6), 2813-2826 (2010).</li>
<li>Mammoto, T., Mammoto, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Implantation+of+Fibrin+Gel+on+Mouse+Lung+to+Study+Lung-specific+Angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Implantation of Fibrin Gel on Mouse Lung to Study Lung-specific Angiogenesis.</a> J. Vis. Exp. (94), e52012(2014).</li>
<li>Snippert, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+crypt+homeostasis+results+from+neutral+competition+between+symmetrically+dividing+Lgr5+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Intestinal crypt homeostasis results from neutral competition between symmetrically dividing Lgr5 stem cells.</a> Cell. 143 (1), 134-144 (2010).</li>
<li>Soriano, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generalized+lacZ+expression+with+the+ROSA26+Cre+reporter+strain%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Generalized lacZ expression with the ROSA26 Cre reporter strain.</a> Nat Genet. 21 (1), 70-71 (1999).</li>
<li>Barker, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lgr5%28%2Bve%29+stem+cells+drive+self-renewal+in+the+stomach+and+build+long-lived+gastric+units+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Lgr5(+ve) stem cells drive self-renewal in the stomach and build long-lived gastric units in vitro.</a> Cell Stem Cell. 6 (1), 25-36 (2010).</li>
<li>Solar, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pancreatic+exocrine+duct+cells+give+rise+to+insulin-producing+beta+cells+during+embryogenesis+but+not+after+birth%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Pancreatic exocrine duct cells give rise to insulin-producing beta cells during embryogenesis but not after birth.</a> Dev Cell. 17 (6), 849-860 (2009).</li>
</ol>

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

血管生成实验是研究血管动态的良好实验方法。小鼠视网膜血管系统在出生后发育，已被证实是研究血管生成的一个理想模型。12尽管视网膜血管床相对易于接近，但对其进行实际操作却相当困难。迄今为止，已有文献中描述得最为详尽的 体内 移植研究中常用的检测方法是基质胶栓法，该方法将细胞包裹于基底膜基质团块内，并通过手术将其植入或注射到受体小鼠侧腹部皮下。该血管生成检测方法可有效评估包埋细胞的再生潜能及成血管能力。然而，由于植入的基质栓在体内形成相对隔离的微环境，无法为细胞提供理想的生理生态位。近期，研究人员还开发了一种新的肺部血管生成模型，即将纤维蛋白胶贴片应用于小鼠肺表面特定部位13然而，该操作还存在另一个风险，因为该技术需侵入性地在小鼠胸腔内进行，因此难以在更广泛的检测环境中应用。
在本研究所述的血管生成实验中，将少量细胞混合物移植至乳腺脂肪垫内。乳腺脂肪垫在青春期可提供空间、基质以及丰富的促血管生成刺激，使新生血管能够顺应并整合到正在重塑的宿主血管系统中，从而实现进一步的功能评估...

在发育和稳态过程中，血管的生长与重塑始终与器官的生长和修复相协调。血管生成是指从已有的血管中形成新血管的过程，被认为是介导这些动态血管变化的主要机制。每条血管内部均由一层内皮细胞（ECs）衬覆，这些细胞似乎是血管结构的基础。长期以来，内皮细胞池在稳态过程中如何得到补充的机制尚不明确，关于血管更新是源于成熟内皮细胞的增殖，还是来源于血管干细胞/前体细胞活动的贡献，学界一直存在争议。由于缺乏直接的生理学证据，血管内皮干细胞（VESCs）的存在及其细胞身份也一直存在争议。
验证干细胞行为最常用的方法之一是将待测干细胞移植到受体小鼠体内。该方法用于评估候选干细胞的干性潜能 体内 移植最初被应用于骨髓干细胞的研究1，这有助于造血系统层级特征的建立2在内皮领域，基底膜基质（例如， 皮下植入侧腹皮肤下的 matrigel 小栓已成标准 体内 用于评估移植内皮细胞血管形成能力的血管生成实验。多种实验方法，包括三维培养系统中的集落形成和移植实验，提示存在潜在的内皮细胞前体细胞/血管壁干细胞（VESC）群体3,4,5,6然而，由于嵌入基底膜基质中的内皮细胞与周围组织相对隔离，这无法为充分探索移植细胞的血管生成潜能提供最佳的微环境。因此，在基质塞内形成的血管主要呈毛细血管样结构，且功能上难以进行测量。
乳腺在出生后发育，其最显著的生长发生在青春期和妊娠期。在青春期阶段，乳腺上皮迅速扩张，占据整个乳腺脂肪垫，同时伴随周围血管结构的有效重塑。因此，乳腺为研究血管生成提供了极佳的模型。它为生长中的乳腺上皮提供了空间、基质以及丰富的促血管生成刺激，因而成为评估外源性细胞血管生成潜能的理想移植部位。此外，乳腺脂肪垫允许形成的外源性血管与宿主循环系统整合，从而实现进一步的功能评估，相较于皮下移植具有明显优势。
尽管 体外 培养和移植实验是研究细胞群体再生特性的有效方法。已知此类实验可能会诱导细胞可塑性，因为细胞被从其天然生境中分离，当细胞脱离其生理微环境时，可能发生改变。7因此，获得直接 体内 细胞命运的证据是推动当前对内皮细胞群体行为认知的关键方法。
遗传谱系示踪即，体内 谱系示踪）对于鉴定血管内皮干细胞（VESCs）及其在机体系统中的特性研究至关重要，因为它能够揭示 体内 在生理环境中的干细胞行为，以及真正的干性特征得以评估。谱系示踪提供了长期持续存在的直接证据（即， 自我更新）能力以及生成来源组织各类细胞类型的能力（即， 分化潜能
本方案描述了一种新型的乳腺脂肪垫移植技术以及谱系示踪方法，用于观察血管内皮干细胞（VESCs）的血管生成能力。这些技术克服了现有检测方法的局限性，为更优地评估VESCs的干细胞特性提供了新途径。这些方法是高效的工具，可用于评估内皮细胞群体的行为和成血管特性，以及确定在病理环境下血管细胞潜能的变化。

<table><tbody><tr><td>0.05% 胰蛋白酶-乙二胺四乙酸 (EDTA) (1x)</td><td>Gibco (Life Technologies)</td><td>25300-062</td><td>0.05% 胰蛋白酶</td></tr><tr><td>0.22 &amp;micro;m 滤器单元</td><td>Merck Millipore Ltd.</td><td>SLGP033RB</td><td>0.22 &amp;micro;m 滤器</td></tr><tr><td>2-甲基-2-丁醇，试剂级 Plus</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>24, 048-6</td><td>叔戊醇</td></tr><tr><td>222, 三溴乙醇</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T48402-25g</td><td>222, 三溴乙醇</td></tr><tr><td>4',6-二脒基-2-苯基吲哚 (DAPI)</td><td>Invitrogen</td><td>D1306</td><td>DAPI</td></tr><tr><td>70 &amp;micro;m 细胞筛</td><td>BD FAL</td><td>352350</td><td>70 &amp;micro;m 细胞筛</td></tr><tr><td>黏附显微镜载玻片</td><td>CITOGLAS</td><td>188105</td><td>玻璃载片</td></tr><tr><td>抗小鼠 CD105 APC</td><td>eBioscience</td><td>17-1051-82, 克隆号 MJ7/18</td><td>用于流式细胞术分析，使用浓度为 1 &amp;micro;g/mL</td></tr><tr><td>抗小鼠 CD201 生物素标记</td><td>eBioscience</td><td>13-2012-82</td><td>用于流式细胞术分析，使用浓度为 2.5 &amp;micro;g/mL</td></tr><tr><td>抗小鼠 CD31 PE-氰蓝 7</td><td>eBioscience</td><td>25-0311-82, 克隆号 390</td><td>用于流式细胞术分析，使用浓度为 1 &amp;micro;g/mL</td></tr><tr><td>BD FACSJazz 细胞分选仪</td><td>BD Biosciences</td><td>655489</td><td>FACS</td></tr><tr><td>牛血清白蛋白</td><td>Sigma</td><td>100190332</td><td>BSA</td></tr><tr><td>离心机</td><td>Eppendorf</td><td>5810R</td><td>离心机</td></tr><tr><td>III 型胶原酶</td><td>Worthington-Biochem</td><td>#LS004183</td><td>胶原酶 III</td></tr><tr><td>共聚焦显微镜</td><td>Leica</td><td>sp8</td><td>共聚焦</td></tr><tr><td>牛胰脱氧核糖核酸酶 I</td><td>Sigma</td><td>D2463-5VL</td><td>Dnase I</td></tr><tr><td>驴抗大鼠 Cy3</td><td>Jackson ImmunResearch</td><td>712-165-150</td><td>二抗，使用浓度为 0.5 &amp;micro;g/mL</td></tr><tr><td>Dumont 镊子</td><td>WPI</td><td>500342</td><td>镊子</td></tr><tr><td>Dumont 镊子 - 微钝头</td><td>FST</td><td>11253-20</td><td>镊子</td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Hyclone</td><td>SH30396.03</td><td>FBS</td></tr><tr><td>FITC 标记的小鼠 CD3/Gr1/CD11b/CD45R(B220)/Ter-119 抗体混合物</td><td>BioLegend</td><td>78022</td><td>流式细胞术分析用血液谱系抗体混合物，每项检测使用 25 &amp;micro;L</td></tr><tr><td>甘油</td><td>Sigma</td><td>G6279</td><td>甘油</td></tr><tr><td>伊格尔改良杜尔贝科培养基 (IMDM)</td><td>Gibco (Life Technologies)</td><td>12440-053</td><td>IMDM</td></tr><tr><td>来自扁豆状吉姆萨菌的异凝集素 GS-IB4，Alexa Fluor&amp;nbsp; 647 标记</td><td>Invitrogen</td><td>Z32450</td><td>异凝集素-647</td></tr><tr><td>Matrigel&amp;nbsp; 基质（生长因子减少型）</td><td>BD</td><td>356231</td><td>Matrigel</td></tr><tr><td>小鼠品系 (Actin-GFP)</td><td>Jax Laboratories</td><td>3773</td><td>Actin-GFP</td></tr><tr><td>小鼠品系 (C57BL/6)</td><td>SLAC</td><td>C57BL/6</td><td>C57BL/6</td></tr><tr><td>小鼠品系&amp;nbsp; (BALB/c nude)</td><td>SLAC</td><td>BALB/c nude</td><td>裸鼠</td></tr><tr><td>多聚甲醛</td><td>Sigma</td><td>P6148</td><td>PFA</td></tr><tr><td>青霉素-链霉素</td><td>Gibco (Life Technologies)</td><td>5140-122</td><td>青/链霉素 (Pen/Strep)</td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液 (pH 7.2) 1x</td><td>Gibco (Life Technologies)</td><td>c20012500BT</td><td>PBS</td></tr><tr><td>PRIM1640</td><td>Gibco (Life Technologies)</td><td>c11875500CP</td><td>PRIM1640</td></tr><tr><td>ProLong Gold 抗荧光淬灭封片剂</td><td>Life Technologies</td><td>P36934</td><td>封片介质</td></tr><tr><td>大鼠抗 CD144 抗体</td><td>BD Biosciences</td><td>550548</td><td>用于整体染色分析，抗 VE-钙黏蛋白 / Cdh5 抗体，用于内皮细胞紧密连接，使用浓度为 2.5 &amp;micro;g/mL</td></tr><tr><td>大鼠抗 CD31-生物素标记抗体</td><td>BD Biosciences</td><td>553371</td><td>用于整体染色分析，抗 CD31/PECAM1 抗体，用于内皮细胞表面黏附分子，使用浓度为 10 &amp;micro;g/mL</td></tr><tr><td>红细胞裂解缓冲液</td><td>Sigma</td><td>R7767-100ML</td><td>红细胞裂解缓冲液</td></tr><tr><td>直头/锐-钝头/10 cm</td><td>FST</td><td>14028-10</td><td>精细剪刀</td></tr><tr><td>链霉亲和素 eFluor 450</td><td>eBioscience</td><td>48-4317-82</td><td>用于流式细胞术分析，使用浓度为 0.5 &amp;micro;g/mL</td></tr><tr><td>他莫昔芬</td><td>Sigma</td><td>101551374</td><td>TAM</td></tr><tr><td>吐温 X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787-250ML</td><td>TritonX</td></tr><tr><td>蜡涂层编织丝线（美国标准 5-0 号 (1 公制)，18 英寸 (45 cm)，黑色，C-1 针）</td><td>COVIDIEN</td><td>S1173</td><td>缝合线&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>无菌一次性手术刀片</td><td>Swann Morton</td><td>#10</td><td>手术刀</td></tr><tr><td>聚维酮碘</td><td>Yifeng Medical</td><td>20160101</td><td>消毒液</td></tr></tbody></table>

一种新型乳腺脂肪垫移植技术用于可视化血管内皮干细胞的血管生成

A Novel Mammary Fat Pad Transplantation Technique to Visualize the Vessel Generation of Vascular Endothelial Stem Cells

内皮细胞（ECs）是血管结构的基本组成单元，可介导血管的生长与重塑，以确保血管的正常发育和稳态维持。然而，由于缺乏有效的工具来获取并直接评估其行为，关于内皮细胞谱系层级的研究仍不明确。 体内为解决这一不足，已开发出一种利用乳腺脂肪垫研究血管生成的新组织模型。乳腺主要在出生后的发育阶段（包括青春期和妊娠期）中发育，此过程中旺盛的上皮细胞增殖伴随着广泛的血管重塑。乳腺脂肪垫为生长中的乳腺上皮提供空间、基质以及丰富的促血管生成刺激信号。此外，乳腺脂肪垫位于腹膜腔外，使其成为评估外源性细胞血管生成潜能的易于操作的移植位点。本研究还描述了一种高效的示踪方法，利用荧光报告小鼠特异性地标记目标血管内皮干细胞（VESCs）群体。 体内该谱系示踪方法结合后续的组织全 mount 显微成像，可实现对靶向细胞及其子代细胞的直接可视化，从而定量分析其增殖能力，并进行分化命运图谱的绘制。利用这些方法，近期已在多种血管系统中鉴定出一群表达双潜能蛋白 C 受体（Procr）的血管内皮干细胞（VESCs）。Procr+ VESCs 能够生成新的内皮细胞和周细胞，在发育、稳态维持以及损伤修复过程中积极促进血管生成。总体而言，本文描述了一种新的乳腺脂肪垫移植方法 体内 可用于评估VESC干细胞特性的谱系示踪技术

乳腺血管内皮细胞的分离：
为了在后续移植实验中分离内皮细胞群体，采集成熟（8周龄）未交配小鼠的乳腺作为供体材料。采用基于抗体的细胞分选技术分离内皮细胞。图中显示了8周龄C57BL/6小鼠乳腺内皮细胞中VESC群体的代表性流式细胞术分析结果。 图1 （图改编自 Yu 等8，经许可。
乳腺脂肪垫移植：
乳腺脂肪垫为研究血管生成提供了理想位点。经FACS分选分离后，Procr+ ECs 与 0.5% 基底膜基质和 0.1% 台盼蓝指示剂混合后，移植至 3 周龄 SCID 受体小鼠的空脂...

本研究展示了一种评估血管内皮干细胞（VESCs）增殖、分化及成血管潜能的新方法，通过乳腺脂肪垫移植后进行整体组织制备，以实现显微观察。采用谱系示踪策略以研究VESCs的行为 体内 也进行了展示。

内皮细胞（ECs）是血管结构的基本组成单元，可介导血管的生长与重塑，以确保适当的……

本实验的总体目标是通过乳腺脂肪垫移植技术，结合整体组织制备方法进行显微观察，评估血管内皮干细胞的增殖能力、分化潜能以及血管生成潜力。该方法为在体内最优评估血管内皮干细胞的干性特征提供了新途径。该技术的主要优势在于，在青春期阶段，乳腺组织可为新生血管的形成与整合提供理想的促血管生成环境。这使得能够对移植的内皮细胞进行功能评估。该技术的意义不仅限于内皮功能的检测，还可延伸至评估促血管生成因子对局部血管重塑的影响。这些方法是可应用于多个领域的高效工具，包括肿瘤微环境中内皮细胞群体的研究以及细胞潜能变化的分析。本实验操作将由本实验室的研究生 Wenqian Song 演示。根据文本方案，制备组织消化用培养基，并处死8周龄的Actin-GFP成熟 virgin 报告基因小鼠后，使用手术刀解剖出第四对腹股沟乳腺组织：首先在下腹部中线处做一垂直皮肤切口。称取剪碎的组织，置于50毫升离心管中。按每10毫升消化基础培养基加入300单位III型胶原酶的比例配制消化缓冲液，混匀后加入剪碎的组织中。将50毫升离心管水平放置于摇床上，设置转速为100 rpm，温度为37摄氏度。振荡消化乳腺组织2小时。消化结束后，加入预热的无菌PBS至50毫升离心管中，并倒置混匀。然后以200 × g离心试管5分钟。弃去上清液，并轻弹试管底部以松解细胞沉淀。随后加入3 mL红细胞裂解缓冲液，在室温下孵育5分钟，以去除红细胞。加入10毫升无菌PBS，倒置混匀。离心组织并弃去上清液后，加入3毫升预热的0.05%胰蛋白酶，37摄氏度孵育5分钟，以进一步消化残留组织。接着，加入3毫升预热的IMDM，然后加入100微升DNase I溶液。将试管在37摄氏度下孵育，以降解DNA细丝。然后将组织混合物通过70微米细胞滤筛，以获得细胞悬液。使用2毫升PBS加5%FBS冲洗滤筛两次，以中和酶消化作用。将细胞混合物在200 × g离心5分钟。弃去上清液，并将细胞沉淀重悬于1毫升含5% FBS的PBS中进行抗体染色。抗体染色后，用含5% FBS的PBS补足细胞悬液，然后在200 × g离心5分钟。弃去上清液后，用1 mL PBS加5% FBS重悬细胞。通过40 µm细胞滤筛过滤细胞悬液。然后根据文本方案，通过流式细胞术分选分离蛋白C受体阳性血管内皮干细胞。用10毫升含5% FBS的PBS补充分选后的FASC细胞，然后在200 × g下离心5分钟，使细胞沉淀至管底。小心吸除上清液后，使用血细胞计数板对细胞进行计数，并将细胞沉淀重悬于基底膜基质混合物中，调整至每15微升含15,000个细胞。在1.5毫升微量离心管中对分选并计数后的细胞进行连续稀释，以达到所需的输入浓度，确保最终注射体积不超过15微升。然后向每支试管中加入0.1%台盼蓝，以在移植过程中更好地观察内容物。充分吹打混匀，并将试管置于冰上保存，直至使用。要将原代内皮细胞或ECs移植到乳腺脂肪垫中，需将每只小鼠仰卧放置，使其背部朝向手术台。然后使用胶带固定四肢。将棉签浸入含碘消毒液中，彻底擦拭小鼠整个腹部区域，以在手术前对皮肤表面进行消毒。接下来，使用镊子夹住并提起小鼠的腹部皮肤。然后用手术刀做一个长约1厘米的垂直小切口。再分别向后肢方向做两个长约0.5至1厘米的切口，形成倒Y形切口。使用镊子和棉签轻轻分离腹部皮肤，并将皮肤向侧方固定，以暴露腹股沟乳腺。然后将小鼠置于体视显微镜下，调节放大倍数至2倍。将27号1/2英寸针头置于冰上预冷。在预润注射器后，用移液器吸取15 µL基底膜基质溶液，滴加到微量离心管的管盖上，然后将全部液体吸入已预润的注射器中。为确保完全注入细胞内容物，在预润及吸取细胞后，务必确保针头内无气泡残留。使用精细镊子夹住腹股沟淋巴结前方的乳腺脂肪垫，并轻轻提起，以便于注射。然后将注射器针头约四分之一长度轻柔地插入脂肪垫中。松开夹持脂肪垫的镊子，改用镊子夹住并稳定注射器针头。缓慢注射溶液，以防止液体泄漏。然后将针头保持原位数秒钟，以确保细胞混合物凝固，从而在拔出针头时尽量减少渗漏。使用5-0可吸收肠线缝合皮肤瓣，并以外科医生打结法进行缝合，每个结间距约0.3厘米。为收获组织，通过尾静脉注射Isolectin 647染料（溶于PBS）标记受体的全身循环系统。静置 5 至 10 分钟。根据文中实验方案处死小鼠后，使用手术剪分离出最初注射细胞的乳腺组织区域。在直径 6 厘米的培养皿中，使用手术刀片将组织切成大约 3 至 4 立方毫米的组织块。随后，为了消化组织块，将其转移至含有10毫升预热消化液（添加胶原酶III）的15毫升离心管中。将该15毫升离心管水平放置于摇床上，在37摄氏度、100转/分钟的条件下孵育约1小时，以松解组织结构并去除多余的脂肪细胞组织。接着，使用PBS在室温下洗涤组织10分钟。随后，为保留荧光，将组织样本小心放入一个盛有半满4%PFA溶液的六厘米培养皿中，进行整体组织固定。将培养皿置于摇床上，在室温下轻轻振荡组织30分钟。按照文本方案清洗组织并用稀释的一抗孵育后，去除染色液，并用洗涤缓冲液清洗组织三次，每次10分钟。然后将组织在室温下于摇床上用二抗和DAPI孵育四小时，或在4摄氏度下孵育过夜。按照文本方案洗涤样本后，将组织转移至80%甘油或80%蔗糖中过夜，以脱水并实现更好的保存。将组织封片，并根据文本方案进行共聚焦显微镜观察。此处展示的是使用流式细胞术（FACS）进行细胞分离的代表性结果。通过排除血液谱系细胞，并利用CD31阳性、CD105阳性标记物定义内皮细胞，随后富集蛋白C受体阳性的内皮干细胞。该共聚焦图像显示的是移植部位受体小鼠乳腺脂肪垫的组织情况。由移植的蛋白C受体阳性内皮细胞形成的血管已整合并贡献于宿主乳腺血管系统。本图展示了受体小鼠的乳腺血管系统。通过对受体小鼠静脉注射异凝集素，结果显示蛋白C受体阳性内皮细胞形成了具有管腔的功能性血管。一旦掌握，若操作得当，移植手术可在五分钟内完成。进行该操作时，务必记得术后密切观察受体动物的状态。若发现应激或感染迹象，应及时采取适当的护理措施。按照该操作步骤，还可进行其他方法，如细胞谱系示踪，以在体内研究靶向细胞在各种生物过程中的行为。该技术建立后，为血管生物学领域的研究人员探索内皮细胞亚群在生理和病理条件下的潜能铺平了道路。观看本视频后，您应能够充分理解如何利用乳腺脂肪垫移植和组织整体装片制备技术来研究内皮细胞群体的成血管能力，并评估所形成血管的功能特性。

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科研

JoVE Journal

Developmental Biology

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小鼠颈动脉组织工程血管移植物植入术 通过 袖带技术

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了解乳腺脂肪垫移植技术用于评估血管内皮干细胞的血管生成潜能。该方法结合全组织包埋制备与显微观察，为研究血管生物学和再生医学提供了重要的体内功能评价工具。

一种新型乳腺脂肪垫移植技术用于可视化血管内皮干细胞的血管生成

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